CN107621506A - 一种基于生物膜渗透预测农药鱼类lc50的方法 - Google Patents

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蔡喜运
黄雨薇
李越超
邹德菲
陈景文
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Abstract

本发明属于污染物环境评价领域，提供了一种基于生物膜渗透预测农药鱼类LC50的方法。本发明对于现有预测农药鱼类LC50的不足，在考虑农药生物膜渗透的条件下，采用PAMPA测试技术建立一种快速高通量预测农药鱼类LC50的方法。采用该技术测定农药的生物膜渗透率，在获得农药基本理化性质的基础上，通过多元线性回归方法，构建了生物膜渗透率及农药基本理化性质与农药鱼类LC50的相关模型，可快捷、高效地预测农药对鱼类的LC50值。模型应用领域明确，具有良好的拟合效果、稳健性和预测能力，能够有效预测多种类农药鱼类LC50。

Description

一种基于生物膜渗透预测农药鱼类LC50的方法
技术领域
本发明属于污染物环境评价领域，具体涉及一种基于生物膜渗透(ParallelArtificial Membrane Permeability Assay,PAMPA)预测农药鱼类LC50的方法。
背景技术
我国是全世界农药施用量最大的国家之一。农药作为农业集约化的产物，一方面，其在农业发展中发挥着除草、杀虫、杀菌等至关重要的作用，保障了农业的丰收及粮食的供应；但另一方面，农药也是环境中最危险的污染物之一，其本身具有毒性活性，在使用过程中残留在环境中，再通过直接或间接的途径进入生物体对其产生危害。由于对环境以及人类健康有潜在的危害，美国环境保护署(EPA)、世界卫生组织(WHO)、食品法典委员会等组织已经将部分农药列入了优先污染物名单中。
越来越多的农药通过各种途径进入水体且存在于环境中，被水生生物体吸收，产生毒害效应，造成生态危害。虹鳟鱼、大型蚤、发光菌等生物常用来评价污染物对生态的危害，然而逐一对农药的毒性进行实验测定需要消耗大量的人力、物力和财力，还有违背动物实验3R原则(Reduction、Replacement、Refinement)等。
半数致死浓度(LC50)是评价农药对水生生物毒性的一个重要指标，也是环境风险评估方法需要考虑的一个重要指标。传统的环境风险评估方法，是通过监测环境中农药的浓度来评价其风险，忽略了农药本身物理化学性质的差异，没有考虑到真正通过生物膜即被生物吸收的有机化合物的量。美国国家研究委员会(NRC)的年度报告中，Ehlers和Luthy首先提出了“生物有效性过程”这一个概念，其中生物有效性过程包括污染物在环境中的迁移；污染物通过生物膜被吸收；污染物与靶标位点的结合。其中污染物透过生物膜的过程非常重要，其是生物富集中重要的一步，亦是影响鱼类LC50的一个关键环节。
现有关于污染物急性毒性的预测模型都是采用计算软件对污染物的分子结构进行计算从而建立QSAR模型，如专利CN201310705921.3公开了一种通过量子化学方法构建定量构效关系模型来预测有机化合物急性毒性的方法，该专利通过量子化学手段构建了有机磷农药对绿藻的急性毒性，验证集数据32种，R2＝0.805；专利CN201410053184.8公开了一种通过定量构效关系模型预测有机磷农药对水生生物急性毒性的方法，具体方法是采用Gaussian程序进行化合物的几何优化，然后进行偏最小二乘逐步线性回归，计算耗时长，描述符多。由此可见，目前针对农药鱼类LC50的预测模型很少，预测农药的种类单一、预测范围小、预测效果不佳。目前农药对生物急性毒性作用的研究只考虑添加的农药浓度对生物体的影响，却没有考虑到真正的生物吸收，即农药的生物膜渗透。因此，有必要在考虑生物吸收的前提下，建立一种可以高通量快速预测农药鱼类LC50的方法。
平行人工膜渗透模型(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay,PAMPA)用于测定化合物的生物膜渗透率，是一种比传统生物学方法更经济、高效、便捷的方法。其通过“三明治”结构模拟不同的生物膜来测试不同生物组织的渗透率，从而评估农药鱼类的LC50。
发明内容
本发明对于现有预测农药鱼类LC50技术的不足，建立一种基于生物膜渗透预测农药鱼类LC50的方法，该方法通过测定生物膜的渗透率，建立农药LC50与渗透率等基本理化性质相关关系，进而评估农药鱼类LC50。
本发明的技术方案：
一种基于生物膜渗透预测农药鱼类LC50的方法，步骤如下：
(1)数据汇总
