CN105136887A

CN105136887A - 石墨烯/酶电化学生物传感器的制备及对有机磷农药残留的检测

Info

Publication number: CN105136887A
Application number: CN201510413424.5A
Authority: CN
Inventors: 李承勇; 莫日坚; 聂芳红
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Guangdong Ocean University
Priority date: 2015-07-14
Filing date: 2015-07-14
Publication date: 2015-12-09

Abstract

本发明通过改进hummers法制备氧化石墨烯，然后将氧化石墨烯(GO)-壳聚糖(CS)混合溶液修饰在玻碳电极(GCE)表面，再将乙酰胆碱酯酶(AChE)修饰到有GO-CS混合膜的GCE表面，形成氧化石墨烯-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶/玻碳电极(GO-CS-AChE/GCE)，构建了检测有机磷农药的石墨烯/酶电化学生物传感器。构建的酶生物传感器应用于西维因和敌百虫的检测，它们的线性范围分别为10～100nmol/L和10～60nmol/L，相关系数分别为0.993和0.994，经计算可知检出限均为3.3nmol/L(检出限为最低检测浓度的三分之一)。由此可知，石墨烯/酶电化学生物传感器具有灵敏度高，制备简单，操作方便等优点，可应用于有机磷农药的检测，为有机磷农药的检测提供了一种具有前景的技术。

Description

石墨烯/酶电化学生物传感器的制备及对有机磷农药残留的检测

技术领域

本发明涉及一种石墨烯/酶电化学生物传感器及其制备方法，该电化学生物传感器可应用于有机磷农药的检测，具有灵敏度高，制备简单，操作方便等优点。

背景技术

有机磷农药(organophosphoruspesticide,OPs)是一类高效、广谱的杀虫剂、除草剂，因其高的杀虫活性，在农业领域中被广泛使用。然而，有机磷农药的不当使用导致其大量残留，对环境和人类健康造成巨大威胁。有机磷农药中毒主要是OPs能抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，使乙酰胆碱(acetycholine,ATCl)过量积聚，引起中枢神经调节功能紊乱，导致呼吸系统破坏及死亡。因此，发展快速、灵敏、高效的超微农药检测的检测方法是具有重要意义的。

检测有机磷农药的传统分析方法，如分光光度法、滴定法、气相色谱法、液相色谱法、化学发光等已被广泛应用，虽然这些方法对农药残留的检测较为灵敏、可靠，但是存在仪器价格昂贵、检测耗时长、不适合现场检测、需要复杂的预处理步骤等缺点,为有机磷农药的检测带来了不便之处。而石墨烯/酶电化学生物传感器则是通过改变酶的活性，对有机磷农药进行检测的。由于石墨烯/酶电化学生物传感器具有检测快速、操作简单、成本低、灵敏度高等优点，所以，石墨烯/酶电化学生物传感器应用于有机磷农药的检测，可为有机磷农药的检测带来方便。

电极的表面修饰是构建电化学生物传感器至关重要的环节。目前修饰电极的材料主要有碳纳米管、C60、纳米金、纳米二氧化钛等，其中石墨烯由于具有独特的电学性质和催化性能，受到了广泛应用。氧化石墨烯(Graphiteoxide)是石墨烯重要的派生物，它的结构与石墨烯大体相同，但是氧化石墨表面含有大量功能性基团，如羟基、羧基、环氧基和羰基等，这些含氧官能团的存在使得氧化石墨烯的片层与片层之间摆脱了强大的π-π范德华吸引力，彼此分开。另外，由于大量亲水基团的存在，氧化石墨具有较好的亲水性，这也使得氧化石墨能以单片的形式分散在水溶液中，形成稳定的胶体溶液。因此，制备的氧化石墨烯既有功能基团的性质，又保有一定的导电能力。所以在制备检测有机磷农药的电化学生物传感器的过程中，氧化石墨烯是一个首选纳米材料。然而，在适合固定AChE的中性和碱性溶液中，氧化石墨烯并不稳定。因此需要寻找一种载体，使氧化石墨烯在中性和碱性溶液中，变得稳定。壳聚糖是天然产物，且具有良好的生物相容性、无毒性及高机械强度并且价格便宜等优点，所以被广泛选择作为固定载体。最近的研究表明，氧化石墨与壳聚糖同时在电极表面存放形成的复合膜在中性溶液和碱性溶液中具有良好的生物相容性和稳定性。

