CN114487044B - 检测有机磷农药的电化学酶生物传感器制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器、制备方法及应用，属于电化学分析领域。所述电化学酶生物传感器是由共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料与乙酰胆碱酯酶依次修饰在玻碳电极表面制备而成，其中共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料以多壁碳纳米管为载体，在载体表面形成共价有机框架材料。采用三电极体系，即参比电极为银/氯化银电极，对电极为铂丝电极，工作电极由共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料和乙酰胆碱酯酶依次修饰在玻碳电极表面组成，采用差分脉冲伏安法对马拉硫磷进行检测。本发明构建的电化学酶生物传感器具有灵敏度高、制备方法简单、选择性高等优点，在有机磷农药残留的检测领域有很好的应用前景及价值。

Description

检测有机磷农药的电化学酶生物传感器制备方法及应用
技术领域
本发明属于电化学分析领域，涉及一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器、制备方法及应用。
背景技术
随着人们生活水平的提高，为提高农业生产力，农药在农业生产活动中得到了广泛的应用。农药可被分为有机磷农药、有机氯农药、氨基甲酸酯类农药及拟除虫菊酯类农药等。然而，在实际应用过程中，只有约0.1％的农药能发挥其作用，90％以上的农药会通过生物降解、水解、光解、蒸发、地表径流等过程进入到环境中，对环境造成负面影响；同时残留在水、土壤、农产品中的微量农药可以通过消化道、呼吸道、皮肤等途径进入人体，导致慢性中毒，从而引起各种生理病变。因此，开发一种快速、灵敏、方便、低成本、易操作的检测农药的方法至关重要。
常见的农药检测技术主要有气相色谱法、高效液相色谱法、色谱-质谱联用法等，这些方法大都依赖实验室大型仪器，且具有前处理复杂、检测周期长等不足，难以在短期内实现大量样品的筛查及检测。相比之下，电化学传感器法具有分析响应快速，灵敏度高，且所需仪器经济、简便，易于微型化、自动化等特点。其中，电化学酶生物传感器应用广泛，已有多种材料被应用于酶的固定，例如碳纳米材料、金属纳米材料、金属有机框架材料等，近年来，共价有机框架材料由于比表面积大、稳定性好等优点备受关注。
发明内容
本发明目的是提出一种可用于超灵敏检测有机磷农药的新型电化学酶生物传感器，其具有操作简便、灵敏度高、稳定性好、选择性好等优点。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器，是由共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料与乙酰胆碱酯酶依次修饰在玻碳电极表面制备而成，其中共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料以多壁碳纳米管为载体，在载体表面形成共价有机框架材料。
一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料
将多壁碳纳米管分散于1-丁醇及1,2-二氯苯的混合溶液中得到分散液A，其中，每6mL 的1-丁醇及1,2-二氯苯的混合溶液中对应加入3～24mg的多壁碳纳米管，且混合溶液中1- 丁醇与1,2-二氯苯的体积比为1：1。
将2,5-二羟基对苯二甲醛、1,3,5-三(4-氨苯基)苯分别分散于乙酸中得到分散液B、分散液C，其中，2,5-二羟基对苯二甲醛、1,3,5-三(4-氨苯基)苯的摩尔比为3:2(由于两种物质的反应过程在短时间内即可完成，因此是先将一种反应物与碳管混合均匀，再加入另一种反应物，这样可以保证COF比较均匀的生长在碳管表面)，每0.6mL的乙酸中对应加入0.2-0.3mmol 的2,5-二羟基对苯二甲醛。
超声将均匀的分散液AB混合后再与分散液C混匀，其中，分散液A、分散液B、分散液C的体积比为10：1：1，过程中涉及到的溶剂都经过预除氧。
随后，将混合物在80-150℃的条件下密封反应12-72小时，所得沉淀分别用四氢呋喃和无水乙醇洗涤24h，真空干燥过夜得共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料。
(2)制备乙酰胆碱酯酶溶液
将乙酰胆碱酯酶储备液与壳聚糖溶液按1:1的体积比混合均匀后，可得乙酰胆碱酯酶溶液；其中，乙酰胆碱酯酶储备液的酶活性浓度为100U/mL，壳聚糖溶液的质量分数为0.2％，乙酰胆碱酯酶溶液的酶活性浓度为50U/mL。
