CN103499619A - 一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法,属于生物化工技术领域。本发明的第一步为石墨烯-纳米金复合物修饰工作电极:以石墨烯和纳米金为原料制备的石墨烯-纳米金复合物滴涂到工作电极表面。本发明的第二步乙酰胆碱酯酶传感器的制备:制备的煅烧类水滑石与乙酰胆碱酯酶混合的混合物滴涂到石墨烯-纳米金复合物修饰的工作电极表面。石墨烯-纳米金复合物可以促进电子转移,提高传感器的灵敏度;煅烧类水滑石拥有良好的生物相容性,具有较强的吸附性,可以作为乙酰胆碱酯酶的固定载体,使酶更加稳定的固定在工作电极上,制备的乙酰胆碱酯酶传感器检测时间短,灵敏度高,稳定性好,可以用于实际样品的检测。
Description
本发明提供一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法,属于生物传感器技术领域。
背景技术
农药是重要的农业生产资料,在农产品生产中对病、虫、草、鼠危害的防治起到非常重要的作用。但是,农药污染及其产生的危害后果是严重的,农药对环境污染造成的损失是多方面的,包括对水环境的污染,对土壤的污染,对大气的污染,对环境生物的影响以及对人体健康的危害等。目前由于使用者普遍缺乏科学使用农药知识,片面追求产量,造成目前市场上流通的农业产品都不同程度地存在农药残留问题,其危害也日益引起公众的关注。我国是一个农业大国,随着我国人民生活水平不断提高,农产品的质量安全问题越来越受到关注,尤其蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点。我国生产和使用的杀虫剂绝大多数品种为有机磷和氨基甲酸酯类农药 (约占70%),其中高毒性的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂为70% 左右,因此容易引起食物农药残留中毒。可见,加强对农产品中农药残留的检测对保护生态环境,尤其是保障人类健康有着十分深远的意义,而农药残留检测的重点应该放在有机磷和氨基甲酸酯类农药。
目前农药残留分析的主要方法是气相色谱仪、液相色谱仪、气质联用仪、液质联用仪等,这些方法虽然分析精度高,定量准确,但其样品的前处理复杂、检测耗时长、成本高、需要技术熟练的操作人员。我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法(农残快速检测仪),可以实现有机磷农药及氨基甲酸酯类农药的现场快速检测,具有较好的实用价值。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化,因此一般只能用于严重超标的蔬菜样品进行定性测量。酶抑制分光光度法的应用也比较广泛,国内已有多种农药残留速测仪均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的变化进行检测的,但蔬菜水果中大量的色素会对分光光度法造成很大的影响,导致检测结果的不准确。并且上述方法存在回收率低、错检、漏检比例较高、重复性差、难以满足低残留和定量检测的要求等缺点。
发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、价格低廉、灵敏度高的检测农药残留的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法。
其技术方案为:一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器制备方法,其特征在于:制备石墨烯(GN)-纳米金(AuNPs)复合物,滴涂在玻碳电极(GCE)表面,然后滴涂煅烧类水滑石(CLDH)-乙酰胆碱酯酶(AChE)混合物,最终得到CLDH-AChE/GN-AuNPs/GCE 传感器。
所述的一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器制备方法,其特征在于:石墨烯-纳米金复合物的合成,煅烧类水滑石的制备,玻碳电极的清洗,乙酰胆碱酯酶传感器敏感界面的构建及过程表征,乙酰胆碱酯酶传感器工作曲线的建立,乙酰胆碱酯酶传感器性能的检测,乙酰胆碱酯酶传感器对实际样品的检测。