在本发明中，申请人通过改进hummers法制备氧化石墨烯，然后将氧化石墨烯(GO)-壳聚糖(CS)混合溶液修饰在玻碳电极(GCE)表面，再将乙酰胆碱酯酶(AChE)修饰到有GO-CS混合膜的GCE表面，形成氧化石墨烯-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶/玻碳电极(GO-CS-AChE/GCE)，构建了检测有机磷农药的石墨烯/酶电化学生物传感器，同时还检测了该石墨烯/酶电化学生物传感器对有机磷农药检测的灵敏度。

发明内容

本发明是鉴于现有技术中存在的上述问题而做出的，本发明的目的在于提供一种制备简单、成本低、稳定性高、能快速灵敏检测有机磷农药的石墨烯/酶电化学生物传感器。本发明还提供了该石墨烯/酶电化学生物传感器的制备方法及其用途。

具体地，本发明以玻碳电极作为基底电极，在其表面修饰了氧化石墨烯(GO)-壳聚糖(CS)混合膜，然后将AChE固定在GO-CS混合膜修饰的玻碳电极表面，构建了用于检测有机磷农药的电化学生物传感器。GO-CS复合膜具有氧化石墨特殊的电子传输性质和大的比表面积，同时，其能保持壳聚糖良好的生物相容性和AChE的活性，当GO-CS复合膜作为载体对有机磷农药进行检测时，既能保持生物传感器的稳定性，又能提高检测的灵敏度。进一步地，所述有机磷农药选自西维因和敌百虫，也可用于其他有机磷农药的检测

更具体地，通过改进的Hummers法制备氧化石墨烯(GO)，随后将氧化石墨烯与壳聚糖溶液混合制成氧化石墨烯(GO)-壳聚糖(CS)混合溶液，在玻碳电极表面上依次滴加GO-CS混合溶液和乙酰胆碱酯酶，从而获得乙酰胆碱酯酶-氧化石墨烯-壳聚糖修饰的玻碳电极(GO-CS-AChE/GCE)生物传感器。进一步地，所述壳聚糖溶液的浓度为0.05％-0.4％，优选为0.2％。所述乙酰胆碱酯酶的浓度为0.2-2.0mmol/l，优选为1.0mmol/l。

根据本发明的另一实施方案，提供了使用GO-CS-AChE/GCE检测有机磷农药如西维因和敌百虫的方法，所述方法包括将GO-CS-AChE/GCE浸入不同浓度西维因和敌百虫的标准溶液5min后，采用循环伏安曲线法，进行电化学检测，通过建立不同浓度的敌百虫和西维因标准曲线，计算出其检出限。结果表明构建的酶生物传感器应用于西维因和敌百虫的检测时，它们的线性范围分别为10～100nmol/L和10～60nmol/L，相关系数分别为0.993和0.994，经计算可知检出限均为3.3nmol/L(检出限为最低检测浓度的三分之一)。进一步地，西维因和敌百虫标准溶液的浓度为10～100nmol/L。

本发明的有益效果

由此可知，本发明的方法操作简单，检测快速，并且灵敏度高，弥补了传统光谱法和色谱法的样品处理繁琐、仪器价格昂贵等不足。此外，还将本发明制备的生物传感器应用于生菜样品的检测，并对酶的稳定性进行了检测。这些结果均表明，本发明的生物传感器具有优异的稳定性，高的灵敏度等优点，适用于有机磷农药的快速、灵敏检测。

