CN104155441B

CN104155441B - 一种基于微流控芯片的农药残留检测方法

Info

Publication number: CN104155441B
Application number: CN201410160618.4A
Authority: CN
Inventors: 郭业民; 曹瑶瑶; 孙霞; 王相友; 刘君峰
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2014-04-22
Filing date: 2014-04-22
Publication date: 2015-09-09
Anticipated expiration: 2034-04-22
Also published as: CN104155441A

Abstract

本发明公开了一种基于微流控芯片的农药残留检测方法，属于农产品安全检测技术领域。本发明利用微电极具有体积小、传质速率快、扩散层薄等优点，将一定量蛋白A通入微流控芯片中，一方面与基底金原子紧密结合，另一方面与免疫球蛋白分子Fc片段高亲和力结合的位点，实现抗体在修饰界面的定向固定。整个试验过程中，对参数进行优化，获得最佳的测试条件：10μL/min作为流量、100mV作为外部施加电压、选取10min作为微流泵的通液时间。制备出的毒死蜱免疫传感器，通过计算接触样品前后免疫传感器的阻抗值的变化，获得样品中毒死蜱农药的浓度信息。该传感器其在1-1.0×10⁴ng/mL浓度范围检测毒死蜱的线性关系良好，可用于实际样品中目标成分毒死蜱的检测。

Description

一种基于微流控芯片的农药残留检测方法

技术领域

本发明涉及一种基于微流控芯片的农药残留检测方法，属于农产品安全检测技术领域。

技术背景

世界上化学农药年产量近200万吨，约有1000多种人工合成化合物被用作杀虫剂、杀菌剂、杀藻剂、除虫剂、落叶剂等类农药。农药尤其是有机农药大量施用，造成严重的农药污染问题，成为对人体健康的严重威胁。农药进入粮食、蔬菜、水果、鱼、虾、肉、蛋、奶中，造成食物污染，危害人的健康。一般有机磷农药在人体内代谢速度很慢，累积时间长。残留在土壤中的农药通过植物的根系进入植物体内，农药进入河流、湖泊、海洋，造成农药在水生生物体中积累。在自然界的鱼类机体中，含有机磷杀虫剂相当普遍，浓缩系数为5～40000倍。虽然近年来国际上在蔬菜上已禁用该农药，但由于其对某些作物具有生长刺激作用，所以仍有不少违章使用现象，因此实现对农药的检测是至关重要的。

微流控芯片是微流控技术实现的主要平台。其装置特征主要是其容纳流体的有效结构（通道、反应室和其它某些功能部件）至少在一个纬度上为微米级尺度。该试验中应用的微流控芯片中反应室中为微阵列电极，其拥有低电阻电压降、快速建立稳态系统、快速的反应动力学和提高信噪比等优点，其反应时间短，分析效率高，许多分析过程可以在数分钟内完成；样品和试剂消耗量少，能源消耗低；因而在病毒、细菌等医学领域的检测中有所应用。而传统的农药残留检测，虽然这些方法的选择性好、灵敏度高和准确度高，同时检测多种元素或化合物，但其需要昂贵的仪器设备,样品的前处理过程繁琐、费时,并且对分析人员的技术水平要求很高,不适于现场快速检测。因此本文尝试制备一种毒死蜱残留的免疫传感器。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能克服上述方法的缺陷，且体积小、比表面积高、集成化、便携化、选择性好的毒死蜱农药残留检测的免疫传感器检测方法。采用的技术方案为：利用微流控芯片的集成化、便携化，将蛋白A通入微流控芯片中从而与基地金电极结合，蛋白A和金原子的分子间作用力使两者紧密结合，另外，蛋白A分子中有四个与免疫球蛋白分子Fc片段高亲和力结合的位点，使农药抗体定向固定在电极表面，从而使抗原抗体反应更有效,检测电极表面的阻抗值，研究该传感器的电化学性能。

所述的微流控芯片由一块一面溅射有三对插指金电极的玻璃平板和另一块具有微通道构型的玻璃封接平板叠合而成；叉指电极的两端由两根引线引出，两个平板中间形成封闭通道,在其中一块平板上设置有通道的进出口，微流体通道（深40 μm，宽100 μm）与微流体检测室（宽500 μm，长1723 μm；容积为34.5 nL）由聚二甲基硅氧烷（PDMS）模设计而成，金插指电极由3对阵列电极组成,相互交叉在一起。

所述方法的步骤如下：

1）首先对微流控芯片清洗，测试其阻抗值的变化；

2）将步骤1）所得微流控芯片进行流量、外加电压、液体通入时间等参数，进行优化，筛选出最佳的试验取值；

3）将步骤2）所得的微流控芯片中，在最优条件下通入蛋白A，将其固定在芯片表面，从而获得蛋白A修饰界面；

4）在步骤3）所得蛋白A修饰芯片中通入抗体，使其与蛋白A结合后获得抗体修饰界面；

5）利用抗原抗体间的特异性反应，通入不同浓度的毒死蜱农药，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后进行阻抗检测，建立不同毒死蜱农药浓度与微流控芯片阻抗变化之间的关系曲线；

6））将果蔬样品液通入微流控芯片中，用PBS冲洗10 min后进行阻抗检测，获得果蔬样品中是否含有毒死蜱农药及是否超标的信息。

所述方法的步骤1）所述清洗并测试微流控芯片，是分别通入一定量的氢氧化钠、氯化氢等一段时间，再通入双蒸水，冲洗干净；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。

所述方法的步骤2）所述流量、外加电压和液体通入时间等参数进行了优化：流量选取值在5-35 μL/min；外加电压选取范围在10-100 mV；液体通入时间1-10 min，对不同条件下的阻抗值进行分析测试，确定微流控芯片测试过程中的最佳参数。

所述方法的步骤3）所述通入不同浓度的蛋白A溶液，通入的流量为10 μL/min，固定90 min。

所述方法的步骤4）所述通入不同浓度的毒死蜱抗体溶液，通入的流量为10 μL/min，固定2 h，孵育温度为4℃。

所述方法的步骤5）所述通入不同浓度的毒死蜱农药，通入的流量为10 μL/min，用PBS冲洗后进行阻抗检测。

所述方法的步骤6）所述通入不同浓度的毒死蜱农药，通入的流量为10 μL/min，孵育30 min后用PBS冲洗10 min后进行阻抗检测。

所述方法的具体步骤如下：

1）微流控芯片的清洗：首先通入0.1 M氢氧化钠，静置1 h，通入双蒸水30 min，冲洗干净；再通入0.1 M氯化氢，静置1 h，通入双蒸水30 min，冲洗干净；整个试验清洗中的通速都采用10 μL/min；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。获得清洗干净的微流控芯片，便于在其表面进行修饰，保证构建传感器的准确性；

2）所述流量、外加电压等参数进行了优化：流量分别再当通速很小的时候，液体在微流控芯片通道中的速度很缓慢，通速慢慢增大的同时，通道中的液体对整个微流控芯片装置的压力等也会随之而改变，导致整个流体的阻抗值表征为相关性增加，在10-100 μL/min，通速与测试液的阻抗值成一定的线性关系。考虑对微流控芯片的使用寿命影响，本试验中选取10 μL/min作为流速。在改变电压的同时，阻抗值几乎没有变化，趋于稳定。而鉴于100 mV可以再保持阻抗可线性测量的同时，且克服噪音，故而选用100 mV作为外部施加电压。在1-10 min，随之时间的延长，通入微流控芯片的液体量也逐渐增加，阻抗值也随之增加，而随着10 min之后，阻抗值增加很不明显，趋于稳定，故而选取10 min作为微流泵的通液时间；

3）取蛋白A原液（1 mg/mL），用PBS稀释不同倍数，配置10、100、200 μg/mL等不同浓度，在上述确定的最优参数下，对其阻抗值进行测定，筛选出试验中定向固定抗体所用最佳的浓度值，通入蛋白A溶液的速度为10 μL/min，固定90 min。从而获得蛋白A修饰的免疫传感器界面；

4）取毒死蜱抗体原液（1 mg/mL），用PBS稀释不同倍数，配置10、100、200 μg/mL等不同浓度，对其阻抗值进行测定，筛选出试验所用最佳的浓度值100 μg/mL，通入毒死蜱抗体的流量为10 μL/min，固定2 h，孵育温度为4 ℃。进而完成抗体在修饰界面的固定；

5）通入不同浓度的毒死蜱农药，通入的流量为10 μL/min，用PBS冲洗后进行阻抗检测，分析该免疫传感器对毒死蜱的测试性能；

本方法的有益效果：

本发明对流量、外加电压和液体通入时间等参数进行了优化：10 μL/min作为流量、100 mV作为外部施加电压、选取10 min作为微流泵的通液时间。为进一步研究奠定了基础，且1-1.0×10⁴ ng/mL范围内线性范围良好；

采用本发明制备的基于微流控芯片的农药残留检测方法操作工艺简单，低电阻电压降、短反应时间，高分析效率，样品和试剂消耗量少，灵敏度高，稳定性高，可实现样品检测的自动化。符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。

附图说明

图1免疫传感器在不同浓度的毒死蜱标准液（从a到f）：0.0到1.0×10⁴ ng/mL中的bode响应曲线

图2免疫传感器对毒死蜱检测的的标准曲线

图3免疫传感器在实际样品检测中的加标回收率

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1 一种基于微流控芯片免疫传感器的制备步骤：

（1）微流控芯片的清洗：首先通入0.1 M氢氧化钠，静置1 h，通入双蒸水30 min，冲洗干净；再通入0.1 M氯化氢，静置1 h，通入双蒸水30 min，冲洗干净；整个试验清洗中的通速都采用10 μL/min；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。如有需要，可以通过显微镜观察微流控中金插指微阵列电极的表面状态。（清洗过程与乙醇、丙酮等方法进行对比清洗效果，选出了适当的清洗方法）；

（2）取蛋白A原液（1 mg/mL），配置100 μg/mL，通入蛋白A溶液的流量为10 μL/min，孵育90 min；

（3）取毒死蜱抗体原液（1 mg/mL），配置10 μg/mL，通入毒死蜱抗体的流量为10 μL/min，孵育温度为25℃，固定2 h。

实施例2 微流控芯片的线性关系

配置1-1.0×10⁴ ng/mL的毒死蜱标准溶液，将上述制备好的微流控芯片免疫传感器分别通入不同浓度的毒死蜱标准溶液，流量为10 μL/min，在常温下孵育30 min，检测免疫前后电流变化得到其工作曲线。如图1，曲线分别代表不同毒死蜱农药浓度所对应的阻抗值，随着浓度的增加，阻抗值逐次增大。本试验中，以毒死蜱浓度的对数为横坐标，阻抗变化值为纵坐标建立关系曲线，可以得到在1-1.0×10⁴ ng/mL范围内线性相关，线性回归方程分别为：y=65.580 lgC (ng/mL) + 9.8400 (R²=0.9868)（图2），该方法有利于整个制备过程中试验条件的严格控制，更好地实现人为因素的干扰作用，还充分体现了微流控系统操作便捷、响应快速、试剂消耗少等优势。有待用于实际样品中毒死蜱农药残留的快速检测工作。

实施例3 使用微流控芯片免疫传感器检测果蔬样品的加标回收率测定

选取新鲜韭菜、生菜、白菜为样品，清洗晾干后，切碎成3×3 mm颗粒片状，分别准确称取1.0 g放3支称量瓶中，然后分别加入相同体积的10 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL毒死蜱标准溶液，再向3支称量瓶中分别加入5 mL缓冲溶液，超声萃取30 min，将萃取后的溶液进行离心处理，去除蔬菜残渣以及大颗粒干扰物。取上清液进行膜过滤，膜过滤后取2.5 mL于3支试管中。使用本发明的微流控芯片免疫传感器进行接触样品前后的阻抗值测量。测量后根据已经获得的阻抗变化与农药浓度的关系曲线得到实际的检测值。实际样品检测的回收率在88.6%-102.5%之间，相对标准偏差在3.34%-5.27%之间，说明本发明的微流控芯片免疫传感器能够较好的用于果蔬实际样品的农药残留的检测，具体的如表1所示。

实施例4 使用微流控芯片免疫传感器检测果蔬实际样品

1）选取蔬菜品或水果样，用潮湿的抹布将蔬菜表面的泥土擦拭干净，切碎成3×3 mm，取样品2 g，放入提取瓶中，加入10 mL磷酸盐缓冲液，放入超声提取仪，超声提取3 min，倒出提取液静置2 min，备用；

2）微流控芯片的清洗：首先通入0.1 M氢氧化钠，静置1 h，通入双蒸水30 min，冲洗干净；再通入0.1 M氯化氢，静置1 h，通入双蒸水30 min，冲洗干净；整个试验清洗中的通速都采用10 μL/min；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与上次裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。如有需要，可以通过显微镜观察微流控中金插指微阵列电极的表面状态。（清洗过程与乙醇、丙酮等方法进行对比清洗效果，选出了适当的清洗方法）；

3）取蛋白A原液（1 mg/mL），配置100 μg/mL，通入蛋白A溶液的流量为10 μL/min，孵育90 min；

4）取毒死蜱抗体原液（1 mg/mL），配置10 μg/mL，通入毒死蜱抗体的流量为10 μL/min，孵育温度为25℃，固定2 h；

5）固定抗体后，微流控芯片用PBS冲洗10 min后进行阻抗检测，利用得到的阻抗图谱中的bode图，获取所测阻抗值Z₁；

6）将果蔬样品液通入微流控芯片中，流量为10 μL/min，孵育30 min后用PBS冲洗10 min后进行阻抗检测，利用得到的阻抗图谱中的bode图，获取所测阻抗值Z₂；

