KR101458057B1 - 종자 침출액의 닌하이드린 발색을 이용한 종자 발아율 예측방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종자 침출액의 닌하이드린 발색을 이용하여 종자발아율을 예측하는 방법에 관한 것으로, 육안으로 또는 기계를 이용한 흡광도 측정으로 종자를 파괴하지 않고 단시간에 정확하게 종자의 발아력을 예측할 수 있는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

종자 침출액의 닌하이드린 발색을 이용한 종자 발아율 예측방법{A method for germinabi1ity prediction of seed using ninhydrin color developed with seed leachate}

본 발명은 종자 침출액을 이용하여 닌하이드린 발색 반응을 확인함으로써 종자 발아율을 예측하는 신규한 방법에 관한 것이다.

모든 종자는 생리적인 품질이 100% 균일하지 아니하고 또한 종자를 저장하는 동안 퇴화되기 때문에 발아율을 100%로 유지할 수가 없다. 종자의 생리적인 품질, 즉 발아하는 종자와 불발아종자，그리고 비정상적인 유묘를 생산하는 비정상발아종자 등으로 정확히 예측할 수 있다면 종자산업에서 종자상품을 평가하거나 농업에서도 종자를 파종하여 발아검사를 실시하지 않고 사전에 종자의 상태를 알 수 있기 때문에 매우 유용할 것이다.

종래의 종자활력 검정은 세계적으로 테트라졸리움 시험(tetrazolium test)이 보편적으로 사용되고 있는데 이는 종자세포의 효소활성을 측정하여 세포가 살아 있는지 죽어 있는지를 검정하는 것으로서 종자를 파괴하여 테트라졸리움으로 발색하는 방법이다. 이 방법은 종자를 파괴한다는 점과 종자의 발색된 색을 육안으로 감정하는데 많은 경험이 필요하고 정확성이 낮은 문제점이 있다. 또한 종자에서 누출되는 전하물질을 검정하여 종자의 활력을 검정하는 방법으로서 전기전도도 검정법이 있는데 종자를 한 개 단위로 측정하지 아니하고 한 번에 많은 종자를 침지하여 누출된 전하물질의 전기전도도를 측정하는 방법으로서 종자의 상대적인 품질을 비교하는데 사용되는 방법이다. 그리고 십자화과 채소종자에서 형광물질인 시나핀(sinapine)이나 아미노산이 누출되는 것을 이용하여 종자에 수분을 흡수시키고 셀롤로스(cellulose)로 코팅하여 건조함으로써 셀룰로스 층에 시나핀의 형광색이나 코팅 층에 흡착된 아미노산을 발색하여 불발아종자가 발색되는 것을 육안으로 검정하는 방법이 있다. 이러한 방법은 비파괴적인 방법으로서 단일종자 단위로 평가할 수 있지만 과정이 복잡하고 기계적으로 정확히 검정하는 데에는 어려움이 있다.

닌하이드린(ninhydrin)은 아미노산이나 단백질을 만나면 닌하이드린 반응이 일어나 무색이 보라색으로 변하므로 아미노산을 분석하는 정성분석에 많이 이용되어 왔다.

종자는 퇴화가 진행됨에 따라 세포막이 파괴되어 수분을 흡수할 때 종자 내의 탄수화물, 아미노산, 단백질 및 무기질이 파괴된 세포막을 통하여 밖으로 누출된다. 종자의 퇴화정도에 따라 세포막의 파괴정도도 비례하며 따라서 종자에서 누출되는 성분의 양도 비례하는 것이 보통이다. 그러나 정상적인 종자는 세포막이 건전하거나 파괴가 덜해 수분을 흡수하여도 종자에서 누출물이 나오지 않거나 아주 미세하게 누출한다.

따라서, 본 발명의 목적은 종자 침출액에 닌하이드린 시약을 처리하는 발색방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 종자 침출액에 닌하이드린 발색을 이용하여 정확한 종자 발아력을 신속하고 간편하게 측정하고 예측하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 증류수가 담긴 96웰플레이트에 종자를 한 개씩 침지하여 종자 침출액을 준비하는 단계와; 상기 종자 침출액에 닌하이드린 시약을 처리하는 단계와; 닌하이드린 발색을 이용한 상기 침출액의 종자 발아율을 육안으로 판별하는 단계와; 종자 발아율을 닌하이드린 발색의 흡광도 측정을 통한 기계적인 방법으로 조사하는 단계를 통하여 달성하였다.