附图说明

图1为制备本发明的乙酰胆碱酯酶-氧化石墨烯-壳聚糖修饰的玻碳电极(GO-CS-AChE/GCE)生物传感器的实验流程图。

图2(a)为氧化石墨烯(GO)的扫描电子显微镜(SEM)图。

图2(b)为氧化石墨烯(GO)的原子力显微镜(AFM)。

图2(c)为氧化石墨烯(GO)的X射线衍射(XRD)谱图。

图2(d)为氧化石墨烯(GO)的透射电子显微镜(TEM)图。

图2(e)为氧化石墨烯(GO)的高分辨透视电子显微镜(HRTEM)和选区电子衍射(SAED)图。

图3为GCE、GO-CS/GCE、AChE/GCE和GO-CS-AChE/GCE在0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中的循环伏安曲线图；扫描速率：100mV/s。

图4(a)为GO-CS-AChE/GCE在0.1mol/LPBS(pH＝7.0)随着ATCl浓度变化的循环伏安图，ATCl的浓度从0.2mmol/L到2.0mmol/L，扫描速率：100mV/s。

图4(b)为GO-CS-AChE/GCE在0.1mol/LPBS(pH＝7.0)随着ATCl浓度变化的峰电流图，ATCl的浓度变化从0.2mmol/L到2.0mmol/L。

图5(a)为GO-CS-AChE/GCE在0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中对不同浓度西维因的循环伏安响应曲线，扫描速率：100mV/s。

图5(b)为GO-CS-AChE/GCE对不同浓度西维因的峰电流标准曲线，标准工作曲线为10nmol/L～100nmol/L，支持电解质为0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)。

图5(c)为GO-CS-AChE/GCE对不同浓度西维因的抑制率曲线，标准工作曲线为10nmol/L～100nmol/L.，支持电解质为0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)。

图6(a)为GO-CS-AChE/GCE在0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中对不同浓度敌百虫的循环伏安响应曲线，其中敌百虫浓度为10nmol/L～100nmol/L，扫描速率：100mV/s。

图6(b)为GO-CS-AChE/GCE对不同浓度西维因的峰电流标准曲线，标准工作曲线为10nmol/L～60nmol/L，支持电解质为0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)。

图6(c)为GO-CS-AChE/GCE对不同浓度西维因的抑制率曲线，标准工作曲线为10nmol/L～60nmol/L.，支持电解质为0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)。

图7为GO-CS-AChE/GCE在0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中对生菜样品的循环伏安响应曲线，扫描速率：100mV/s。

图8(a)为GO-CS-AChE/GCE,在4℃下，保存不同时间后，在0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中的循环伏安曲线图，扫描速率：100mV/s。

图8(b)为GO-CS-AChE/GCE，在4℃下保存不同时间后，酶的活性保持率。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面，将对本发明的具体实施方式进行详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1.材料与设备

1.1材料

表1实验试剂

1.2仪器

表2实验仪器

2实验方法

2.1氧化石墨烯的制备

通过改进的Hummers法制备GO，其具体步骤如下：

(1)石墨烯的预氧化：在250mL圆底烧瓶中加入1gK₂S₂O₈、1gP₂O₅和2g石墨，接着再加入15mL浓硫酸，然后在80℃下加热反应6h；冷却到室温，用蒸馏水小心地稀释，用0.45μm微孔滤膜进行减压抽滤，并水洗至中性，得到预氧化产品；加入足量的丙酮溶液，超声1h，置于通风厨中将丙酮挥发。

(2)Hummers法氧化：取0.2g上述预氧化的石墨烯加入到4.6mL冰浓硫酸中，在搅拌下逐渐加入0.6g的KMnO₄；然后在35℃搅拌2h后，加入9.2mL蒸馏水；接着加入28mL水和0.5mLH₂O₂，并不断搅拌，直至溶液变为亮黄色，反应终止；得到棕黄色的GO水溶胶，将GO水溶胶过滤或离心，并用50mL的1:10的HCl清洗，除去金属离子，然后水洗、浓缩；最后将GO水溶胶透析，直至透析液至中性。