(3)室温下，将步骤(1)得到的共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料分散在蒸馏水和壳聚糖的混合溶液中，其中共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料的浓度为0.1～1.0mg mL-1，壳聚糖溶液的质量分数为0.1wt％，经超声分散后可得共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料分散液。
(4)对玻碳电极进行抛光打磨处理。
(5)取10μL步骤(3)得到的复合材料分散液滴涂在经步骤(4)处理的玻碳电极表面，室温下晾干，其中玻碳电极的直径为3mm；继续滴涂2～10μL步骤(2)得到的乙酰胆碱酯酶溶液，即得到乙酰胆碱酯酶/共价有机框架/多壁碳纳米管/壳聚糖复合电极。
(6)采用三电极体系，以步骤(5)所得的复合电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，得到电化学酶生物传感器。
本发明提供了一种基于上述方法制备的电化学酶生物传感器用于检测马拉硫磷的方法，具体步骤如下：
(1)绘制马拉硫磷标准曲线
用磷酸缓冲溶液配制不同浓度的马拉硫磷溶液，马拉硫磷的浓度范围为1×10- 9mol L-1～ 1×10-5mol L-1，将制备好的电化学酶生物传感器浸入上述不同浓度的马拉硫磷溶液中孵育，孵育后的电极置于氯化乙酰硫代胆碱溶液，采用差分脉冲伏安法测量响应电流，空白样品的电流值记为I0，含有马拉硫磷样品的电流值记为Ii，二者的电流差值I0-Ii与初始电流I0的比值即为马拉硫磷对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率，采用线性回归方法得到抑制率与马拉硫磷浓度的关系，并绘制标准曲线。
(2)实际样品检测
将制备的电化学酶生物传感器用于检测实际样品中的马拉硫磷，将利用差分脉冲伏安法测得到电流值计算得到对应的抑制率，代入步骤(1)得到的标准曲线即可计算实际样品中马拉硫磷的浓度。
本发明的有益效果是：共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料可以在提高材料的比表面积的同时提高其导电性，本发明首次将共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料应用于乙酰胆碱酯酶的固定，构建检测有机磷农药的电化学酶生物传感器。本发明所述的有机磷农药的检测方法具有操作简便、灵敏度高、选择性好、稳定性强、检测快速等优点。
附图说明
图1为多壁碳纳米管(A)、共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料(B)的透射电镜图(TEM)；
图2为裸电极(a)、共价有机框架材料修饰电极(b)、共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料修饰电极(c)、乙酰胆碱酯酶/共价有机框架/多壁碳纳米管/壳聚糖复合材料修饰电极 (d)在含0.1mol L-1氯化钾的1.0mmol L-1铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中测得的循环伏安曲线图(CV)；
图3为在不同浓度的马拉硫磷溶液中孵育后测得的差分脉冲伏安图(DPV)；
图4为抑制率与马拉硫磷浓度之间的线性关系图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，结合以下实施例具体说明，但有必要指出，以下实施例只用于对本发明内容的描述，而非以任何方式限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域其他技术人员在没有脱离本发明理论的前提下所获得的其他实例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器的制备方法：
(1)制备共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料
将多壁碳纳米管分散于1-丁醇及1,2-二氯苯的混合溶液中得到分散液A，其中，每6mL 的1-丁醇及1,2-二氯苯的混合溶液中对应加入3mg的多壁碳纳米管，且混合溶液中1-丁醇与 1,2-二氯苯的体积比为1：1。
将2,5-二羟基对苯二甲醛、1,3,5-三(4-氨苯基)苯分别分散于乙酸中得到分散液B、分散液 C，其中，2,5-二羟基对苯二甲醛、1,3,5-三(4-氨苯基)苯的摩尔比为3:2，每0.6mL的乙酸中对应加入0.2mmol的2,5-二羟基对苯二甲醛。
超声将均匀的分散液AB混合后再与分散液C混匀，其中，分散液A、分散液B、分散液C的体积比为10：1：1，过程中涉及到的溶剂都经过预除氧。
随后，将混合物在80℃的条件下密封反应24小时，所得沉淀分别用四氢呋喃和无水乙醇洗涤24h，真空干燥过夜得共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料。
(2)制备乙酰胆碱酯酶溶液