所述的一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器制备方法,其特征在于:所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器检测毒死蜱的浓度范围为0.05-150 μg/L,检测限为0.05 μg/L。乙酰胆碱酯酶传感器性能检测包括准确性、稳定性以及乙酰胆碱酯酶传感器对蔬菜样品回收率的测定。
其制备原理为:由于有机磷农药与乙酰胆碱酯酶具有较高的特异性结合,因此常用乙酰胆碱酯酶作为检测有机磷农药的分子识别元件。乙酰胆碱酯酶生物传感器是将乙酰胆碱酯酶固定在电极表面,酶催化底物乙酰胆碱水解生成胆碱和乙酸。农药在结构上与底物乙酰胆碱有些类似,它可以和乙酰胆碱的活性中心有效结合,抑制乙酰胆碱酯酶的活性。胆碱是一种电活性物质,能在一定电位下发生氧化反应,通过伏安扫描过程中硫代胆碱氧化峰的大小可以测定农药残留的浓度,通过比较有无农药时酶促反应电流信号的变化得到农药对酶的抑制率,该抑制率与农药的浓度成对应关系,便可测得有机磷或氨基甲酸酯类农药的含量;
本发明采用石墨烯-纳米金纳米复合膜对玻碳电极进行修饰,制备煅烧类水滑石用以固定乙酰胆碱酯酶,最终制备乙酰胆碱酯酶传感器。石墨烯是一种完美的二维(2d)碳纳米材料,由于其特殊热性能和机械性能,并且具有高比表面积(计算值,2630 m2/g)和优异的导电性,因此将石墨烯-纳米金纳米复合材料滴涂到电极表面,能够有效增大传感器的电流响应,较高的比表面积为下一步材料的固定提供良好的基础,使制备的酶传感器具有较低的检测限。然后在修饰石墨烯-纳米金纳米复合材料的电极表面滴涂煅烧类水滑石-乙酰胆碱酯酶混合物。水滑石(Hydrotalcite,简称HT),是一种具有层状结构的双羟基阴离子粘土,其结构类似于水镁石的正八面体结构。水滑石层板上的Mg2+、Al3+具有同晶可取代性,而层间阴离子可被其他阴离子交换,取代或者交换后的化合物的基本结构与水滑石相同,这些化合物被称为类水滑石化合物。通过在超过400 ℃加热类水滑石,夹层CO3 2-可以被剔除并且由此产生的水滑石的煅烧产品可以通过吸附在图层面板外部表面的任何一层,夹层过程或重建反应用于去除无机阴离子。煅烧类水滑石由于其较大的表面积、较高的热稳定性、元素之间的协同效应并且与类水滑石相比具有更小的扩散阻力等特性,受到广泛的关注。煅烧类水滑石用于传感器的制备能够增大传感器的固定酶量,以及使传感器具有较高的稳定性。
将经过上述步骤制成的乙酰胆碱酯酶传感器,具有检测限低,范围广,精度高,适用于现场检测等优点。采用本发明制成的电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器可以在蔬果采收、上市前,进行农药残留的快速测定,直接对农药残留是否超标量进行检测,避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒,为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
为达到以上目的,采取以下技术方案实现:一种检测农药残留的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法,其特征在于:(1) 电流型乙酰胆碱酯酶传感器制备前玻碳电极的清洗,活化和性能测试,如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在 80 mV以下,并尽可能接近64 mV,所述玻碳电极可使用,否则要重新返回清洗步骤中,直到符合要求。(2) 制备煅烧类水滑石,将乙酰胆碱酯酶溶液与类水滑石(2 mg/mL)悬浮液以1:1的体积比混合,得到煅烧类水滑石-乙酰胆碱酯酶混合液,将制备好的混合液储存在4 ℃的冰箱中。(3) 将5 μL的石墨烯-纳米金溶液滴涂在预先处理的玻碳电极上,在空气中干燥2 h,得到的石墨烯-纳米金玻碳电极用超纯水冲洗表面,将未固定在电极表面的复合物冲洗掉。然后滴涂5.0 μL 类水滑石-乙酰胆碱酯酶溶液的混合液(100 mU),并在室温下干燥2 h。用pH为 7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗去除未吸附上的酶,这样就得到CLDH-AChE/GN-AuNPs/GCE传感器,在4 ℃干燥环境下保存备用。