(3)GO的干燥：采用冷冻干燥法将透析至中性的GO水溶胶进行干燥，得到干燥的GO。

(4)超声剥离GO：取0.05g干燥的GO分散在100mL蒸馏水中，在100W下超声12h得到GO分散液。所得黄褐色分散液，使用离心机于3000rpm下离心10min以除去未剥离的GO，制备的GO溶液备用。

2.2氧化石墨烯-0.2％壳聚糖混合溶液的制备

称取0.2g壳聚糖缓慢加入100mL1％冰乙酸溶液中，搅拌至溶解，调pH至4.05，得到0.2％壳聚糖(pH4.05)溶液。

取1mL备用的GO溶液与1mL0.2％壳聚糖(pH4.05)溶液混合，在超声清洗仪中超声1h，获得均匀的氧化石墨烯-0.2％壳聚糖混合溶液(pH4.05)。

2.3修饰电极的制备

把玻碳电极放于0.05μmAl₂O₃粉末进行抛光，用二次蒸馏水清洗后，依次用无水乙醇、2.0mol/LKOH、2.0mol/LH₂SO₄及二次蒸馏水超声洗涤5min。超声结束后，用0.1mol/LH₂SO₄进行硫酸扫描，除去电极表面杂质，然后取出电极，用二次蒸馏水清洗电极表面，且在常温下干燥，最后通过以下步骤制备修饰电极：在处理好的玻碳电极表面滴加GO-0.2％CS混合溶液(pH4.05)和乙酰胆碱酯酶(25U/mL，含用来维持AChE稳定性的0.1mol/LPBS(pH＝7.0)溶液)各5.0μL，接着将获得GO-CS-AChE/GCE修饰电极置于4℃的冰箱中干燥备用。此外，在相同的条件下，制备AChE/GCE，作为GO-CS-AChE/GCE修饰电极的对照。

2.4检测步骤

将制备好的GO-CS-AChE/GCE分别浸入不同浓度的西维因标准溶液以及不同浓度的敌百虫标准溶液中5min，然后转移到10mL0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中，用循环伏安曲线测出其电流值，其中循环伏安电压为0.1V～1.0V。有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制率可由下式表达：

Inhibition(％)＝(I_p,control-I_p,exp)/I_p,control×100

其中I_p,control表示氧化石墨/壳聚糖/乙酰胆碱酯酶/玻碳电极在0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中的峰电流；I_p,exp表示浸泡过有机磷农药后，在0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中测得的峰电流。

2.5检测方法

将修饰好的电极放于0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)溶液中，通过电化学工作站，利用三电极反应体系，进行循环伏安扫描，获得循环伏安曲线。通过循环伏安曲线计算抑制率，可进行对有机磷农药残留的检测研究。

3.结果与讨论

3.1氧化石墨烯的表征

石墨烯结构的快速有效表征是研究其性质与应用的前提和基础。图2(a)是制备好的GO的扫描电子显微镜(SEM)图，显示了GO典型的褶皱片层结构。原子力显微镜(AFM)是表征石墨烯形貌和片层厚度的有力手段之一。AFM测试样品的制备方法是把GO的分散液滴涂于洁净的硅片表面，在室温下晾干。图2(b)给出了典型GO的AFM图，从中可以看出，经超声剥离的GO片层的平均厚度为0.6～1nm，比完美石墨烯片层的理论厚度0.34nm要大许多，而且表面粗糙，这主要是由于氧化过程使石墨烯片层两侧连接有许多的羟基、环氧基、羧基等官能团，破坏了石墨烯原有的共轭结构，表面产生晶格缺陷，使得石墨烯片层产生褶皱或发生扭曲所致。图2(c)是GO的X射线衍射(XRD)图谱，从中可以看出在2θ为11.2°左右有一个明显的衍射峰，此峰为石墨晶体的(002)特征衍射峰(记为GP002)，d002＝0.79nm，峰形窄且尖锐，表明所选用石墨原料的结晶度较好。除AFM表征之外，还通过透射电子显微镜(TEM)观察了石墨烯的形貌，结果如图2(d-e)所示。图2(d)为石墨烯的TEM表征图，结果显示，石墨烯为有褶皱的片状结构，且呈无序分布，彼此重叠在一起。石墨烯的这种结构可能来自于其结构缺陷。图2(e)为高分辨的TEM图和选区电子衍射图，从衍射图案可以看出，石墨烯具有较完整的晶体结构。而且，从高分辨的TEM图中能清晰地看出对应于石墨烯(002)晶面的晶格条纹，经计算，相邻两晶面的间距约为0.35nm，这与单层石墨的(002)晶面间距的理论值(0.335nm)非常接近。