将乙酰胆碱酯酶储备液与壳聚糖溶液按1:1的体积比混合均匀后，可得乙酰胆碱酯酶溶液；其中，乙酰胆碱酯酶储备液的单位酶活为100U/mL，壳聚糖溶液的质量分数为0.2％，乙酰胆碱酯酶溶液的单位酶活为50U/mL。
(3)室温下，将步骤(1)得到的共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料分散在蒸馏水和壳聚糖的混合溶液中，其中共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料的浓度为1.0mg mL-1，壳聚糖溶液的质量分数为0.1wt％，经超声分散后可得共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料分散液。
(4)对玻碳电极进行抛光打磨处理。
(5)取10μL步骤(3)得到的复合材料分散液滴涂在经步骤(4)处理的玻碳电极表面，室温下晾干，其中玻碳电极的直径为3mm；继续滴涂2μL步骤(2)得到的乙酰胆碱酯酶溶液，即得到乙酰胆碱酯酶/共价有机框架/多壁碳纳米管/壳聚糖复合电极。
(6)采用三电极体系，以步骤(5)所得的复合电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，得到电化学酶生物传感器。
实施例2
一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器的制备方法：
(1)制备共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料
将多壁碳纳米管分散于1-丁醇及1,2-二氯苯的混合溶液中得到分散液A，其中，每6mL 的1-丁醇及1,2-二氯苯的混合溶液中对应加入24mg的多壁碳纳米管，且混合溶液中1-丁醇与1,2-二氯苯的体积比为1：1。
将2,5-二羟基对苯二甲醛、1,3,5-三(4-氨苯基)苯分别分散于乙酸中得到分散液B、分散液 C，其中，2,5-二羟基对苯二甲醛、1,3,5-三(4-氨苯基)苯的摩尔比为3:2，每0.6mL的乙酸中对应加入0.3mmol的2,5-二羟基对苯二甲醛。
超声将均匀的分散液AB混合后再与分散液C混匀，其中，分散液A、分散液B、分散液C的体积比为10：1：1，过程中涉及到的溶剂都经过预除氧。
随后，将混合物在150℃的条件下密封反应12小时，所得沉淀分别用四氢呋喃和无水乙醇洗涤24h，真空干燥过夜得共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料。
(2)制备乙酰胆碱酯酶溶液
将乙酰胆碱酯酶储备液与壳聚糖溶液按1:1的体积比混合均匀后，可得乙酰胆碱酯酶溶液；其中，乙酰胆碱酯酶储备液的单位酶活为100U/mL，壳聚糖溶液的质量分数为0.2％，乙酰胆碱酯酶溶液的单位酶活为50U/mL。
(3)室温下，将步骤(1)得到的共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料分散在蒸馏水和壳聚糖的混合溶液中，其中共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料的浓度为0.1mg mL-1，壳聚糖溶液的质量分数为0.1wt％，经超声分散后可得共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料分散液。
(4)对玻碳电极进行抛光打磨处理。
(5)取10μL步骤(3)得到的复合材料分散液滴涂在经步骤(4)处理的玻碳电极表面，室温下晾干，其中玻碳电极的直径为3mm；继续滴涂6μL步骤(2)得到的乙酰胆碱酯酶溶液，即得到乙酰胆碱酯酶/共价有机框架/多壁碳纳米管/壳聚糖复合电极。
(6)采用三电极体系，以步骤(5)所得的复合电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，得到电化学酶生物传感器。
实施例3
一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器的制备方法：
(1)制备共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料
将多壁碳纳米管分散于1-丁醇及1,2-二氯苯的混合溶液中得到分散液A，其中，每6mL 的1-丁醇及1,2-二氯苯的混合溶液中对应加入12mg的多壁碳纳米管，且混合溶液中1-丁醇与1,2-二氯苯的体积比为1：1。
将2,5-二羟基对苯二甲醛、1,3,5-三(4-氨苯基)苯分别分散于乙酸中得到分散液B、分散液 C，其中，2,5-二羟基对苯二甲醛、1,3,5-三(4-氨苯基)苯的摩尔比为3:2，每0.6mL的乙酸中对应加入0.24mmol的2,5-二羟基对苯二甲醛。
超声将均匀的分散液AB混合后再与分散液C混匀，其中，分散液A、分散液B、分散液C的体积比为10：1：1，过程中涉及到的溶剂都经过预除氧。
