CN106882797A - 一种共价有机框架修饰的石墨烯材料及其合成方法和应用 - Google Patents

一种共价有机框架修饰的石墨烯材料及其合成方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新型纳米材料技术领域，具体为一种共价有机框架修饰的石墨烯材料及其合成方法和应用。本发明先采用一锅法合成磁性石墨烯材料，再将磁性石墨烯分散在1,3,5‑三甲基苯和1,4‑二氧六环的溶液中，加入1,4‑苯二硼酸和2,3,6,7,10,11‑六羟基三苯两种单体，在室温下超声反应，制得共价有机框架修饰的磁性石墨烯复合材料。实验表明，该材料具有疏松多孔结构、大的比表面积和稳定的生物相容性，利用该复合材料在生物分子的富集研究中具有反应效率高、特异性强、稳定性好等优点，实现对多种复杂混合样品的高效鉴定。本发明成本低廉，操作简单，实用高效，稳定性高，重复性好，具有巨大的应用前景。

Description

一种共价有机框架修饰的石墨烯材料及其合成方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种共价有机框架修饰的石墨烯材料及其合成方法和应用。
背景技术
蛋白质是生命现象的直接体现者，对蛋白质功能的研究将有助于理解生命活动的诸多生理过程。糖基化是蛋白质翻译后修饰最重要的方式之一，是必需的生理过程，对蛋白质生物学功能的正确发挥起着至关重要的作用。分离纯化及鉴定是对糖蛋白研究的重要步骤，近年来，生物质谱分析技术被广泛应用于糖基化蛋白/肽研究中，但由于自身的弱电离能力和较低的丰度，以及糖基化肽的质谱信号往往被非糖基化肽、盐以及杂质分子所掩蔽，导致直接使用质谱进行分析检测这将会面临巨大挑战。因此，在质谱分析前对复杂生物样品中的糖基化蛋白/肽段进行固相微萃取的分析前处理是成功鉴定糖基化蛋白/肽段的重要过程。
恶性肿瘤的发病率逐年提高，其靶向性治疗备受关注。理想的抗癌药物或药物载体能够系统能靶向性地到达肿瘤部位并快速起效，且对正常组织无不良反应。共价有机框架材料(Covalent organic frameworks，简称COFs)是一种通过共价键连接的二维或者三维有机多孔材料，可以通过不同前驱反应物设计出不同的成分、外形和孔隙的有机材料。多孔结构因具有大的比表面积、稳定的多孔结构、优异的机械稳定性和表面易修饰等特点被广泛的应用于分离、气体吸附、催化、传感等诸多领域，因此引起了科研工作者们的广泛关注。
本发明首次合成了具有强磁响应的一种共价有机框架修饰的石墨烯复合材料并应用于亲水性糖基化肽的分离、富集中，在外加磁场作用下，整个过程快速简便，可行性强。共价有机框架修饰的石墨烯复合材料的亲水孔道对目标糖基化肽具有很强的作用力，使得经过该材料高效富集后，目标肽段分子的质谱信号显著增强，并且通过体积筛分效应复合材料成功屏蔽掉大尺寸的干扰分子，有效的提高了对糖基化肽的富集效率。对于正常人血清糖基化肽的研究中也得到了令人满意的鉴定结果。于此同时，利用表面和孔道特有的结构与水溶性的抗癌药物阿霉素进行很好的结合，通过材料与细胞间发生相互作用，可以有效的进行药物释放，达到对循环肿瘤细胞的有效杀伤。
发明内容
本发明目的在于提供一种合成操作简单、成本低廉、稳定性好、重复率高的共价有机框架修饰的石墨烯材料及其合成方法，以及在糖基化肽分离、富集与MALDI-TOF-MS、nano-LC-MS/MS检测、循环肿瘤细胞成像中的应用。
本发明提供的共价有机框架修饰的石墨烯材料的合成方法，具体步骤如下：
(1)将300-500mg片层石墨烯分散到60-70mL浓硝酸中，50-70℃水浴回流7-9小时；
(2)将步骤(1)所得产物进行离心、分离，用去离子水清洗直至溶液为中性；
(3)将步骤(2)所得产物在45-50℃下真空干燥，放置保存，得到酸化石墨烯；
(4)将400-450mg FeCl3·6H2O溶于40-60mL乙二醇中，搅拌得到黄色透明溶液；