3.2修饰电极的电化学行为

图3为四种电化学生物传感器在0.1mol/LPBS(pH＝7.0)溶液中的循环伏安曲线。其中GCE和GO-CS/GCE生物传感器在0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中没有氧化还原峰出现，这说明了GCE和GO-CS/GCE生物传感器对氯化乙酰硫代胆碱没有响应。而AChE/GCE和GO-CS-AChE/GCE生物传感器在0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中，产生了一个很明显的电流信号。显然，这一电流信号来源于AChE催化ATCl水解产生氯化硫代胆碱的氧化过程，而该过程是不可逆的。此外，GO-CS-AChE/GCE生物传感器产生的氧化峰电流比其他的高，这表明GO-CS提高了生物传感器的导电性。

3.3乙酰胆碱浓度对生物传感器电流响应的影响

在pH为7.0的0.1mol/LPBS中加入不同浓度的乙酰胆碱(ATCl)溶液，研究不同浓度ATCl对传感器电流响应的影响。

图4表明，在0.1mol/LPBS(pH＝7.0)溶液中，加入不同浓度ATCl溶液后，GO-CS-AChE/GCE生物传感器的电流响应，其结果显示：随着ATCl浓度的上升，生物传感器电流响应也增大。其中，ATCl浓度对生物传感器电流响应的区域有两部分：一是ATCl浓度从0.1mmol/L到1.0mmol/L；二是ATCl浓度从1.0mmol/L到2.0mmol/L。从图4可得，ATCl浓度范围在0.2～1.0mmol/L时，响应电流随ATCl浓度的上升而快速地增大，随后，随着ATCl浓度的上升，响应电流趋于稳定状态。当浓度从0.2mmol/L增加1.0mmol/L时，峰电流约增加了10.21μA，而从1mmol/L到2mmol/L，峰电流约增加了1.30μA；因此，在后面的实验中，ATCl的浓度选择为1.0mmol/L。

3.4不同浓度西维因的检测

将修饰好的玻碳电极分别浸入不同浓度的西维因标准溶液中5min，然后放入0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中，选用循环伏安法进行电化学检测。

图5(a)为循环伏安曲线图，表明了未浸泡在西维因中的生物传感器所产生的电流信号最大，但随着西维因标准溶液浓度的增加，生物传感器的电流信号逐渐减小。从图5(b)可以观察到，随着西维因标准溶液浓度的增加，GO-CS-AChE/GCE生物传感器的峰电流明显下降。峰电流下降主要由AChE的活性降低从而导致产生的胆碱减少引起的。西维因作为一种氨基甲酸酯类农药，具有较高的毒性，造成AChE活性的不可逆抑制，从而使AChE催化ATCl水解产生胆碱的量就减少。在高浓度下，西维因对AChE活性的抑制接近峰值，这表明西维因对AChE活性产生了最大的抑制率。而图5(c)则是根据GO-CS-AChE/GCE生物传感器对不同浓度西维因的电流响应而得出的循环伏安曲线，并在其中找出最大峰电流，从而得出西维因对AChE活性的抑制率标准曲线图。此标准曲线表明，随着西维因标准溶液浓度的增加，AChE活性的抑制率逐渐上升，而且在最佳的实验条件下，西维因对AChE活性的抑制率的线性范围为10nmol/L～100nmol/L，相关系数为0.993。按照浓度与抑制率的关系，可以推算出西维因的检出限为3.3nmol/L。