随后，将混合物在120℃的条件下密封反应72小时，所得沉淀分别用四氢呋喃和无水乙醇洗涤24h，真空干燥过夜得共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料。
其中多壁碳纳米管(A)、共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料(B)的透射电镜图如附图1所示。
(2)制备乙酰胆碱酯酶溶液
将乙酰胆碱酯酶储备液与壳聚糖溶液按1:1的体积比混合均匀后，可得乙酰胆碱酯酶溶液；其中，乙酰胆碱酯酶储备液的单位酶活为100U/mL，壳聚糖溶液的质量分数为0.2％，乙酰胆碱酯酶溶液的单位酶活为50U/mL。
(3)室温下，将步骤(1)得到的共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料分散在蒸馏水和壳聚糖的混合溶液中，其中共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料的浓度为0.5mg mL-1，壳聚糖溶液的质量分数为0.1wt％，经超声分散后可得共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料分散液。
(4)对玻碳电极进行抛光打磨处理。
(5)取10μL步骤(3)得到的复合材料分散液滴涂在经步骤(4)处理的玻碳电极表面，室温下晾干，其中玻碳电极的直径为3mm；继续滴涂10μL步骤(2)得到的乙酰胆碱酯酶溶液，即得到乙酰胆碱酯酶/共价有机框架/多壁碳纳米管/壳聚糖复合电极。
通过检测不同修饰电极在铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液中的电化学响应，考察不同电极的导电性，结果如附图2所示。可以发现，与裸电极相比(a)，共价有机框架材料修饰电极导电性较差(b)；而当共价有机框架材料以多壁碳纳米管为载体合成后，其导电性有了明显的提高(c)；当乙酰胆碱酯酶修饰到电极表面后，乙酰胆碱酯酶/共价有机框架/多壁碳纳米管/壳聚糖复合电极的导电性再次下降(d)，可证明乙酰胆碱酯酶的成功固定。
(6)采用三电极体系，以步骤(5)所得的复合电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，得到电化学酶生物传感器。
实施例4
一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器的应用：
将实施例3所得的电化学酶生物传感器用于检测马拉硫磷，步骤如下：
(1)确定磷酸缓冲溶液的最佳pH
用pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的0.1mol L-1磷酸缓冲溶液配制浓度为1.0mmol L-1的氯化乙酰硫代胆碱溶液，将实施例3所得的乙酰胆碱酯酶/共价有机框架/多壁碳纳米管/ 壳聚糖复合电极作为工作电极，采用差分脉冲伏安法检测硫代胆碱的响应电流，参数设置为：电位范围0.3～0.85V，电位增量为0.004V，振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，脉冲周期为 0.5s。通过比较不同条件下的响应电流值，确定本实例中的磷酸缓冲溶液的最佳pH值为7.0。
(2)确定氯化乙酰硫代胆碱溶液的最佳浓度
用步骤(1)中确定的pH值为7.0的缓冲溶液，将氯化乙酰硫代胆碱分别配制为以下浓度：0.2mmol L-1、0.4mmol L-1、0.6mmol L-1、0.8mmol L-1、1.0mmol L-1、1.2mmol L-1，采用与步骤(1)中相同的方法与条件，通过比较不同条件下的响应电流值，确定本实例中的氯化乙酰硫代胆碱溶液的最佳浓度为1.0mmol L-1。
(3)确定电极在马拉硫磷溶液中的最佳孵育时间
将实施例3所得的乙酰胆碱酯酶/共价有机框架/多壁碳纳米管/壳聚糖复合电极置于浓度为1×10-6mol L-1的马拉硫磷溶液中抑制2min、4min、6min、8min、10min、12min、14min、后，置于1.0mmol L-1的氯化乙酰硫代胆碱溶液中，采用与步骤(1)中相同的方法与条件，通过比较不同条件下的响应电流值，确定本实例中的最佳孵育时间为10min。
(4)绘制马拉硫磷标准曲线
用磷酸缓冲溶液配制马拉硫磷溶液，浓度分别为1×10-9mol L-1、1×10-8mol L-1、1×10-7 mol L-1、5×10-7mol L-1、1×10-6mol L-1、5×10-6mol L-1、1×10-5mol L-1，将实施例3所得的电化学酶生物传感器浸入上述不同浓度的马拉硫磷溶液中孵育10min，孵育后的电极置于 1.0mmol L-1的氯化乙酰硫代胆碱溶液，采用差分脉冲伏安法测量响应电流，空白样品的电流值记为I0，含有马拉硫磷样品的电流值记为Ii，二者的电流差值I0-Ii与初始电流I0的比值即为马拉硫磷对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率，采用线性回归方法得到抑制率与马拉硫磷浓度的关系，并绘制标准曲线，结果如附图3、4所示，所得回归方程为I(％)＝7.76461logC(mol L-1) +83.57282(R2＝0.99513)，检测限为5×10-10mol L-1。