(5)将步骤(3)所得产物分散在步骤(4)所得溶液中，超声1.0-2.0小时，步骤(3)所得产物与步骤(4)所得溶液比例为：(150-200mg):(40-60mL)；
(6)超声搅拌情况下，将柠檬酸三钠、醋酸钠、聚乙二醇(Mr＝20000)加入到步骤(5)所得混合溶液中，充分搅拌1.0-1.5小时，其中柠檬酸三钠、醋酸钠、聚乙二醇(20000)配比为：(140-160mg):(1.6-2.0g):(0.8-1.2g)；
(7)将步骤(6)所得混合溶液转移至水热反应釜中，在180-220℃下加热10-12小时；
(8)将步骤(7)中高压反应釜冷却至室温，用磁铁分离出产物，并用去离子水和无水乙醇洗涤以除去多余的原料杂质，45-50℃下真空干燥，得到磁性石墨烯材料，记为magG；
(9)将步骤(8)中磁性分离出的20-40mg磁性石墨烯，加入1,3,5-三甲基苯和1,4-二氧六环的溶液中，超声分散0.5-1.0小时；
(10)超声搅拌中，将1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯加入到步骤(9)溶液中，超声分散3-4小时；
(11)通过磁性分离，将步骤(10)所得产物经过丙酮、乙醇洗，以除去表面杂质；
(12)将步骤(11)所得产物在45-50℃下真空干燥，得到共价有机框架修饰的石墨烯材料，记为MagG@B-COF-5。
本发明制备的以共价有机框架修饰的石墨烯材料，可用于糖基化肽分离、富集与质谱鉴定中，具体步骤为：将共价有机框架修饰的石墨烯材料与目标糖基化肽溶液充分混合，加入85-95％乙腈/0.10-0.15％三氟乙酸缓冲液中，分散均匀，在37-39℃酶解仪中孵育；通过离心分离出复合材料，用85-95％乙腈/0.10-0.15％三氟乙酸缓冲液洗涤复合材料3-5次，用25-30％乙腈/0.10-0.15％三氟乙酸洗脱；取0.8-1.2μL洗脱液点在MALDI-TOF-MS靶板上，自然干燥后再滴加0.8-1.2μL浓度为20-25mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸(DHB)溶液于被分析物液滴上，形成薄层基质，干燥后进行质谱分析。
本发明制备的以共价有机框架修饰的石墨烯材料，还可用于人体血清样品鉴定中。利用上述合成的以共价有机框架修饰的石墨烯材料，进行富集后续检测，可以大幅度提高原本无法鉴定到的糖基化肽段信号，以得到清晰、信噪比高的糖基化肽段信号峰。该富集策略已经实践于HRP蛋白酶解液、HRP蛋白酶解液与牛血清白蛋白和HRP蛋白混合溶液、正常人血清等多项实验中。同时，本发明制备的以共价有机框架修饰的石墨烯材料，在循环肿瘤细胞中也得到很好的应用。利用上述合成的以共价有机框架修饰的石墨烯材料，作为一个药物载体，成功负载抗癌药物阿霉素，材料进入细胞后，可以起到对阿霉素药物的高效释放，达到对癌细胞的有效杀伤。
本发明的有益效果在于：所提供的一种以共价有机框架修饰的石墨烯材料合成方法简单，磁性材料的引入简便了材料与溶液的分离，大大简化了实验操作步骤；制备所得复合材料具有良好的亲水性孔道结构、大比表面积和优异的生物相容性，对糖基化肽的分离、富集具有强选择性和卓越的灵敏度，可作为一种有效的固相微萃取材料应用于生物肽组学的高效研究中。该发明材料合适的亲水孔径结构能够起到体积筛分效应，对于复杂样品鉴定有着显著的效果，适用于人体血清、鼠肝、鼠脑、各类细胞蛋白等各种复杂生物样品中。于此同时，合适的孔径结构可以高效负载抗癌药物阿霉素，在循环肿瘤细胞内达到有效的药物释放。诸多实验结果充分证明，本发明制得的材料合成简便、成本低、稳定性好、重复率高，在多种生物样品分析中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为一种共价有机框架修饰的石墨烯材料的合成流程图。