为达到以上目的,采取以下技术方案实现:一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法,其特征在于:(1) 配置一系列毒死蜱标准液,进行差分脉冲伏安扫描,得到抑制率,进一步得到上述制备的电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器的工作曲线、检测范围和检测限;(3) 对乙酰胆碱酯酶生物传感器的精确度和稳定性进行评价;(4) 对实际果蔬样品进行分析得出该传感器的回收率和重现性。
本发明采用石墨烯-纳米金纳米复合膜对玻碳电极进行修饰,石墨烯-纳米金纳米复合膜能够促进电化学反应中电子的传递,提高电极上的响应电流,煅烧类水滑石能够改善电极表面的微环境,具有较大的比表面积,因而可以作为固定大分子蛋白质的材料,用来制备稳定性和灵敏度高的电化学生物传感器。
所述乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备工艺如下:将5 μL的石墨烯-纳米金溶液滴涂在预先处理的玻碳电极上,得到的石墨烯-纳米金玻碳电极用超纯水冲洗表面,然后滴涂5.0 μL 类水滑石-乙酰胆碱酯酶溶液的混合液(100 mU),这样就得到CLDH-AChE/GN-AuNPs/GCE传感器,在4 ℃干燥环境下保存备用。
附图说明
附图1 酶传感器修饰过程的交流阻抗表征图
附图2 纳米材料的扫描电镜表征图
附图3 酶传感器修饰过程的循环伏安组装图
附图4 酶传感器测试不同浓度农药的差分伏安表征图
附图5 农药浓度与抑制率的线性关系图。
具体实施方式
实施例:(1)乙酰胆碱酯酶传感器制备前玻碳电极的清洗,活化和性能测试,如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在 80 mV以下,并尽可能接近64 mV,所述玻碳电极可使用,否则要重新返回清洗步骤中,直到符合要求。(2) 制备煅烧类水滑石,将含有1.208 g的Cu(NO3)2·3H2O、3.846g的Mg(NO3)2·6H2O和3.751g的Al(NO3)3·9H2O的20 mL溶液在剧烈搅拌的条件下滴定到20 mL含有2.40 g NaOH和5.30 g NaHCO3的混合溶液中。产生的悬浮液在65 ℃下,搅拌1 h。得到的产物过滤并用去离子水清洗,直到溶液的pH为中性,然后在60 ℃下干燥两天,得到的产物为类水滑石。将制备好的类水滑石在马弗炉中500 ℃加热7 h,得到煅烧类水滑石。(3) 制备煅烧类水滑石-乙酰胆碱酯酶混合液,将煅烧类水滑石分散在去离子水中,搅拌一晚上制备煅烧类水滑石(2 mg/mL)的悬浮液。然后将乙酰胆碱酯酶溶液与类水滑石(2 mg/mL)悬浮液以1:1的体积比混合,得到煅烧类水滑石-乙酰胆碱酯酶混合液,将制备好的混合液储存在4 ℃的冰箱中。(4) 石墨烯-纳米金纳米复合物的制备,把2.0 mg石墨烯加入到105 μL 0.01 M HAuCl4·4H2O中,通过超声处理直到石墨烯分散均匀。然后将105 μL 0.01 M 的柠檬酸钠、10.0 mL乙醇和20.0 mL去离子水依次添加到上面的悬浮液中。将新鲜配制的125 μL 0.05 M 硼氢化钠溶液添加到上述混合物中,搅拌直到溶液颜色不再变化。然后再连续搅拌10 h,以16000 r/min的离心速度来使悬浮液分离,然后用去离子水洗涤几次,沉淀物在5 mL的pH值为7.5的磷酸盐缓冲溶液中再次分散,然后在4 ℃下存储在棕色瓶中。(5) 将5 μL的石墨烯-纳米金溶液滴涂在预先处理的玻碳电极上,在空气中干燥2 h,得到的石墨烯-纳米金玻碳电极用超纯水冲洗表面,将未固定在电极表面的复合物冲洗掉。然后滴涂5.0 μL 类水滑石-乙酰胆碱酯酶溶液的混合液(100 mU),并在室温下干燥2 h。在pH为7.5的磷酸盐缓冲溶液中小心洗涤去除未吸附上的酶,这样就得到CLDH-AChE/GN-AuNPs/GCE传感器,在4 ℃干燥环境下保存备用。(9) 将上述制备好的乙酰胆碱酯酶传感器在含有1.0 mM的氯化硫代乙酰胆碱的 pH 7.5 的磷酸盐缓冲溶液中以50 mV/s扫描速度进行循环伏安测试,电位窗口为0.5 V~0.7 V;(10) 配置毒死蜱标准溶液,农药测量时,将上述乙酰胆碱酯酶传感器浸入到不同浓度的农药标准溶液中10 min,然后在,含有1.0 mM氯化硫代乙酰胆碱 (ATCl) 的磷酸盐缓冲溶液中进行差分脉冲伏安扫描,抑制率I可由下式求得:
I(%)=(iP,
control−iP, exp)/iP, control×100%