3.5不同浓度敌百虫的检测

将修饰好的玻碳电极分别浸入不同浓度的敌百虫标准溶液中5min，然后放入0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中，选用循环伏安法进行电化学检测。

图6(a)为循环伏安曲线图，表明了未浸泡在敌百虫中的生物传感器所产生的电流信号最大，但随着敌百虫标准溶液浓度的增加，生物传感器的电流信号逐渐减小。从图6(b)可以观察到，随着敌百虫标准溶液浓度的增加，GO-CS-AChE/GCE生物传感器的峰电流明显下降。峰电流下降主要由AChE的活性降低从而导致产生的胆碱减少引起的。敌百虫作为一种氨基甲酸酯类农药，因其具有较高的毒性且造成AChE活性的不可逆的抑制，从而使AChE催化ATCl水解产生胆碱的量就减少。在高浓度下，敌百虫对AChE活性的抑制接近峰值，这表明西维因对AChE活性产生了最大的抑制率。而图6(c)则是根据GO-CS-AChE/GCE生物传感器对不同浓度敌百虫的电流响应而得出的循环伏安曲线，并在其中找出最大峰电流，从而得出敌百虫对AChE活性的抑制率标准曲线图。此曲线表明，随着敌百虫标准溶液浓度的增加，AChE活性的抑制率逐渐上升，而且在最佳的实验条件下，敌百虫对AChE活性的抑制率的线性范围为10nmol/L～60nmol/L，相关系数为0.994。按照浓度与抑制率的关系，可以推算出敌百虫的检出限为3.3nmol/L。

3.6样品检测

为了考察该修饰电极的实际应用的可能性，我们对生菜样品进行了检测。用缓冲溶液洗涤生菜样品表面，得到的溶液经定容后，将该修饰电极放入该溶液中浸泡5min，然后再放入0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中，采用循环伏安法测出其电流值(如图7)。从中可知，生菜样品中有有机磷农药的残留，由于响应信号与有机磷农药残留量成反比，因此该生菜样品的有机磷农药残留较少。将测得的结果，与西维因和敌百虫抑制率标准曲线进行比较可知，若有机磷农药仅仅是西维因，则残留量大约为0.02μmol/L，若有机磷农药仅仅是敌百虫，其残留量约为0.02μmol/L。为了做对照，将该生菜溶液采用紫外分光光度计检测，检测结果如表3，从表中可知，样品组合对照组的吸光度值没有明显的变化。综上可知，采用石墨烯/酶电化学生物传感器检测有机磷农药的灵敏度较传统的紫外分光光度计法高。

表3紫外分光光度计检测生菜的数据

3.7酶的稳定性

将修饰好的GO-CS-AChE/GCE，放在4℃冰箱中保存不同的时间，然后放入0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中，进行循环伏安扫描。

从图8(a)中可观察到，当酶电极不使用时，放在4℃冰箱中保存13天后，在GO-CS-AChE/GCE的电流响应信号并没有明显的下降。从图8(b)中可以得到，保存13天后，酶的活性保持率并没有明显变化。结果显示，所制备的石墨烯/酶电化学生物传感器具有良好的稳定性。

本发明通过改进hummers法制备氧化石墨烯，然后将GO-CS混合溶液修饰在GCE表面，形成可以固定AChE的GO-CS混合膜，再将AChE修饰到有GO-CS混合膜的GCE表面，形成GO-CS-AChE/GCE，构建了检测有机磷农药的石墨烯/酶电化学生物传感器。将GO-CS-AChE/GCE分别浸泡在不同浓度西维因和敌百虫标准溶液中5min，在放在0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中，进行电化学检测。结果显示：它们的线性范围分别为10～100nmol/L和10～60nmol/L，相关系数分别为0.993和0.994，经计算可知检出限分别为3.3nmol/L和3.3nmol/L。为了考察该酶传感器的实际应用的可能性，对生菜样品进行检测，此外，为了与传统的紫外分光光度计法进行对比，将生菜样品进行紫外分光光度计检测。检测结果显示：在电化学传感器中有响应信号，即有有机磷农药残留，而在紫外分光光度计中并无变化，由此，可知生物传感器的灵敏度高于紫外分光光度计。为了探讨酶的稳定性，将在4℃冰箱中保存不同时间的制备好的电极，分别放在0.1mol/LPBS(c(ATCl)＝1.0mmol，pH＝7.0)中，进行电化学检测。结果显示：制备好的电极放于4℃冰箱中保存13天后，GO-CS-AChE/GCE的电流响应信号并没有明显的下降，由此可知，功能石墨烯生物传感器具有良好的生物稳定性。