图2为实施例1的有关材料的透射电子显微镜照片。其中，(a)磁性石墨烯透射电子显微镜照片；(b)共价有机框架修饰的石墨烯材料的透射电子显微镜照片。
图3为实施例2中10-6M的HRP酶解液(a)和(b)经一种共价有机框架修饰的石墨烯材料选择性富集后的质谱图。
图4为实施例3中0.5fmol/μL的HRP酶解液(a)选择性富集前和(b)经一种共价有机框架修饰的石墨烯材料选择性富集后的质谱图。
图5为实施例3中一种共价有机框架修饰的石墨烯材料负载阿霉素后与MCF-7细胞孵育的荧光共聚焦成像图。
具体实施方式
实施例1：一种共价有机框架修饰的石墨烯材料的合成方法。
(1)将450mg片层石墨烯分散到70mL浓硝酸中，60℃水浴回流8小时；
(2)将步骤(1)所得产物进行离心、分离，用去离子水清洗直至溶液为中性；
(3)将步骤(2)所得产物在50℃下真空干燥，放置保存，得到酸化石墨烯；
(4)将405mg FeCl3·6H2O溶于40mL乙二醇中，搅拌得到黄色透明溶液；
(5)将步骤(3)所得产物分散在步骤(4)所得溶液中，超声1.0小时，步骤(3)所得产物与步骤(4)所得溶液比例为：150mg:40mL；
(6)超声搅拌情况下，将柠檬酸三钠、醋酸钠、聚乙二醇(Mr＝20000)加入到步骤(5)所得混合溶液中，充分搅拌1.0小时，其中柠檬酸三钠、醋酸钠、聚乙二醇(20000)配比为：150mg:1.8g:1.0g；
(7)将步骤(6)所得混合溶液转移至水热反应釜中，在200℃下加热10小时；
(8)将步骤(7)中高压反应釜冷却至室温，用磁铁分离出产物，并用去离子水和无水乙醇洗涤以除去多余的原料杂质，50℃下真空干燥，得到磁性石墨烯材料，记为magG；
(9)将步骤(8)中磁性分离出的25mg磁性石墨烯，加入10mL 1,3,5-三甲基苯和10mL1,4-二氧六环的溶液中，超声分散0.5小时；
(10)超声搅拌中，将185mg 1,4-苯二硼酸和242mg 2,3,6,7,10,11-六羟基三苯加入到步骤(9)溶液中，超声分散3小时；
(11)通过磁性分离，将步骤(10)所得产物经过丙酮、乙醇洗，以除去表面杂质；
(12)将步骤(11)所得产物在50℃下真空干燥，得到MagG@B-COF-5材料。
图1为一种共价有机框架修饰的石墨烯材料的合成流程图。
图2为(a)实施例1的磁性石墨烯透射电子显微镜照片；(b)为实施例1的一种共价有机框架修饰的石墨烯材料的透射电子显微镜照片，a和b为使用的透射电子显微镜型号为日本株式会社2011显微镜。
实施例2：将上述一种共价有机框架修饰的石墨烯材料应用于标准HRP酶解液中糖基化肽的分离、富集与MALDI-TOF-MS检测：
(1)标准HRP蛋白酶解液的制备：准确称取1mg标准蛋白HRP溶于25mM碳酸氢铵缓冲液中，煮沸10分钟，用25mM碳酸氢铵缓冲液稀释到1mg/mL，然后按照与蛋白质量比1：50加入适量的胰蛋白酶，37℃下过夜酶解16小时；
(2)将2mg的共价有机框架修饰的石墨烯材料用含95％乙腈/1.0％三氟乙酸缓冲液洗涤3次，之后分散于200μL的95％乙腈/1.0％三氟乙酸缓冲液中，超声分散至均匀，配置成10μg/μL溶液；
(3)糖基化肽的富集：取20μL步骤(2)所得溶液，加入80μL的95％乙腈/1.0％三氟乙酸缓冲液；之后加入HRP标准蛋白酶解液，使得肽段含量为10-6M，在37℃下孵育反应10分钟；通过离心分离出复合材料，用200μL 95％乙腈/1.0％三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用10μL 30％乙腈/0.1％三氟乙酸缓冲液洗脱10分钟，磁性分离得到洗脱肽段溶液；
(4)点靶：取1μL步骤(3)所述洗脱液点到MALDI-TOF-MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取1μL的2,5-二羟基苯甲酸溶液(20mg/mL的50％乙腈溶液)作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干燥后进行质谱分析。