其中iP, control和iP, exp分别为修饰电极未经过农药抑制和经过农药抑制后,在氯化硫代乙酰胆碱溶液中的峰电流,农药浓度与抑制率呈一定的线性关系,做出工作曲线图,得到农药浓度与抑制率之间的线性关系,以及检测限。(11) 乙酰胆碱酯酶生物传感器的精确性是通过组内偏差实验进行研究的。同一支电极进行六次重复测定获得组内变异系数,为4.1%;重复六次制备不同的电极对标准浓度农药测定获得组间变异系数,为6.9%。当电极不用时保存在4 ℃冰箱中,7天和30天后电流响应的变化得到此传感器的稳定性,7天后,电流没有明显变化,30天之后电流响应值降为原电流值的89%。(12) 把蔬菜彻底清洗干净并用去离子水清洗3次,喷洒上一定浓度的农药,放置 24 h 后,用10 mL 丙酮/ 0.1 M pH 7.5 磷酸盐缓冲溶液(1/9, v/v) 做溶剂超声处理 15 min,然后在进行离心处理 (10 min, 10000 rpm),得到的上清液用来检测实际样品的回收率,其回收率可以达到96.5%-107.1%。
[0016]
此制备方法操作工艺简单,成本较低,能提高免疫传感器的灵敏度、选择性等,符合我国免疫传感器制备方法发展和国际化的要求。
Claims (2)
1.一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法,其特征在于:制备石墨烯(GN)-纳米金(AuNPs)复合物,石墨烯具有特殊热性能和机械性能,并且具有高比表面积和优异的导电性,因此将石墨烯-纳米金纳米复合材料滴涂到电极表面,能够有效增大传感器的电流响应,较高的比表面积,石墨烯(GN)-纳米金(AuNPs)复合物制备步骤如下:
将2.0 mg石墨烯加入到105 μL 0.01 M HAuCl4·4H2O中,通过超声处理直到石墨烯分散均匀,然后将105 μL 0.01 M 的柠檬酸钠、10.0 mL乙醇和20.0 mL去离子水依次添加到上面的悬浮液中,将新鲜配制的125 μL 0.05 M 硼氢化钠溶液添加到上述混合物中,搅拌直到溶液颜色不再变化,然后再连续搅拌10
h,以16000 r/min的离心速度来使悬浮液分离,然后用去离子水洗涤几次,沉淀物在5 mL的pH值为7.5的磷酸盐缓冲溶液中再次分散,然后在4 ℃下存储在棕色瓶中。
2.如权利要求1 所述的一种检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法,其特征在于:将制备的煅烧类水滑石与乙酰胆碱酯酶混合的混合物滴涂到石墨烯-纳米金复合物修饰的工作电极表面,制备检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶生物传感器,其中制备煅烧类水滑石的步骤如下:
将含有1.208 g的Cu(NO3)2·3H2O、3.846g的Mg(NO3)2·6H2O和3.751g的Al(NO3)3·9H2O的20 mL溶液在剧烈搅拌的条件下滴定到20 mL含有2.40 g NaOH和5.30 g NaHCO3的混合溶液中,产生的悬浮液在65 ℃下,搅拌1 h,得到的产物过滤并用去离子水清洗,直到溶液的pH为中性,然后在60 ℃下干燥两天,得到的产物为类水滑石,将制备好的类水滑石在马弗炉中500 ℃加热7 h,得到煅烧类水滑石,制备煅烧类水滑石-乙酰胆碱酯酶混合液,将煅烧类水滑石分散在去离子水中,搅拌一晚上制备煅烧类水滑石的悬浮液;
石墨烯-纳米金纳米复合物修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器制备方法如下:
将乙酰胆碱酯酶溶液与类水滑石悬浮液以1:1的体积比混合,得到煅烧类水滑石-乙酰胆碱酯酶混合液,将制备好的混合液储存在4 ℃的冰箱中,将5 μL的石墨烯-纳米金溶液滴涂在预先处理的玻碳电极上,在空气中干燥2 h,得到的石墨烯-纳米金玻碳电极用超纯水冲洗表面,将未固定在电极表面的复合物冲洗掉,然后滴涂5.0 μL 类水滑石-乙酰胆碱酯酶溶液的混合液(100 mU),并在室温下干燥2 h,用pH为 7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗去除未吸附上的酶,获得石墨烯-纳米金纳米复合物修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
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C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |