CN106770614B - 亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法 - Google Patents

亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于纳米技术领域，具体为一种亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法。本发明将纳米复合材料配制成为分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与糖基化肽段溶液在80%乙腈/0.1%甲酸缓冲液中混合，在酶解仪中孵育；在外磁场作用下通过磁性分离纳米复合材料，用80%乙腈/0.1%甲酸缓冲液洗涤；再用50%乙腈/0.1%甲酸缓冲液洗脱材料上富集的糖基化肽段，结合质谱分析鉴定。该亲水性纳米复合材料为磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的纳米复合材料。本方法操作简单，成本低廉，灵敏迅速，具有较高灵敏度和较好选择性，十分适用于复杂生物样品中的糖基化肽段的检测。

Description

亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法
技术领域
本发明属于纳米技术领域，具体涉及一种亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法，特别是涉及一种磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的复合纳米材料结合质谱技术用于糖基化肽段富集与检测的方法。
背景技术
蛋白质糖基化是生命过程中最重要的翻译后修饰手段之一，在分子识别、细胞内及细胞间信号传导、免疫反应等生命活动中起到了重要的作用。根据Swiss-Prot数据库的记录和预测，人类蛋白质中约有一半以上的蛋白质发生了糖基化。糖蛋白的组成、丰度的变化与疾病有着密切的联系，特别是在癌症发展过程之中，许多临床诊断标志物和治疗靶标如乳腺癌中的Her2/neu、前列腺癌中的前列腺特异性抗原、卵巢癌中的CA125等都是糖蛋白。因此，全面的分析研究蛋白质糖基化对于深入了解细胞生物学和疾病机理非常关键。目前，快速、高精度、操作简便的质谱技术在糖基化蛋白质组学的研究中得到了广泛的应用。然而，糖蛋白质组学的全面研究仍然存在着很多困难。很多临床上具有重要研究价值的糖蛋白均是低丰度蛋白，容易受到生物样品中其他高丰度非糖蛋白的干扰；糖蛋白或糖肽的离子化效率远远低于非糖蛋白或非糖肽，降低了糖蛋白或糖肽的质谱检测灵敏度；糖链结构复杂多样，质谱难以准确测定其化学结构和质量数。因此，在使用质谱方法分析复杂生物样品中的糖蛋白或糖肽之前，对样品中的糖蛋白或者糖基化肽段进行分离富集是十分必要的。
随着研究的不断深入，近年来发展了许多分离富集复杂样品中的糖基化蛋白和肽段的方法，比如凝集素亲和方法、抗体法、酰肼化学反应法、硼酸亲和色谱法、二氧化钛亲和法、亲水相互作用色谱法（HILIC）等。其中，亲水相互作用色谱法由于广泛的糖链特异性、富集过程简便、富集条件温和、重现性高而得到广泛应用；此外，HILIC方法利用高浓度的有机溶剂作为流动相，可以很好地兼容后续的质谱分析。目前HILIC方法已经开发出各种材料用于糖肽富集，包括琼脂糖，麦芽糖，两性离子聚合物和金属有机骨架等。由于葡萄糖、麦芽糖等和糖肽有相似结构，所以利用葡萄糖、麦芽糖等功能化修饰的HILIC材料与糖肽会有较好的相互作用。
石墨烯是一种新型的单原子层碳纳米材料，由于其独特的理化性能、超高的比表面积备受关注。磁性材料由于超顺磁性、快速分离、良好的生物相容性在蛋白质组学领域得到广泛应用。因此，基于磁性石墨烯基底的亲水性复合纳米材料在糖肽富集研究中有很大的潜力。
通过文献调研，目前还没有葡萄糖功能化修饰的磁性石墨烯材料应用在糖肽的富集研究中。结合磁性石墨烯材料超大比表面、快速分离等特点和葡萄糖特异性亲和糖肽特点，本发明首次合成了磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的纳米复合材料，应用于糖基化肽段的分离富集。大比表面积的磁性石墨烯材料通过聚(二烯丙基二甲基氯化铵)的静电吸附作用负载纳米金颗粒，再结合金-硫键相互作用在材料表面充分修饰了巯基化的葡萄糖，形成了具有很好亲水性的复合材料，对于复杂生物样品中的糖基化肽段具有选择性富集作用，大大提高了糖基化肽段的质谱信号，对于糖基化肽段的检测限可达0.25 fmol/μL，检测绝对量达到1ng。