본 발명은 종자 침출액의 닌하이드린 발색을 이용하여 종자의 활력을 육안으로 측정할 수 있을 뿐만 아니라, 닌하이드린 발색 정도를 흡광도로 측정하여 종자 발아 능력의 확률을 통계적으로 분석함으로써 정확하게 종자의 발아력을 예측할 수 있는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 배추종자 침출액을 닌하이드린 시약으로 발색한 모양과 발색 정도별 4가지 분류를 나타낸 도이다.
도 2는 육안으로 관찰한 배추종자 침출액의 닌하이드린 발색 정도와 종자 발아율을 나타낸 그래프이다.
도 3은 닌하이드린에 의하여 발색된 배추종자 침출액의 흡광도와 종자 발아율을 나타낸 그래프이다.
도 4는 배추종자 침출액의 닌하이드린 발색을 스캐너로 스캔한 이미지이다.
이하, 본 발명의 구체적인 내용을 바람직한 실시예와 실험예를 통하여 상세히 설명한다.

본 발명의 바람직한 종자 유형은 무 및 배추군으로 표현되는 종을 포함한다.

본 발명은 96웰플레이트에 배추 및 무종자를 한 개씩 넣고 배추종자에는 증류수 l00 uL, 무 종자에는 증류수 150 uL를 넣어 침지한다. 종자의 크기에 따라 증류수를 종자가 충분히 잠길 만큼 넣는 것이 필요하다. 침지시간은 종자가 수분을 완전히 흡수할 수 있는 시간으로 하는 것이 중요하며 배추종자나 무종자는 4시간 침지가 적당하다.

닌하이드린 시약은 에칠렌글라이콜(ethylene glycol, OCI Co., Korea):4N 아세테이트 완충액(sodium acetate buffer pH 5.5, Kanto chemical Co., Japan):스테너스클로라이드(SnCl₂，Junsei chemical Co., Japan) = 30:10:1 용액에 2%의 닌하이드린(ninhydrin)을 용해하여 제조하였다. 배추 및 무종자의 경우 종자 한 개에 100 uL의 닌하이드린 시약이 필요하므로 종자 수에 따라 시약의 양을 조제한다. 닌하이드린 농도는 종자의 크기나 종류에 따라 조절해서 준비해야한다. 일반적으로, 종자활력 측정용 닌하이드린 농도는 0.5% 내지 2.0%이며, 무나 배추종자는 1% 내지 2%의 농도로 사용한다.

닌하이드린의 발색 정도는 온도, 시간, 종자의 종류 및 크기에 따라 다르므로 발색을 잘 분별할 수 있는 조건을 찾는 것이 중요하다. 일반적으로, 종자침출액에 닌하이드린 시약을 처리한 96웰플레이트는 80℃ 내지 100℃의 항온기나 수조에 넣어 색 변화를 유도하며，바람직하게는 80℃에서는 30분간，100℃에서는 10분간 유지한다. 배추나 무종자는 80℃에서 30분간 발색이 가장 바람직하다.

종자활력 측정 방법 중 멀티플레이트 리더를 이용하여 흡광도를 측정하거나 발색된 이미지의 색 강도를 측정한 후 기계적 장치를 이용하여 보다 정밀하게 분석할 수 있다. 상기‘기계적 장치’라 함은 분석용 프로그램이 내장된 컴퓨터 등의 장치를 의미한다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예와 실험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 배추종자 침출액의 닌하이드린 발색

퇴화정도가 다른 8품종의 배추종자를 본 발명의 공시재료로 사용하였다. 즉, 다이나믹(농우바이오，2002년산), 노랑봄(흥농, 1995년산), 수모60(몬산토，2010년산), 불암3호(흥농，1995년산), 샛노랑(농우바이오，1995년산), 새싹배추(농우바이오，2011년산), 종자봄(흥농, 1996년산), 황복여름(농우바이오，2003년산) 이었다.

각 품종별 배추종자를 l개의 96웰플레이트에 88개씩 담고 3반복(3개 플레이트) 총 264개를 담은 후 각 종자를 증류수 100 uL로 4시간 침지하였다. 침지 후 각 종자에 대하여 종자 침출액 50 uL를 취하여 닌하이드린 시약 100 uL와 혼합한 다음, 80℃의 건조기에서 30분간 방치한 결과 종자 퇴화 정도에 따라 도 1과 같이 발색되었다.