(5)实际样品检测
本发明选用自来水和菠菜作为实际样品，自来水用0.22μm的滤膜过滤，用于后续测定；菠菜样品用乙腈对马拉硫磷进行提取，将实施例3所得的乙酰胆碱酯酶/共价有机框架/多壁碳纳米管/壳聚糖复合电极置于上述溶液中孵育10min，孵育后的电极置于1.0mmolL-1的氯化乙酰硫代胆碱溶液中，采用与步骤(1)中相同的方法与条件，测定响应电流值。实际样品的回收率在96.0％-105.0％之间，RSD小于5％，说明本发明所制备的电化学酶生物传感器在实际样品的检测过程中有良好的精确度，因此可以应用于实际样品中马拉硫磷的测定。
以上所述实施例仅表达本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利的范围的限制，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种检测有机磷农药的电化学酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的电化学酶生物传感器是由共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料与乙酰胆碱酯酶依次修饰在玻碳电极表面制备而成，其中共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料以多壁碳纳米管为载体，在载体表面形成共价有机框架材料；
所述的制备方法包括如下步骤：
（1）制备共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料
将多壁碳纳米管分散于1-丁醇及1,2-二氯苯的混合溶液中得到分散液A，其中，每6 mL的1-丁醇及1,2-二氯苯的混合溶液中对应加入3 ~ 24 mg的多壁碳纳米管，且混合溶液中1-丁醇与1,2-二氯苯的体积比为1：1；
将2,5-二羟基对苯二甲醛、1,3,5-三(4-氨苯基)苯分别分散于乙酸中得到分散液B、分散液C，其中，2,5-二羟基对苯二甲醛、1,3,5-三(4-氨苯基)苯的摩尔比为3:2，每0.6 mL的乙酸中对应加入0.2-0.3 mmol的2,5-二羟基对苯二甲醛；
超声将均匀的分散液AB混合后再与分散液C混匀，其中，分散液A、分散液B、分散液C的体积比为10：1：1，其中制备过程中涉及到的溶剂都经过预除氧；
最后将混合物在80-150℃的条件下密封反应12-72小时，所得沉淀分别用四氢呋喃和无水乙醇洗涤，真空干燥后得共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料；
（2）制备乙酰胆碱酯酶溶液
将乙酰胆碱酯酶储备液与壳聚糖溶液按1:1的体积比混合均匀后，得到乙酰胆碱酯酶溶液；
（3）室温下，将步骤（1）得到的共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料分散在蒸馏水和壳聚糖的混合溶液中，其中共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料的浓度为0.1 ~ 1.0 mgmL-1，壳聚糖溶液的质量分数为0.1 wt%，经超声分散后得到共价有机框架/多壁碳纳米管复合材料分散液；
（4）对玻碳电极进行抛光打磨处理；
（5）将步骤（3）得到的复合材料分散液滴涂在经步骤（4）处理的玻碳电极表面，室温下晾干后，继续滴涂步骤（2）得到的乙酰胆碱酯酶溶液，得到乙酰胆碱酯酶/共价有机框架/多壁碳纳米管/壳聚糖复合电极；
（6）采用三电极体系，以步骤（5）所得的复合电极为工作电极，铂丝电极为对电极，银/氯化银电极为参比电极，得到电化学酶生物传感器。
2.根据权利要求1所述的检测有机磷农药的电化学酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，乙酰胆碱酯酶储备液的酶活性浓度为100 U / mL，壳聚糖溶液的质量分数为0.2%，乙酰胆碱酯酶溶液的酶活性浓度为50 U / mL。
3.根据权利要求1所述的检测有机磷农药的电化学酶生物传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中，首先将10 µL复合材料分散液滴涂在直径为3 mm的玻碳电极表面，晾干后再滴涂2 ~ 10 µL乙酰胆碱酯酶溶液。
4.一种基于权利要求1-3所述的制备方法制备的电化学酶生物传感器的应用，其特征在于，用于检测马拉硫磷。
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