7）计算农药测试前后的阻抗变化ΔZ=Z₂-Z₁，根据阻抗变化与毒死蜱浓度的关系曲线获得果蔬实际样品农药浓度的信息。

Claims

1.一种基于微流控芯片的农药残留检测方法，其特征在于，使用的微流控芯片由一块一面溅射有三对叉指金电极的玻璃平板和另一块具有微通道构型的玻璃封接平板叠合而成,叉指金电极的两端由两根引线引出，两个平板中间形成封闭通道, 在其中具有微通道构型的平板上设置有通道的进出口，微流体通道和微流体检测室由聚二甲基硅氧烷模设计而成，微流体通道深40μm，宽100μm,微流体检测室宽500μm，长1723μm ,容积为34.5 nL,叉指金电极由3对阵列电极组成, 相互交叉在一起；基于微流控芯片的传感器组装过程为：将蛋白A溶液通入微流控芯片中，蛋白A和基底金电极紧密结合，且与农药抗体的Fc端结合而使其定向固定，再将毒死蜱抗体通入微流控芯片中，最后，利用抗原抗体间的特异性反应，通入不同浓度的农药，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后进行阻抗检测，进而制备出了一种新型的农药残留免疫传感器；所述农药为毒死蜱农药。

2. 根据权利要求1 所述方法，其特征在于，抗体在微流控芯片上的固定步骤如下：

1）清洗并测试微流控芯片；

2）将步骤1）所得微流控芯片的流量、外加电压、液体通入时间参数，进行优化；

3）在步骤2）所得的微流控芯片中，在最优条件下通入蛋白A溶液，获得蛋白A修饰界面；

4）在步骤3）所得蛋白A溶液修饰芯片中通入毒死蜱抗体，获得抗体修饰界面。

3. 根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1）所述清洗并测试微流控芯片，是分别通入一定量的氢氧化钠、氯化氢一段时间，再通入双蒸水，冲洗干净；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗。

4. 根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2）中流量、外加电压、液体通入时间参数优化为：流量选取在5-35μL/min ；外加电压选取在10-100 mV ；液体通入时间1-10 min。

5. 根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3）所述通入蛋白A溶液，通入的流量为10μL/min，固定90 min。

6. 根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4）所述通入毒死蜱抗体，通入的流量为10μL/min，固定2 h，孵育温度为4℃。

7. 根据权利要求2 所述方法，其特征在于，检测方法建立具体步骤如下：

1）微流控芯片的清洗：首先通入0.1 M 氢氧化钠，静置1 h，通入双蒸水30 min，冲洗干净；再通入0.1 M 氯化氢，静置1 h，通入双蒸水30 min，冲洗干净；整个试验清洗中的通速都采用10 μL/min ；最终，经超纯水冲洗后，进行阻抗谱扫描，与裸电极的结果对比，两者基本重合，则说明清洗干净，否则需要重新清洗；

2）取1 mg/mL蛋白A原液，用磷酸盐缓冲溶液稀释不同倍数，配置10、100、200 μg/mL 不同浓度，对其阻抗值进行测定，筛选出试验所用最佳的浓度值，通入蛋白A溶液的流量为10μL/min，固定90 min ；

3）取1 mg/mL毒死蜱抗体原液，用磷酸盐缓冲溶液稀释不同倍数，配置10、100、200μg/mL 不同浓度，对其阻抗值进行测定，筛选出试验所用最佳的浓度值100 μg/mL，通入毒死蜱抗体的流量为10μL/min，固定2 h，孵育温度为4℃ ；

4）通入不同浓度的毒死蜱农药，通入的流量为10 μL/min，用磷酸盐缓冲溶液冲洗后进行阻抗检测，建立毒死蜱浓度C与阻抗变化之间的标准曲线，在1-1.0×10⁴ng/mL 范围内线性范围良好，线性回归方程分别为：y=65.580 lgC (ng/mL) + 9.8400，线性相关系数R²=0.9868。

8. 根据权利要求1 所述方法，果蔬中农药残留具体检测步骤如下：

1）果蔬样品预处理方法如下：选取蔬菜或水果样品，用潮湿的抹布将蔬菜或水果表面的泥土擦拭干净，切碎成3×3 mm，取样品2 g，放入提取瓶中，加入10 mL 磷酸盐缓冲液，放入超声提取仪，超声提取3 min，倒出提取液静置2 min，备用；

2）在微流控芯片上固定毒死蜱抗体后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗10 min 后进行阻抗检测，利用得到的阻抗图谱中的bode图，获取所测阻抗值Z₁ ；

3）加入果蔬样品液后，微流控芯片用磷酸盐缓冲溶液冲洗10 min 后进行阻抗检测，利用得到的阻抗图谱中的bode图，获取所测阻抗值Z₂ ；

4）计算农药测试前后的阻抗变化ΔZ=Z₂-Z₁，根据阻抗变化与毒死蜱浓度的关系曲线获得果蔬实际样品农药浓度的信息。