실험예 1 : 배추종자 침출액의 닌하이드린 발색을 이용한 육안 판별

도 1에 나타낸 닌하이드린 발색을 육안으로 판별하기 위해서 색의 강도 별로 4등분 즉, 무색，약한 색，중간색 및 강한 색으로 분류한 후 각 색의 범위에 있는 종자를 8품종 모두 계수하고 이를 파종하여 발아 조사한 후，각 색범위에 속한 종자를 정상발아, 비정상발아, 불발아로 구분하여 8품종에 대한 평균값을 도 2에 나타내었다.

실험결과 침출액의 발색이 무색에서 강한 색으로 갈수록 정상발아는 감소하고 불발아는 증가하였다. 따라서, 정상적인 종자일수록 세포막이 건전하여 아미노산이나 단백질 등의 세포 내용물이 누출되지 않는 반면, 퇴화한 불발아종자는 상기 세포 내용물이 많이 누출된다는 것을 나타내며, 이는 종자 발아와 밀접한 관계가 있음을 보여준다.

실험예 2 : 배추종자 침출액의 닌하이드린 발색의 흡광도 측정

상기 실시예 1에서 발색된 96웰플레이트(96 well clear polyethylene microplate)를 멀티플레이트 리더(multiplate reader, Opsys MR, Dynex Technology, Chantilly, VA, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정한 후 종자를 파종하여 발아 검사를 수행하였다.

더욱 상세하게는, 흡광도 측정은 멀티플레이트 리더기에 570 nm의 흡광도 필터를 장착하고 96웰플레이트를 리더기에 넣어 흡광도를 조사하였다. 한 개의 96웰플레이트 중 8개의 홀은 블랭크(blank)로써 종자를 넣지 않고 닌하이드린 시약만 넣고, 종자를 침지한 88개의 침출액 시료는 해당 흡광도를 컴퓨터의 해당 소프트웨어(Revelation Quick Link Software)에 의하여 한번에 읽어 흡광도에 따라 분류할 수 있었다.

배추종자의 각 품종 당 264개의 종자 침출액의 흡광도는 0.000 내지 3.500의 범위였다. 종자의 발아와 흡광도와의 관계를 규명하기 위해서 흡광도를 0.150 간격으로 구분하고 각 흡광도범위에 속하는 종자의 발아를 정상묘，비정상묘 및 불발아로 구분하여 조사한 결과를 도 3에 나타내었다. 즉, 0.150 이하의 낮은 흡광도에서는 정상묘의 비율이 가장 높았고, 0.901 이상의 높은 흡광도에서는 정상묘가 나타나지 않았다. 또한, 불발아종자는 흡광도 0.601 이상에서 급격히 증가하여 80% 이상이 불발아종자로 판명되었고 흡광도 1.500 이상에서는 거의 발아하지 않았다.

따라서, 닌하이드린 시약으로 발색된 종자 침출액의 흡광도는 종자 발아와 밀접한 관계가 있는 것으로 판단된다.

실험예 3 : 배추종자 침출액의 닌하이드린 발색정도에 의한 통계적인 종자 발아 예측방법

상기 실시예 1에서 발색된 종자 침출액을 무색，약한 색，중간색 및 강한 색으로 분류하고 각 발색 정도에 해당하는 종자의 발아 확율을 통계적으로 구하였다. 통계적 알고리즘은 로지스틱 회귀모형을 이용하였으며 무색，약한 색， 중간색 및 강한 색을 변수로 했을 때 각 발색정도별 구간에 위치한 종자 발아에 대한 로지스틱 회귀계수를 구하고 계수에 의하여 종자의 발아 확율을 구하였다.

조사결과 배추종자에서 각 발색범위별 로지스틱 회귀계수는 통계적으로 유의성이 매우 높았다. 로지스틱 회귀모형에서 구한 발색정도별 배추종자 발아 확율을 하기 [표 1]에 나타내었다.

즉, 발색정도가 강할수록 발아할 확율이 낮아짐을 나타내며 미지의 배추종자에 대하여 발색정도만 조사하면 발아율을 하기 수학식 1에 의하여 추정할 수 있다.

따라서, 미지의 배추종자에 대하여 발아율은 파종하지 않고도 수학식 1에 의하여 각 발색정도별 종자의 발아율을 발아 확률에 의하여 구하고, 조사한 총 종자개수로 나눈 값에 100을 곱하면 간단히 계산할 수 있다.

실험예 4 : 닌하이드린 발색의 흡광도 조사를 통한 통계적인 종자 발아 예측방법

상기 실험예 2에서 확인한 각 종자 침출액의 흡광도를 그 값이 낮은 순에서 높은 순으로 나열한 다음, 0.150 간격으로 범위를 나누어 각 범위 내에 속하는 종자에 대하여 발아 확율을 실험예 3과 같이 통계적으로 구하였다. 통계적 알고리즘은 동일하게 로지스틱 회귀모형을 이용하였으며 각 흡광도범위를 변수로 했을 때 11개의 변수가 되며, 각 흡광도범위별 구간에 위치한 종자 발아에 대한 로지스틱 회귀계수를 구하고 계수에 의한 종자의 발아 확율을 얻었다. 하기 [표 2]에 나타낸 바와 같이, 배추종자의 각 발색범위별 로지스틱 회귀계수는 통계적으로 유의성이 매우 높았다.

즉, 배추종자 침출액에 의한 닌하이드린 흡광도가 높을수록 배추종자가 발아할 확률이 낮아짐을 나타내므로, 미지의 배추종자에 대하여 흡광도만 조사하면 발아율을 하기 수학식 2에 의하여 추정할 수 있다.

따라서, 미지의 배추종자에 대한 발아율은 파종하지 않고도 수학식 2에 의하여 배추종자 침출액의 닌하이드린 발색 후 흡광도별 종자의 발아율을 발아 확률에 의하여 구한 뒤, 조사한 총 종자개수로 나눈 값에 100을 곱하면 간단히 계산할 수 있다. 또한 기계적으로 흡광도를 이용한 종자 발아율 추정은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 종자계수 등의 노력이 필요 없이 신속하게 발아율을 추정할 수 있는 잇점이 있다.

실험예 5 : 배추종자 침출액의 닌하이드린 발색의 이미지 분석

배추종자 침출액을 이용하여 도 1과 같이 닌하이드린으로 발색된 96웰플레이트를 디지털 사진기로 촬영(도 1)하거나 스캐너로 스캔(도 4)하여 이미지를 분석하였다. 상기 이미지를 컴퓨터 이미지 분석기(image analyzer)를 이용하여 색깔의 종류 및 그 강도를 분석하였고，컴퓨터 프로그램을 통하여 종자 발아와의 관계를 분석한 결과 실험예 1에서와 같은 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 이미지 분석은 스캔한 그림 또는 사진을 이미지분석용 소프트웨어(SigmaScan Pro 5.0, Systat Software, Inc. USA)를 이용하여 컴퓨터에서 프로그램 상에 불러온 후 이미지에 대한 색 강도(color intensity)를 수나 퍼센트로 바로 계산할 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 종자를 파괴하지 않고 단시간에 간단하게 종자의 활력을 측정할 수 있는 방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 종자산업 및 농생명산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (6)

1. 닌하이드린 시약을 처리하여 종자의 발아율을 예측하는 방법에 있어서,
   증류수가 담긴 96웰플레이트에 종자를 한개씩 침지하여 4시간 종자침출액을 준비하는 단계와; 상기 종자침출액에 닌하이드린 시약을 처리하는 단계와; 상기 시약 처리 후 96웰플레이트를 항온기나 수조에 넣어 80~100℃에서 10~30분간 유지하고 발색을 확인하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 퇴화종자의 발아율 예측방법.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 발색한 종자 침출액을 육안으로 분류함을 특징으로 하는 종자 발아율 예측방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 발색한 종자 침출액을 흡광도를 측정하여 분류함을 특징으로 하는 종자 발아율 예측방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 발색한 종자 침출액을 디지털 사진기 또는 스캐너 중의 어느 하나로 이미지화하여 컴퓨터로 분석함을 특징으로 하는 종자 발아율 예측방법.
   
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서, 상기 종자는 무 또는 배추종자임을 특징으로 하는 퇴화종자의 발아율 예측방법.

Images