通过查阅毒性数据库和相关文献，获得所要研究的农药的鱼类LC50和理化性质，理化性质包括分子量、分子体积、熔点、分子极性、沸点、溶解度和辛醇-水分配系数；
(2)农药的渗透率测定
采用专利CN201610412443.0的方法，在供体池中加入0.05～1.0μg/mL农药溶液，在接收池中加入缓冲溶液，供体池中农药溶液和接收池中生物膜体液二者的体积相同；然后将供体池放入接收池中，确保人工膜和接收池中的缓冲溶液完全接触；37℃孵育16h后，分别移取供体池和接收池中的溶液，然后通过气相色谱-质谱连用(GC-MS)和液相色谱-质谱连用(LC-MS)进行分析得到农药的峰面积，测定农药的浓度标准曲线；根据浓度标准曲线计算对应农药的浓度，并计算人工膜的表观渗透率Pa和有效渗透率Pe；
(3)农药LC50的预测
对农药鱼类LC50与人工膜的表观渗透率Pa、有效渗透率Pe及其理化性质的相关性进行分析，以LC50为因变量，将人工膜的表观渗透率Pa、有效渗透率Pe及农药的理化性质纳入自变量内进行回归分析，通过得到的几个模型的比较，得到最佳的农药鱼类LC50预测模型方程，预测模型方程的复相关系数R2大于0.7时，预示建立的模型拟合效果良好，R2越大，拟合效果越好；依据回归分析结果计算得到LC50计算值，并分析该计算值与实测值的线性拟合结果。
表观渗透率Pa的LC50预测模型方程：
Log LC50＝0.832LogS+4.120LogM-0.268Log Pa-9.061(R2＝0.802) n＝56
其中，S为农药的溶解度；M为农药的分子量；Pa为农药的表观渗透率。
本发明的有益效果：本发明在考虑农药的生物膜渗透因素情况下，采用PAMPA测试技术，通过GC-MS和LC-MC测定农药的渗透率，通过逐步线性回归建立农药鱼类LC50与渗透率等基本理化性质相关关系，采用农药的溶解度、分子量和表观渗透率来预测农药鱼类LC50。本发明是一种操作简单、预测性好且适用性强的预测技术。
附图说明
图1为表观渗透率Pa条件下LC50的预测值与实验值对比。
图2为模型的验证。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1农药的渗透率测定
供体池中加入0.05～1.0μg/mL农药溶液，在接收池中加入生物膜体液，供体池中农药溶液和接收池中生物膜体液二者的体积相同；然后将供体池放入接收池中，确保人工膜和接收池中的缓冲溶液完全接触；37℃孵育16h后，分别移取供体池和接收池中的溶液，然后通过气相色谱-质谱连用(GC-MS)和液相色谱-质谱连用(LC-MS)进行分析得到农药的峰面积，测定农药的浓度标准曲线；根据浓度标准曲线计算对应农药的浓度，并计算人工膜的表观渗透率Pa和有效渗透率Pe。
通过实验测得农药的表观渗透率(Pa)和有效渗透率(Pe)如下表1所示。
表1农药相关信息表
注：#表示渗透率值很小，可忽略。
-表示渗透培养后接收池浓度高于1/2原始浓度
实施例2农药鱼类LC50的预测
对农药的LC50与测定的农药渗透率及其他基本性质的相关性进行分析。农药渗透率包括肠道表观/有效渗透率、胃表观/有效渗透率，基本理化性质包括分子量、分子体积、熔点、分子极性、沸点、溶解度、辛醇-水分配系数等(表2)，进行逐步线性回归分析，构建多元线性回归模型，以考察渗透性和理化性质与LC50的关系。
采用SPSS 19软件进行多元线性回归构建的预测模型方程如下，依据回归分析结果计算得到LC50计算值，并分析该计算值与实测值的线性拟合结果(图1)，建立用基于生物膜渗透(PAMPA)预测农药鱼类LC50的方法。
表观渗透率Pa的LC50预测模型方程：
Log LC50＝0.832LogS+4.120LogM-0.268Log Pa-Stom-9.061(R2＝0.802) n＝56
模型预测效果良好，即农药鱼类LC50的预测结果由农药的溶解度(S)、分子量(M)及农药的胃表观渗透率(LogPa)来决定。预测的农药类型包括有机磷类、有机氯类、新烟碱类、酰胺类、三嗪类、三唑类、磺酰脲类等。
实施例3农药鱼类LC50模型验证
从有机磷类、有机氯类、新烟碱类、酰胺类、三嗪类、三唑类、磺酰脲类等农药中选取14个农药来进行模型验证，分别是乙拌磷、毒死蜱、艾氏剂、异狄氏醛、啶虫脒、异丙甲草胺、阿特拉津、丙环唑、嘧苯胺磺隆、噻吩磺隆、百菌清、杀草敏、异菌脲、噻菌灵。将这些农药的溶解度(S)、分子量(M)及农药的胃表观渗透率(LogPa)带入建立的农药鱼类LC50预测模型中得到计算值，将实验测得的农药鱼类LC50与得到的计算值进行线性拟合(图2)，拟合结果y＝1.049x-0.220R2＝0.845n＝14。证明了本模型是预测性好且适用性强的预测技术。

Claims (2)

1.一种基于生物膜渗透预测农药鱼类LC50的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)数据汇总
通过查阅毒性数据库和相关文献，获得所要研究的农药的鱼类LC50和理化性质，理化性质包括分子量、分子体积、熔点、分子极性、沸点、溶解度和辛醇-水分配系数；
(2)农药的渗透率测定
采用CN201610412443.0中公开的方法，在供体池中加入0.05～1.0μg/mL农药溶液，在接收池中加入缓冲溶液，供体池中农药溶液和接收池中生物膜体液二者的体积相同；然后将供体池放入接收池中，确保人工膜和接收池中的缓冲溶液完全接触；37℃孵育16h后，分别移取供体池和接收池中的溶液，然后通过气相色谱-质谱连用和液相色谱-质谱连用进行分析得到农药的峰面积，测定农药的浓度标准曲线；根据浓度标准曲线计算对应农药的浓度，并计算人工膜的表观渗透率Pa和有效渗透率Pe；
(3)农药LC50的预测
对农药鱼类LC50与人工膜的表观渗透率Pa、有效渗透率Pe及其理化性质的相关性进行分析，以LC50为因变量，将人工膜的表观渗透率Pa、有效渗透率Pe及农药的理化性质纳入自变量内进行回归分析，通过得到的几个模型的比较，得到最佳的农药鱼类LC50预测模型方程，预测模型方程的复相关系数R2大于0.7时，预示建立的模型拟合效果良好，R2越大，拟合效果越好；依据回归分析结果计算得到LC50计算值，并分析该计算值与实测值的线性拟合结果；
表观渗透率Pa的LC50预测模型方程：
Log LC50＝0.832LogS+4.120LogM-0.268Log Pa-9.061，R2＝0.802，n＝56；
其中，S为农药的溶解度；M为农药的分子量；Pa为农药的表观渗透率。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的理化性质包括渗透率、分子量、分子体积、分子极性、熔点、沸点、溶解度和辛醇-水分配系数。
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