如图3可以看出，在富集前，10-6M的HRP标准蛋白酶解液中难以鉴定到糖基化肽段(图3(a))，然而经过共价有机框架修饰的石墨烯材料进行固相微萃取后，质谱图中出现了大量HRP蛋白的糖基化肽峰，糖基化肽的信号峰得到了显著提升(图3(b))。
实施例3：将实施例1得到的共价有机框架修饰的石墨烯材料应用于超低浓度的HRP酶解液的富集与MALDI-TOF-MS检测：
(1)糖基化肽段富集:200μg的共价有机框架修饰的石墨烯材料，加到80μL95％乙腈/1.0％三氟乙酸缓冲液中；用25mM碳酸氢铵缓冲液稀释标准蛋白酶解液，使得蛋白酶解液的终浓度为0.5fmol/μL；37℃下孵育混旋10分钟；磁性分离，用200μL 95％乙腈/1.0％三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用10μL30％乙腈/0.1％三氟乙酸缓冲液洗脱10分钟，磁性分离；
(2)点靶：取1μL步骤(1)所述洗脱液点到MALDI-TOF-MS靶板上，室温下置于空气中自然干燥后，再取1μL的2,5-二羟基苯甲酸溶液(20mg/mL的50％乙腈溶液)作为基质滴于被分析物液滴上，产生薄基质层，干燥后进行质谱分析。
如图4可以看出，在富集前，由于HRP蛋白酶解液浓度极低导致难以鉴定到糖基化肽段(图4(a))；然而经过共价有机框架修饰的石墨烯材料富集后，质谱中清楚地呈现了二条源于HRP蛋白的糖基化肽段峰(图4(b))。
实施例4：将实施例1得到的共价有机框架修饰的石墨烯材料应用于正常人血清酶解溶液中糖基化肽的富集与nano-LC-MS/MS检测：
(1)人血清酶解液的制备：1μL正常人血清用去离子水液稀释到20μL，在14000rmp转速下离心20分钟。收集上清液，加入10mM二硫苏糖醇在60℃下反应30分钟，之后加入20mM吲哚乙酸避光在37℃下反应60分钟。冷却后按照蛋白与丙酮溶液的体积比为1:6情况下加入丙酮在-20℃下进行蛋白沉淀，过夜反应12小时。蛋白酶解前，用50mM碳酸氢铵溶液进行稀释，得到最终的蛋白溶度为2mg/mL，之后按照与蛋白质量比1:40向上清液中加入适量的胰蛋白酶，37℃下酶解16小时；
(2)糖基化肽段的富集：取200μL正常人血清的酶解液和1mg共价有机框架修饰的石墨烯材料，加到300μL95％乙腈/1.0％三氟乙酸缓冲液中，37℃下孵育混旋20分钟；磁性分离，用300μL95％乙腈/1.0％三氟乙酸缓冲液洗涤三次后，用20μL30％乙腈/0.1％三氟乙酸缓冲液洗脱20分钟，磁性分离；
(3)将洗脱的肽段样品完全冻干，干粉用12μL色谱流动相A相(0.1％甲酸水溶液)溶解，17000rpm下离心15分钟，吸取上清液；取8μL进样，设定线性分离的色谱流动相B(0.1％甲酸乙腈溶液)从2％到45％，再以300nL/min流速进行洗脱分析。
由表1可知，利用共价有机框架修饰的石墨烯材料进行富集，鉴定到232个糖基化肽段。
实施例5：将实施例1得到的共价有机框架修饰的石墨烯材料负载抗癌药物阿霉素，在人乳腺癌细胞(MCF-7)中进行药物释放。
共价有机框架修饰的石墨烯材料与阿霉素进行孵育，将阿霉素载入到材料中，在细胞培养皿中加入负载有阿霉素的材料，与细胞进行孵育，平行分别反应30分钟和4小时，之后吸取上清，并用PBS清洗3次，室温下DAPI染色、固定，用激光共聚焦显微镜成像分析。
由图5可以明显看出，材料与细胞孵育后，负载有阿霉素的材料与细胞发生相互作用，将抗癌药物阿霉素缓慢释放到细胞中，经过30分钟后，可以发现阿霉素在细胞内存在，达到药物释放的效果(图5a-a”’)。经过4小时后，可以看出阿霉素成功进入细胞核，达到药物释放作用于细胞核起到对循环肿瘤细胞杀伤的效果(图5b-b”’)。
表1.一种共价有机框架修饰的石墨烯材料应用于正常人血清酶解溶液中糖基化肽的富集结果。

Claims (7)

1.一种共价有机框架修饰的石墨烯材料的合成方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将300-500 mg片层石墨烯分散到60-70 mL浓硝酸中，50-70 ℃水浴回流7-9小时；
（2）将步骤（1）所得产物进行离心、分离，用去离子水清洗直至溶液为中性；
（3）将步骤（2）所得产物在45-50 ℃下真空干燥，放置保存，得到酸化石墨烯；
（4）将400-450 mg FeCl3•6H2O 溶于40-60 mL乙二醇中，搅拌得到黄色透明溶液；
（5）将步骤（3）所得产物分散在步骤（4）所得溶液中，超声1.0-2.0小时，步骤（3）所得产物与步骤（4）所得溶液比例为：（150-200 mg）:（40-60 mL）；
（6）超声搅拌情况下，将柠檬酸三钠、醋酸钠、聚乙二醇（Mr=20000）加入到步骤（5）所得混合溶液中，充分搅拌1.0-1.5小时，其中柠檬酸三钠、醋酸钠、聚乙二醇（20000）配比为：（140-160 mg）:（1.6-2.0 g）:（0.8-1.2 g）；
（7）将步骤（6）所得混合溶液转移至水热反应釜中，在180-220 ℃下加热10-12小时；
（8）将步骤（7）中高压反应釜冷却至室温，用磁铁分离出产物，并用去离子水和无水乙醇洗涤以除去多余的原料杂质，45-50 ℃下真空干燥，得到磁性石墨烯材料，记为magG；
（9）将步骤（8）中磁性分离出的20-40 mg 磁性石墨烯，加入1,3,5-三甲基苯和1,4-二氧六环的溶液中，超声分散0.5-1.0小时；
（10）超声搅拌中，将1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯加入到步骤（9）溶液中，超声分散3-4小时；
（11）通过磁性分离，将步骤（10）所得产物经过丙酮、乙醇洗，以除去表面杂质；
（12）将步骤（11）所得产物在45-50 ℃下真空干燥，得到共价有机框架修饰的石墨烯材料，记为MagG@B-COF-5。
2. 根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤（9）中1,3,5-三甲基苯和1,4-二氧六环的用量比例为：（10-15 mL）:（8-12 mL）。
3. 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（10）中1,4-苯二硼酸和2,3,6,7,10,11-六羟基三苯的用量比例为：（170-195 mg）:（230-250 mg）。
4.一种由权利要求1、2或3所述合成方法得到的共价有机框架修饰的石墨烯材料。
5. 如权利要求4所述的共价有机框架修饰的石墨烯材料在糖基化肽分离、富集与质谱鉴定中的应用，其特征在于：将共价有机框架修饰的石墨烯材料与目标糖基化肽溶液充分混合，加入85-95 %乙腈/0.10-0.15 %三氟乙酸缓冲液中，分散均匀，在37-39 ℃酶解仪中孵育；通过离心分离出复合材料，用85-95 %乙腈/0.10-0.15 %三氟乙酸缓冲液洗涤复合材料3-5次，用25-30 %乙腈/0.10-0.15 %三氟乙酸洗脱；取0.8-1.2 μL洗脱液点在MALDI-TOF-MS靶板上，自然干燥后再滴加0.8-1.2 μL浓度为20-25 mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于被分析物液滴上，形成薄层基质，干燥后进行质谱分析。
6.如权利要求4所述的共价有机框架修饰的石墨烯材料在人体血清样品鉴定中的应用。
7.如权利要求4所述的共价有机框架修饰的石墨烯材料在循环肿瘤细胞样品鉴定中的应用。
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