综上所述，本发明所制备的石墨烯/酶电化学生物传感器具有灵敏度高、操作方便，生物稳定性好等优点，可应用于有机磷农药的检测，为农药检测提供了一个新的具有前景的工具。

以上所述的具体实施方式仅用于具体说明本发明的精神，本发明的保护范围并不局限于此，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过变更、置换或变型的方式轻易做出其它的实施方式，这些其它的实施方式都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.氧化石墨烯-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶/玻碳电极生物传感器，其中在所述玻碳电极表面修饰有氧化石墨烯(GO)-壳聚糖(CS)混合溶液，在GO-CS混合膜修饰的玻碳电极表面上还修饰有乙酰胆碱酯酶(AChE)。

2.根据权利要求1的氧化石墨烯-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶/玻碳电极生物传感器，其中所述氧化石墨烯(GO)-壳聚糖(CS)混合溶液中的壳聚糖溶液的浓度为0.05％-0.4％，优选为0.2％。

3.根据权利要求1或2的氧化石墨烯-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶/玻碳电极生物传感器，其中所述氧化石墨烯(GO)-壳聚糖(CS)混合溶液为氧化石墨烯-0.2％壳聚糖混合溶液。

4.根据权利要求1-3中任一项的氧化石墨烯-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶/玻碳电极生物传感器，其中所述氧化石墨烯(GO)-壳聚糖(CS)混合溶液中的乙酰胆碱酯酶的浓度为0.2-2.0mmol/l，优选为1.0mmol/l。

5.制备权利要求1-4中任一项的氧化石墨烯-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶/玻碳电极生物传感器的方法，所述方法包括以玻碳电极作为基底电极，在其表面修饰了氧化石墨烯(GO)-壳聚糖(CS)混合溶液，然后将乙酰胆碱酯酶固定在GO-CS混合膜修饰的玻碳电极表面。

6.根据权利要求5的方法，其中所述氧化石墨烯(GO)-壳聚糖(CS)混合溶液通过将氧化石墨烯与壳聚糖溶液混合制成。

7.根据权利要求6的方法，其中所述壳聚糖溶液的浓度为0.05％-0.4％g/ml，优选为0.2％g/ml。

8.根据权利要求5-7中任一项的方法，其中所述乙酰胆碱酯酶的浓度为0.2-2.0mmol/l，优选为1.0mmol/l。

9.使用权利要求1-4中任一项的氧化石墨烯-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶/玻碳电极生物传感器检测有机磷农药的方法，所述方法包括将氧化石墨烯-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶/玻碳电极浸入不同浓度的有机磷农药的标准溶液5min后，采用循环伏安曲线法，进行电化学检测，通过建立不同浓度的敌百虫和西维因标准曲线，计算出其检出限。

10.根据权利要求9的方法，其中所述有机磷农药选自西维因和敌百虫，也可用于其他有机磷农药的检测。

11.根据权利要求10的方法，其中所述西维因或敌百虫标准溶液的浓度为10～100nmol/L。

12.根据权利要求1-4中任一项的氧化石墨烯-壳聚糖-乙酰胆碱酯酶/玻碳电极生物传感器在检测有机磷农药中的用途。

13.根据权利要求12的用途，其中所述有机磷农药选自西维因和敌百虫，也可用于其他有机磷农药的检测。