CN102967543A

CN102967543A - 利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数的方法

Info

Publication number: CN102967543A
Application number: CN2012104291810A
Authority: CN
Inventors: 包建民; 李优鑫; 周正昌; 刘晓静
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2012-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2013-03-13

Abstract

本发明公开了一种利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数的方法，包括如下步骤：（1）配制受体液；（2）配制供体液；（3）将一端封口的中空纤维膜管浸入卵磷脂溶液中，取出；（4）将经步骤（3）处理过的中空纤维膜管的开口端与连接管相接；（5）将受体液通过连接管加入到处理过的中空纤维膜管内；（6）将装有受体液的中空纤维膜管浸入盛放有供体液的容器中，使受体液的液面低于供体液的液面；渗透0.5-5小时，从受体液中取样，测定受体液中药物浓度，并计算渗透系数；本发明装置简单，安装容易，实验准备快速；分析快速；效率高；采用先进的检测仪器配套可以实现高通量化测定药物渗透系数，适应了高通量药物筛选的需要；应用广泛。

Description

利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数的方法

技术领域

本发明涉及一种测定口服药物渗透系数的方法。

背景技术

药物筛选是现代药物开发流程中检测和获取具有特定生理活性化合物的一个步骤，通过规范化的实验手段从大量化合物或者新化合物中选择对某一特定作用靶点具有较高活性化合物的过程。随着组合化学的问世，候选化合物的合成速度大大加快，在研发早期阶段对候选化合物的吸收（absorption）、分布(distribution)、代谢(metabolism)、排泄(excretion)及毒性等性质进行高通量筛选，尽早对化合物做出综合评价，已成为目前创新药物研究的主导趋势，但这一阶段也面临所需测试化合物种类庞大、实验项目繁多，每个化合物供应量少的问题。为此，亟待微量化、自动化、高通量测试方法开发，使化合物理化性质的测试速度与组合化学的合成速度相匹配。

目前口服给药是最方便、最常用的临床给药方式，据统计，80%以上药物口服后是被小肠吸收进入血液，经全身循环分布到各组织器官而发挥疗效作用，所以药物能否被小肠有效吸收是口服药物筛选过程中首要考虑的因素。目前，评价口服药物吸收的实验方法主要有体外实验方法、体内实验方法和在体实验方法等。尽管体内实验和在体实验能更好地反映药物在体内的吸收过程，但这些方法有诸多不确定的变化因素，如动物种类及个体差异较大、手术操作复杂、药物使用量较大、实验周期较长、消耗人力和物力成本较大等，不适用于早期药物研发。体外实验方法主要有Caco-2细胞法和模拟人造膜渗透性测定法（Parallel ArtificialMembrane Permeability Assay，PAMPA）。Caco-2细胞具有和小肠上皮细胞相似的形态和功能，在标准培养条件下细胞能自动分化，形成紧密连接，表达多种刷状缘酶。但是该方法培养Caco-2细胞长达21天，且需要专业技术。近年来，PAMPA法作为一种较高通量的体外筛选方法被广泛使用，所用装置被称作“三明治”的装置，即借助一涂有卵磷脂的人造膜将测试空腔分为上下两层，上层为药物溶液（供体液）层，下层为接受液（受体液）层，通过测定渗透一定时间后供体液浓度和受体液浓度求得药物的渗透性系数，进而预测药物在体内的吸收情况，但是由于贴近膜的周围存在着非扰动层，尤其是在膜的下侧，非扰动层高达1900μm，而药物在人血管渗透存在的非扰动层厚度仅为30-100μm，因此PAMPA的测定结果与实际结果有一定差异；另外，PAMPA法需测定供体液和受体液浓度，整个平衡和分析时间较长、操作繁琐、配套的耗材价格昂贵。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种易于操作、步骤简单、快速、准确、能在线分析和高通量测定的利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数的方法，包括如下步骤：

（1）配制pH为7.4的溶质为磷酸盐缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为受体液，所述受体液中磷酸盐缓冲对的浓度为0.01-0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（2）配制pH为5-8的溶质为药物、磷酸盐缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为供体液，所述供体液中药物的浓度为10-1000μM，磷酸盐缓冲对的浓度为0.01-0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（3）将一端封口的中空纤维膜管浸入质量百分浓度为1%-20%的卵磷脂溶液中10-20分钟，取出，所述卵磷脂溶液的溶剂为亲脂性溶剂；

（4）将经步骤（3）处理过的中空纤维膜管的开口端与连接管相接；

（5）将5μL-50μL受体液通过连接管加入到所述处理过的中空纤维膜管内；

（6）将步骤（5）的所述装有受体液的中空纤维膜管浸入盛放有供体液的容器中，使受体液的液面低于供体液的液面；渗透时间t为0.5-5小时，从受体液中取样，测定受体液中药物浓度，并计算渗透系数；

渗透系数的计算方法为

Pe = - \frac{V_{a} * \ln (1 - \frac{C_{a}}{C_{o}})}{A * t}

其中Pe为渗透系数，V_a为受体液体积，C_a为t小时受体液中药物浓度，C₀为供体液中初始药物浓度，t为渗透时间，A为中空纤维膜管有效面积。

所述卵磷脂优选大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。

所述亲脂性溶剂为十二烷、橄榄油或辛醇。

所述中空纤维膜管的材质为聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯或聚碳酸纤维素。

所述中空纤维膜管的长度为10-100mm，内径为0.5-3mm，厚度为50-500μm，孔隙率为30%-85%，平均孔径为0.01-0.5μm。

本发明的优点：

1.装置简单，仅需要使用配套的实验器材盒，安装容易，实验准备快速；

2.分析快速，相比同为体外膜渗透方法的PAPMA法,由于供体液体积远远大于受体液体积，且受体液与供体液接触的比表面积大，势能下降很小，渗透速率高；试剂用量少，仅需配制100μM左右药物浓度的几百微升至几毫升供体液；

3.效率高，本发明专利所提出的方法只需要测定受体液浓度无需检测供体液浓度即可求出渗透系数值，比PAMPA等人造膜法需要测定供体液和受体液两种浓度值的方法节省了一半工作；

4.采用先进的检测仪器配套可以实现高通量化测定药物渗透系数，适应了高通量药物筛选的需要；

5.应用广泛，可广泛适用于各种药物研发、分析、检测领域。

附图说明

图1中空纤维膜管与连接管连接示意图。

图2为本发明测定渗透系数装置示意图。

图3为渗透系数(Pe)与人体吸收分数（Fa）拟合曲线。

具体实施方式

本发明的原理是利用中空纤维膜的多孔性，在膜上通过浸渍涂上卵磷脂溶液，从而在膜的孔隙处形成卵磷脂薄膜，来模拟小肠上皮细胞。在中空纤维膜腔内加入受体液，模拟血液里的环境，在中空纤维膜的外侧放含有被测药物的供体液，模拟小肠里的环境。供体液中的药物在浓度梯度的推动下跨膜渗透进入受体液，渗透一定时间后检测受体液中的药物浓度，然后根据本发明提出的渗透系数计算公式计算得到渗透系数，从而预测口服药物在体内的吸收。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种利用中空纤维膜测定口服药物对乙酰氨基酚渗透系数的方法（见图1和图2），包括如下步骤：

（1）配制pH为7.4的溶质为NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为受体液，受体液中NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.03M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（2）配制pH为7.4的溶质为对乙酰氨基酚、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为供体液，供体液中对乙酰氨基酚的浓度为10μM，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.03M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（3）将一端封口的中空纤维膜管2浸入质量百分浓度为10%的大豆卵磷脂溶液中15分钟，取出，所述大豆卵磷脂溶液的溶剂为十二烷；

中空纤维膜管的长度为30mm，内径为1mm，膜管的厚度为75μm，孔隙率为75%，平均孔径为0.45μm，材质为聚偏氟乙烯；

（4）将经步骤（3）处理过的中空纤维膜管的开口端与连接管1相接；

（5）将20μL受体液4通过连接管加入到所述处理过的中空纤维膜管内；

（6）将步骤（5）的装有受体液的中空纤维膜管浸入盛放有供体液3的容器5中，使受体液的液面低于供体液的液面（为了使与受体液接触的中空纤维膜充分与供体液接触）；渗透时间t为2小时，从受体液中取样，测定受体液中对乙酰氨基酚浓度；并计算渗透系数；算得渗透系数值为8.3996*10^-7cm/s。

渗透系数的计算方法为

Pe = - \frac{V_{a} * \ln (1 - \frac{C_{a}}{C_{o}})}{A * t},

其中Pe为渗透系数，C_a为2小时受体液中药物浓度12.3846μM，C₀为供体液中初始药物浓度107.44μM，t为渗透时间7200s，V_a为受体液体积，A为中空纤维膜管有效面积，Va/A=πR²*h/2πR*h=R/2=0.05，代入得到渗透系数值为8.3996*10^-7cm/s。

以上计算方法的推导过程如下：

根据Fick定律有：

\frac{d C_{a}}{dt} = \frac{D * A * K (C_{d} - C_{a})}{V_{a} * h} - - - (1);

其中，为扩散速度；D为药物在膜中的扩散系数；C_a为受体液的药物浓度；C_d为供体液的药物浓度；K为药物在膜和溶液之间的分配系数；h为膜厚度。

由于供体液的体积很大，在1-4h的渗透时间内，供体液的药物浓度几乎不变，可以视为定值，所以在渗透过程中C_d=C₀，即

\frac{d C_{a}}{dt} = \frac{D * A * K (C_{o} - C_{a})}{V_{a} * h} - - - (2);

积分得到

C_{a} = C_{o} (1 - e^{- \frac{t * D * A * K}{V_{a} * h}}) - - - (3);

由于

Pe = \frac{D * K}{h} - - - (4);

将公式（4）代入公式（3），

得到

Pe = - \frac{V_{a} * \ln (1 - \frac{C_{a}}{C_{o}})}{A * t} - - - (5) .

实施例2

一种利用中空纤维膜测定口服药物雷尼替丁渗透系数的方法，包括如下步骤：

（1）配制pH为7.4的溶质为NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为受体液，受体液中NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.01M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（2）配制pH为6.2的溶质为雷尼替丁、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为供体液，供体液中雷尼替丁的浓度为100μM，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.01M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（3）将一端封口的中空纤维膜管浸入质量百分浓度为1%的大豆卵磷脂溶液中18分钟，取出，大豆卵磷脂溶液的溶剂为橄榄油；

中空纤维膜管的长度为10mm，内径为0.5mm，厚度为50μm，孔隙率为30%，平均孔径为0.01μm，材质为聚四氟乙烯；

（5）将5μL受体液通过连接管加入到所述处理过的中空纤维膜管内；

（6）将步骤（5）的装有受体液的中空纤维膜管浸入盛放有供体液的容器中，使受体液的液面低于供体液的液面；渗透时间t为0.5小时，从受体液中取样，测定受体液中雷尼替丁浓度；并计算渗透系数（计算公式及代入数据方法同实施例1）。算得雷尼替丁渗透系数值为3.4908*10^-7cm/s。

实施例3

一种利用中空纤维膜测定口服药物诺氟沙星渗透系数的方法，包括如下步骤：

（2）配制pH为5的溶质为诺氟沙星、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为供体液，供体液中诺氟沙星的浓度为100μM，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.03M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（3）将一端封口的中空纤维膜管浸入质量百分浓度为15%的蛋黄卵磷脂溶液中10分钟，取出，所述蛋黄卵磷脂溶液的溶剂为十二烷；

中空纤维膜管的长度为100mm，内径为3mm，厚度为500μm，孔隙率为85%，平均孔径为0.5μm，材质为聚四氟乙烯；

（5）将10μL受体液通过连接管加入到所述处理过的中空纤维膜管内；

（6）将步骤（5）的装有受体液的中空纤维膜管浸入盛放有供体液的容器中，使受体液的液面低于供体液的液面；渗透时间t为3小时，从受体液中取样，测定受体液中诺氟沙星浓度；并计算渗透系数（计算公式同实施例1）。算得诺氟沙星渗透系数值为9.5491*10^-7cm/s。

实施例4

一种利用中空纤维膜测定口服药物普萘洛尔渗透系数的方法，包括如下步骤：

（1）配制pH为7.4的溶质为NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为受体液，受体液中NaH₂PO₄-Na₂HPO₄盐缓冲对的浓度为0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（2）配制pH为8的溶质为普萘洛尔、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为供体液，供体液中普萘洛尔的浓度为1000μM，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（3）将一端封口的中空纤维膜管浸入质量百分浓度为20%的蛋黄卵磷脂溶液中20分钟，取出，所述蛋黄卵磷脂溶液的溶剂为辛醇；

中空纤维膜管的长度为30mm，内径为2mm，厚度为500μm，孔隙率为80%，平均孔径为1μm，材质为聚碳酸纤维素；

（5）将50μL受体液通过连接管加入到所述处理过的中空纤维膜管内；

（6）将步骤（5）的装有受体液的中空纤维膜管浸入盛放有供体液的容器中，使受体液的液面低于供体液的液面；渗透时间t为5小时，从受体液中取样，测定受体液中普萘洛尔浓度；并计算渗透系数（计算公式同实施例1）。算得普萘洛尔渗透系数值为11.0712*10^-7cm/s。

实施例5

一种利用中空纤维膜测定口服药物酮洛芬渗透系数的方法，包括如下步骤：

（1）配制pH为7.4的溶质为磷酸盐缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为受体液，受体液中磷酸盐缓冲对的浓度为0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（2）配制pH为7.4的溶质为酮洛芬、磷酸盐缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为供体液，供体液中酮洛芬的浓度为100μM，磷酸盐缓冲对的浓度为0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（3）将一端封口的中空纤维膜管浸入质量百分浓度为20%的大豆卵磷脂溶液中20分钟，取出，所述大豆卵磷脂溶液的溶剂为十二烷；

中空纤维膜管的长度为30mm，内径为1mm，厚度为75μm，孔隙率为75%，平均孔径为0.45μm，材质为聚偏氟乙烯；

（5）将20μL受体液通过连接管加入到所述处理过的中空纤维膜管内；

（6）将步骤（5）的装有受体液的的中空纤维膜管浸入盛放有供体液的容器中，使受体液的液面低于供体液的液面；渗透时间t为3小时，从受体液中取样，测定受体液中酮洛芬浓度；并计算渗透系数（同实施例1），算得酮洛芬渗透系数值为20.6914*10^-7cm/s。

实施例6

一种利用中空纤维膜测定口服药物维拉帕米渗透系数的方法，包括如下步骤：

（1）配制pH为7.4的溶质为NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为受体液，受体液中NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（2）配制pH为7.4的溶质为维拉帕米、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为供体液，供体液中维拉帕米的浓度为100μM，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（6）将步骤（5）的装有受体液的的中空纤维膜管浸入盛放有供体液的容器中，使受体液的液面低于供体液的液面；渗透时间t为3小时，从受体液中取样，测定受体液中维拉帕米浓度；并计算渗透系数（同实施例1），算得维拉帕米渗透系数值为35.4830*10^-7cm/s。

实施例7

一种利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数地塞米松的方法测定，包括如下步骤：

（2）配制pH为7.4的溶质为地塞米松、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为供体液，供体液中地塞米松的浓度为100μM，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（6）将步骤（5）的装有受体液的的中空纤维膜管浸入盛放有供体液的容器中，使受体液的液面低于供体液的液面；渗透时间t为3小时，从受体液中取样，测定受体液中地塞米松浓度；并计算渗透系数（同实施例1），算得地塞米松渗透系数值为27.3362*10^-7cm/s。

实施例8

一种利用中空纤维膜测定口服药物美托洛尔渗透系数的方法，包括如下步骤：

（2）配制pH为7.4的溶质为美托洛尔、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为供体液，供体液中美托洛尔的浓度为100μM，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（6）将步骤（5）的装有受体液的的中空纤维膜管浸入盛放有供体液的容器中，使受体液的液面低于供体液的液面；渗透时间t为3小时，从受体液中取样，测定受体液中美托洛尔浓度；并计算渗透系数（同实施例1），算得美托洛尔渗透系数值为28.7765*10^-7cm/s。

实施例9

一种利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数华法林的方法，包括如下步骤：

（2）配制pH为7.4的溶质为华法林、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为供体液，供体液中华法林的浓度为100μM，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（6）将步骤（5）的装有受体液的的中空纤维膜管浸入盛放有供体液的容器中，使受体液的液面低于供体液的液面；渗透时间t为3小时，从受体液中取样，测定受体液中华法林浓度；并计算渗透系数（同实施例1），算得华法林渗透系数值为23.6536*10^-7cm/s。

实施例10

一种利用中空纤维膜测定口服药物布洛芬渗透系数的方法，包括如下步骤：

（1）配制pH为7.4的溶质为NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为受体液，受体液中磷酸盐缓冲对的浓度为0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（2）配制pH为7.4的溶质为布洛芬、NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对和NaCl，溶剂为水的溶液为供体液，供体液中布洛芬的浓度为100μM，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲对的浓度为0.05M，NaCl的质量浓度为0.9%；

（6）将步骤（5）的装有受体液的的中空纤维膜管浸入盛放有供体液的容器中，使受体液的液面低于供体液的液面；渗透时间t为3小时，从受体液中取样，测定受体液中布洛芬浓度；并计算渗透系数（同实施例1），算得布洛芬渗透系数值为52.2232*10^-7cm/s。

本发明的方法的精密度考察

本发明以对乙酰氨基酚为测试药物，对本方法进行精密度考察。

1.日内精密度：在同一天同一时间6组平行的渗透性系数测定，共进行了三天，每天6组平行的渗透系数测定的RSD分别为10.78%、9.96%和10.28%，平行组之间的差异较小。

2．日间精密度：连续3天测定渗透系数其平均值分别为9.2949*10^-7cm/s、9.7839*10^-7cm/s、11.2471*10^-7cm/s，RSD为10.1581%，日间精密度良好。

由以上方法学验证结果可以看出，本申请建立的渗透性测试方法结果较为稳定，相关性较高。

人造膜法模拟数值与实际药物Fa值的相关性验证

为了进一步验证本发明所建立方法的准确性，本发明扩大了模型药物数量，依次选取对乙酰氨基酚、雷尼替丁、诺氟沙星、普萘洛尔、酮洛芬、维拉帕米、地塞米松、美托洛尔、华法林、布洛芬10种口服药物，测得其渗透性系数依次为9.5491*10^-7(cm/s)、3.4908*10^-7(cm/s)、4.3099*10^-7(cm/s)、11.0712*10^-7(cm/s)、20.6914*10^-7(cm/s)、35.4830*10^-7(cm/s)、27.3362*10^-7(cm/s)、28.7765*10^-7(cm/s)、23.6536*10^-7(cm/s)、52.2232*10^-7(cm/s)，Fa分别为80%、50%、35%、90%、90%、95%、95%、95%、98%、100%。

按照拟合公式：Fa=100（1-exp（-b*Pe））对渗透性数值与人体吸收分数值拟合，由拟合曲线R²为0.9075，可知本方法测定渗透系数值与人体的吸收分数值拟合良好，此方法可以比较合理的模拟出药物在体内渗透情况；据此，在药物的研发中本发明将可以作为药物理化性质参数鉴定的方法之一。本发明实施例中所使用的试剂、材料、器材、试剂配方、具体实验条件、过程、结果的测定方法均为本发明的一个具体实例，并不限定本发明。

Claims

1.一种利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数的方法，其特征是包括如下步骤：

渗透系数的计算方法为

Pe = - \frac{V_{a} * \ln (1 - \frac{C_{a}}{C_{o}})}{A * t}

其中Pe为渗透系数，V_a为受体液体积，C_a为t小时受体液中药物浓度，C_o为供体液中初始药物浓度，t为渗透时间，A为中空纤维膜管有效面积。

2.根据权利要求1所述的一种利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数的方法，其特征是所述卵磷脂为大豆卵磷脂或蛋黄卵磷脂。

3.根据权利要求1所述的一种利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数的方法，其特征是所述亲脂性溶剂为十二烷、橄榄油或辛醇。

4.根据权利要求1所述的一种利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数的方法，其特征是所述中空纤维膜管的材质为聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯或聚碳酸纤维素。

5.根据权利要求1或4所述的一种利用中空纤维膜测定口服药物渗透系数的方法，其特征是所述中空纤维膜管的长度为10-100mm，内径为0.5-3mm，厚度为50-500μm，孔隙率为30%-85%，平均孔径为0.01-0.5μm。