本发明所涉及的磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性纳米复合材料，具有大比表面积，良好的生物相容性，快速磁性分离能力以及优异的亲水性，合成方法简单快速。此亲水性纳米复合材料可用于选择性富集生物样品中低丰度的糖基化肽，并用于质谱检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种纳米复合材料结合质谱鉴定糖基化肽段的方法。
本发明提出的纳米复合材料结合质谱鉴定糖基化肽段的方法，具体步骤为：
（一）将亲水性纳米复合材料配制成为0.5-10mg/mL的分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与糖基化肽段溶液加入到（75-90）%乙腈和（0.05-1）%甲酸（其中含有10-25mM碳酸氢铵）组成的上样缓冲液中混合，在酶解仪中孵育15-60分钟；
（二）在外磁场作用下通过磁性分离纳米复合材料，用（75-90）%乙腈和（0.05-1）%甲酸（其中含有10-25mM碳酸氢铵）组成的缓冲液洗涤，随后用（30-55）%乙腈和（0.05-1）%甲酸缓冲液（其中含有10-25mM碳酸氢铵）组成的混合液洗脱；
（三）取1-3μL洗脱液直接在MALDI-TOF MS的进样靶板上点靶，干燥后再点加1-2μL浓度为15-25mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液，形成基质结晶，进行质谱分析；
其中，所述的纳米复合材料为磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性纳米复合材料。
本发明中，纳米复合材料的具体制备步骤如下：
（1）用浓硝酸对石墨烯进行酸化，在55-65℃条件下反应6-8小时得到酸化石墨烯，随后用去离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗涤液呈中性为止，在40-60℃下真空干燥；
（2）步骤（1）所得的酸化石墨烯加入乙二醇中，加入六水合三氯化铁，超声分散0.5-1.5小时，再加入柠檬酸三钠，乙酸钠和聚乙二醇，室温下搅拌0.5-1小时后把混合物转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，190-210℃条件下反应8-16h，制得磁性石墨烯，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；
（3）配制氯金酸水溶液，磁力搅拌并加热至沸腾，再向其中加入柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌保持沸腾10-30分钟，然后自然冷却至室温，得到纳米金的水溶胶；
（4）配制含有三羟甲基氨基甲烷和氯化钠的溶液，再加入聚(二烯丙基二甲基氯化铵)溶液形成混合液，向混合液中加入步骤（2）所得的磁性石墨烯，超声分散，再机械搅拌30-45分钟，在外磁场作用下磁性分离并用去离子水充分洗涤；向洗涤后的反应物中加入步骤（3）所得纳米金的水溶胶，室温下机械搅拌1-4小时，得到纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；
（5）配制磷酸盐缓冲液，加入2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐和氨基葡萄糖盐酸盐，在酶解仪上37-60℃反应30-60分钟，向其中加入步骤（4）所得产物纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯，50-70℃反应1-3小时，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在40-60℃下真空干燥，得到磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料。
本发明中，步骤（1）中石墨烯和浓硝酸的比为（0.3-2）g：（30-130）mL。两者比优选为0.4g：40mL。
本发明中，步骤（2）中酸化石墨烯、乙二醇、六水合三氯化铁、柠檬酸三钠、乙酸钠和聚乙二醇的比为（50-500）mg：（15-150）mL：（130-1000）mg：（50-500）mg：（600-6000）mg：（300-3300）mg，比例优选为150mg：40mL：405mg：150mg：1800mg：1000mg。
本发明中，步骤（3）中氯金酸、水和柠檬酸三钠的比为（2-10）mg：（20-100）mL：（4-20）mg，比例优选为5mg：50mL：10mg。
本发明中，步骤（4）中三羟甲基氨基甲烷，氯化钠和聚(二烯丙基二甲基氯化铵)的浓度比为（0.01-0.05）mol/L：（0.01-0.05）mol/L：（0.1-0.5）%（质量浓度），比例优选为0.02mol/L：0.02mol/L：0.2%（质量浓度）。磁性石墨烯和纳米金水溶胶的比为（5-50）mg：（15-250）mL，两者比优选为20mg：120mL。
本发明中，步骤（5）中磷酸盐缓冲液的pH值为7.2-7.4，2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐和氨基葡萄糖盐酸盐的质量比为（4.8-5.2）：（2.7-3.2），氨基葡萄糖盐酸盐和步骤（4）所得产物纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯的质量比为（0.7-1.2）：（0.9-1.4）。
本发明的有益效果在于：所提供的磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料合成方法简单，材料具有磁性方便操作中的快速分离，石墨烯的超大表面积负载了密集的纳米金颗粒从而使材料表面可以充分修饰特异性亲水的葡萄糖，对于复杂生物样品中的糖基化肽段具有选择性富集作用，大大提高了糖基化肽段的质谱信号，对于糖基化肽段的检测限可达0.25 fmol/μL，检测绝对量达到1ng。
本方法操作简单，成本低廉，灵敏迅速，可结合质谱技术对富集物进行质谱鉴定。被富集肽段信噪比放大倍数高，具有较好选择性和较高灵敏度，十分适用于复杂生物样品中的糖基化肽段的检测。
附图说明
图1为实施例1的磁性石墨烯的透射电子显微镜照片。其中，(a)为200nm比例尺的照片，(b)为1μm比例尺的照片。
图2为实施例1的纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯的透射电子显微镜照片，其中，(a)为200nm比例尺的照片，(b)为2μm比例尺的照片。
图3为实施例1的磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料的透射电子显微镜照片。其中，(a)为200nm比例尺的照片，(b)为500nm比例尺的照片。
图4为实施例1的红外光谱图。其中，(a)为磁性石墨烯的红外光谱图，(b)为纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯的红外光谱图，(c)为磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料的红外光谱图。
图5为实施例1的拉曼光谱图。其中，(a)为磁性石墨烯的拉曼光谱图，(b)为纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯的拉曼光谱图，(c)为磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料的拉曼光谱图。
图6为实施例2中125fmol/μL的HRP酶解液经过磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料富集前后的MALDI-TOFMS质谱图。其中，(a)为125fmol/μL的HRP酶解液富集前原液的质谱图，(b)为125fmol/μL的HRP酶解液富集后洗脱液的质谱图。
图7为实施例2中更低浓度的HRP酶解液经过磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料富集前后的MALDI-TOF MS质谱。其中，(a)为6.25fmol/μL的HRP酶解液富集前原液的质谱图，(b)为6.25fmol/μL的HRP酶解液富集后洗脱液的质谱图，(c)为0.25fmol/μL的HRP酶解液富集前原液的质谱图，(d)为0.25fmol/μL的HRP酶解液富集后洗脱液的质谱图。
图8为实施例3中不同质量比HRP和牛血清蛋白BSA酶解液的混合溶液经过磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料富集前后的MALDI-TOF MS质谱图。其中，(a)为HRP和BSA酶解液质量比为1：10的混合液富集前的质谱图，(b)为HRP和BSA酶解液质量比为1：10的混合液富集后洗脱液的质谱图，(c)为HRP和BSA酶解液质量比为1：50的混合液富集前的质谱图，(d)为HRP和BSA酶解液质量比为1：50的混合液富集后洗脱液的质谱图。
表1为MALDI-TOF MS鉴定到的标准蛋白HRP的胰蛋白酶酶解肽段中糖基化肽段的具体信息列表。
具体实施方式
下面的实施实例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：一种磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性纳米复合材料的合成
（1）用浓硝酸对石墨烯进行酸化，400mg石墨烯分散于40mL浓硝酸中，在60℃条件下反应7小时得到酸化石墨烯，随后用去离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗涤液呈中性为止，在50℃下真空干燥；
（2）150mg步骤（1）所得的酸化石墨烯加入40mL乙二醇中，加入405mg六水合三氯化铁，超声分散1小时，再加入0.15g柠檬酸三钠，1.8g乙酸钠和1.0g聚乙二醇，室温下搅拌0.5小时后把混合物转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，200℃条件下反应12h，制得磁性石墨烯，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在50℃下真空干燥；
（3）配制0.01%氯金酸水溶液，磁力搅拌并加热至沸腾，再向其中加入1%柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌保持沸腾15分钟，然后自然冷却至室温，得到纳米金的水溶胶；
（4）配制0.02M三羟甲基氨基甲烷，0.02M氯化钠，0.2%聚(二烯丙基二甲基氯化铵)的混合溶液，向混合液中加入20mg步骤（2）所得的磁性石墨烯，超声分散，再机械搅拌30分钟，在外磁场作用下磁性分离并用去离子水充分洗涤；向洗涤后的反应物中加入120mL步骤（3）所得纳米金的水溶胶，室温下机械搅拌2.5小时，得到纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在50℃下真空干燥；
（5）配制pH7.2磷酸盐缓冲液，加入1.5mg 2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐和0.9mg氨基葡萄糖盐酸盐，在酶解仪上60℃反应40分钟，向其中加入1mg步骤（4）所得产物纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯，60℃反应2小时，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在50℃下真空干燥，得到磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料。
图1为磁性石墨烯的透射电子显微镜照片，透射电镜型号为JEOL-1400，将纯化后的磁性石墨烯的乙醇分散液滴在覆有碳膜的铜网上，干燥后进行透射电子显微镜观察并拍照。其中(a)为200nm比例尺的照片，(b)为1μm比例尺的照片，可以看到磁球尺寸在100nm至200nm，磁球分散在石墨烯层表面,证明成功合成了磁性石墨烯。
图2为纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯的透射电子显微镜照片，透射电镜型号为JEOL-1400，将纯化后的纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯的乙醇分散液滴在覆有碳膜的铜网上，干燥后进行透射电子显微镜观察并拍照。其中(a)为200nm比例尺的照片，(b)为2μm比例尺的照片，可以看到与图1的磁性石墨烯有明显区别，材料表面多了许多纳米金颗粒，证明10nm左右的纳米金颗粒成功修饰在磁性石墨烯的表面。
图3为磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料的透射电子显微镜，透射电镜型号为JEOL-1400，将纯化后的磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料的乙醇分散液滴在覆有碳膜的铜网上，干燥后进行透射电子显微镜观察并拍照。其中(a)为200nm比例尺的照片，(b)为500nm比例尺的照片，同样可以看到10nm左右的纳米金颗粒成功修饰在磁性石墨烯的表面。
图4为红外光谱图，红外光谱仪为Thermo Fisher公司的Nicolet傅里叶光谱仪，将样品干燥粉末与少量溴化钾粉末混合研磨压片，将样品放入样品槽中进行测试。其中(a)为磁性石墨烯的红外光谱图，(b)为纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯的红外光谱图，(c)为磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料的红外光谱图。可以看到，570cm-1的峰是Fe-O-Fe的特征峰，表明磁球四氧化三铁的成功合成；与(a)、(b)相比，(c)中1625cm-1、1564cm-1的吸收峰明显增强，为N-H的振动吸收峰，1085cm-1、1038cm-1的吸收峰也显著增强，为C-O-H的仲羟基和伯羟基吸收峰，2918cm-1、2850cm-1为-CH2的吸收峰，这些都是巯基化葡萄糖的特征峰，表明葡萄糖被成功修饰在材料表面，合成了目标材料。
图5为拉曼光谱图，激光共聚焦显微拉曼光谱仪的型号为HoribaJobinYvonXploRA，激发波长为785nm，其中(a)为磁性石墨烯的拉曼光谱图，(b)为纳米金颗粒修饰的聚(二烯丙基二甲基氯化铵)包覆的磁性石墨烯的拉曼光谱图，(c)为磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料的拉曼光谱图。1334 cm-1、1580 cm-1和2686 cm-1三个特征峰分别对应了石墨烯结构的D 模式、G 模式和2D 模式；与(a)、(b)相比，(c)中275 cm-1特征峰显著增强，为Au-S的特征峰，证明葡萄糖成功巯基化并且通过金硫键修饰在纳米金颗粒表面，增强了复合材料的亲水性和对糖肽的特异性亲和作用。
实施例2：将实施例1得到的磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料应用于低浓度辣根过氧化物酶HRP酶解液的富集与MALDI-TOF MS检测
（1）准备标准蛋白酶解液：准确称取1 mg HRP标准蛋白，用25 mM碳酸氢铵溶液配成浓度为5mg/mL的标准蛋白溶液，煮沸十分钟；加入二硫苏糖醇，使二硫苏糖醇终浓度为5mM，60℃反应1小时，再加入碘乙酰胺，使碘乙酰胺终浓度为12.5mM，37℃避光反应1小时；再用25mM碳酸氢铵溶液稀释使HRP终浓度为1mg/mL，按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育15小时，可以得到1mg/mL的HRP胰蛋白酶解液；
（2）样品的富集：配制体积分数为80%乙腈/0.1%甲酸，其中含有10mM碳酸氢铵的上样液，用上样液配制10 mg/mL磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的复合纳米材料的溶液，用上样液稀释1mg/mL的HRP酶解液至0.1mg/mL。在0.6mL的离心管内加入的5μL的0.1mg/mL的HRP酶解液和75μL上样液，混匀后加入20μL的10mg/mL的材料溶液，37℃下震荡富集45分钟；在磁铁作用下分离材料，吸去上清液，用上样液洗涤材料三遍，然后加入10μL体积分数为50%乙腈和0.1%甲酸，其中含有10mM碳酸氢铵的溶液，37℃震荡洗脱30分钟，磁性分离材料，吸出洗脱液备用。用上样液逐步稀释HRP酶解液至更低浓度，按照以上步骤加入材料富集洗脱，洗脱液备用；
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOF MS进样靶板上，干燥后再点加1 μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析；
（4）利用质谱分析以磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料作为固相微萃取吸附分离介质富集得到的糖基化肽段并与富集前的原液质谱图作对比。
1mg/mL的HRP酶解液经过材料溶液和上样液稀释后的反应体系终浓度为125fmol/μL，经过磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的复合纳米材料富集后，用Applied Biosystems公司的5800 MALDI-TOF MS质谱仪进行检测，图6为125fmol/μL的HRP酶解液在材料富集前后的质谱图，(a)为富集前原液的质谱图，(b)为富集后洗脱液的质谱图；表1为MALDI-TOF MS鉴定到的标准蛋白HRP的胰蛋白酶酶解肽段中糖基化肽段的具体信息列表。从质谱图(a)中可以看出，富集前的HRP酶解液原液中只检测到6条糖基化肽段（峰标号分别为1，5，7，12，14，15），肽段信号的强度很弱。经过纳米复合材料富集之后，洗脱液中检测出17条糖基化肽段（具体信息见图6(b)和表1），与富集前原液相比不仅糖肽数量显著增加，而且肽段信号的强度大大增强。可以证明，所合成的磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料对于糖基化肽段的确有显著的分离富集效果。
图7为更低浓度的HRP酶解液在材料富集前后的质谱图，(a)为6.25fmol/μL的HRP酶解液富集前原液的质谱图，(b)为6.25fmol/μL的HRP酶解液富集后洗脱液的质谱图，(c)为0.25fmol/μL的HRP酶解液富集前原液的质谱图，(d)为0.25fmol/μL的HRP酶解液富集后洗脱液的质谱图。6.25fmol/μL的HRP酶解液在富集前只检测出1条糖基化肽段（峰标号为12），经材料富集后检测出11条糖肽（峰标号为4，5，6，7，9，10，11，12，14，15，17）而且糖肽峰的信号强度大大增加；当HRP酶解液稀释到0.25fmol/μL时，富集前检测不到糖基化肽段，经材料富集后依然可以检测出3条糖肽（峰标号为5，12，17）。可以证明，所合成的亲水性纳米复合材料对于糖基化肽段的检测限可达到0.25fmol/μL，检测绝对量达到1ng。
实施例3：将实施例1得到的磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料作为固相微萃取吸附分离介质用于HRP酶解液和牛血清白蛋白（BSA）酶解液的混合溶液的富集与MALDI-TOF MS检测
（1）准备标准蛋白酶解液：准确称取1 mg HRP标准蛋白，用25 mM碳酸氢铵溶液配成浓度为5mg/mL的标准蛋白溶液，煮沸十分钟；加入二硫苏糖醇，使二硫苏糖醇终浓度为5mM，60℃反应1小时，再加入碘乙酰胺，使碘乙酰胺终浓度为12.5mM，37℃避光反应1小时；再用25mM碳酸氢铵溶液稀释使HRP终浓度为1mg/mL，按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育15小时，可以得到1mg/mL的HRP胰蛋白酶解液。准确称取5mg BSA标准蛋白，用25 mM碳酸氢铵溶液配成浓度为10mg/mL的标准蛋白溶液，煮沸十分钟，再用25mM碳酸氢铵溶液稀释使BSA终浓度为5mg/mL，按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育15小时，可以得到5mg/mL的BSA胰蛋白酶解液；
（2）样品的富集：配制体积分数为80%乙腈和0.1%甲酸，其中含有10mM碳酸氢铵的上样液，用上样液配制10 mg/mL磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的复合纳米材料的溶液，用上样液稀释1mg/mL的HRP酶解液至0.1mg/mL。在0.6mL的离心管内加入的2.5μL的0.1mg/mL的HRP酶解液, 分别按照HRP和BSA的质量比为1:10和1:50加入BSA酶解液，随后加入上样液使体系配成总体积为40μL体系，混匀后加入10μL的10 mg/mL的材料溶液，37℃下震荡富集45分钟；在磁铁作用下分离材料，吸去上清液，用上样液洗涤材料三遍，然后加入5μL体积分数为50%乙腈和0.1%甲酸，其中含有10mM碳酸氢铵的溶液，37℃震荡洗脱30分钟，磁性分离材料，吸出洗脱液备用；
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOF MS进样靶板上，干燥后再点加1 μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析；
（4）利用质谱分析以磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料作为固相微萃取吸附分离介质富集得到的糖基化肽段并与富集前的原液质谱图作对比。
图8为不同质量比的HRP和牛血清蛋白BSA酶解液的混合溶液经过磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料富集前后的MALDI-TOF MS质谱图，(a)为HRP和BSA酶解液质量比为1：10的混合液富集前的质谱图，(b)为HRP和BSA酶解液质量比为1：10的混合液富集后洗脱液的质谱图，(c)为HRP和BSA酶解液质量比为1：50的混合液富集前的质谱图，(d)为HRP和BSA酶解液质量比为1：50的混合液富集后洗脱液的质谱图。图(a)和图(c)的混合原液质谱图中，大量的非糖基化肽段的峰严重干扰了糖肽的检测，经材料富集分离之后，图(b)和图(d)中非糖基化肽段大大减少，糖肽被选择性地富集出来，HRP和BSA酶解液质量比为1：10时富集检测出13条糖肽，在HRP和BSA酶解液质量比为1：50时，虽然非糖肽的干扰增强了但仍然可以检测出7条糖肽，可以证明所合成的亲水性纳米复合材料对于糖肽具有较好的选择性富集效果。
实施例4：将实施例1得到的磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料作为固相微萃取吸附分离介质用于健康人血清样品中糖基化肽段的富集与质谱鉴定
（1）样品准备：取2ul健康人血清样品，用25mM碳酸氢铵溶液稀释10倍，12000转/min离心5分钟，取上清液在沸水中煮3分钟，加入二硫苏糖醇，使二硫苏糖醇终浓度为5mM，60℃反应1小时，再加入碘乙酰胺，使碘乙酰胺终浓度为12.5mM，37℃避光反应1小时；加入0.5μL的1mg/mL胰蛋白酶溶液，37°C孵育15小时，得到健康人血清的胰蛋白酶酶解液，将酶解液离心冻干备用；
（2）样品中糖肽的富集：配制体积分数为80%乙腈和0.1%甲酸，其中含有10 mM碳酸氢铵的上样液，用上样液配制10 mg/mL磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的复合纳米材料的溶液。冻干的人血清酶解肽段用400μL上样液溶解，加入100μL的10 mg/mL的材料溶液充分混匀，37℃下震荡富集60分钟；在磁铁作用下分离材料，吸去上清液，用上样液洗涤材料三遍，然后加入30μL体积分数为50%乙腈和0.1%甲酸，其中含有10 mM碳酸氢铵的溶液，37℃震荡洗脱30分钟，磁性分离材料，吸出洗脱液备用，再次加入30μL体积分数为50%乙腈和0.1%甲酸，其中含有10 mM碳酸氢铵的溶液，37℃震荡洗脱30分钟，磁性分离材料，吸出洗脱液，和第一次的洗脱液合并，离心冻干；
（3）LC-MS/MS质谱鉴定：冻干的洗脱样品用60μL的25mM碳酸氢铵溶液溶解，再加入1μL的PNGaseF酶，37°C孵育13小时，离心冻干后再次重溶于25μL的A流动相（95%水/5%乙腈/0.1%甲酸），17000g离心10分钟后上样18μL，使用Nano-LC-ESI MS/MS串级质谱测定，而后进行质谱搜库。
健康人血清体系比较复杂，经过磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料选择性富集糖基化肽段，质谱可以鉴定到259条糖基化肽段中的269个糖基化位点，归属于101个糖蛋白，证明本发明方法在复杂的实际生物样品中也可以成功应用，具有很好的应用前景。
表1MALDI-TOF MS鉴定到的标准蛋白HRP的胰蛋白酶酶解肽段中糖肽的具体信息
Fuc为α-L-岩藻糖,Xyl为α-D-木糖，Man为α-D-甘露糖，GlcNAc为N-乙酰氨基葡萄糖。

Claims (2)

1.一种亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（一）将亲水性纳米复合材料配制成为0.5-10mg/mL的分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与糖基化肽段溶液加入到上样缓冲液中混合，在酶解仪中孵育15-60分钟；该上样缓冲液由超纯水配制，在100 ml上样缓冲液中有75ml~90ml乙腈、0.05ml~1ml甲酸与79mg~197.5mg碳酸氢铵；
（二）在外磁场作用下通过磁性分离纳米复合材料，用缓冲液洗涤，该缓冲洗涤液用超纯水配制，100ml缓冲洗涤液中含有75ml~90ml乙腈、0.05ml~1ml甲酸与79mg~197.5mg碳酸氢铵；随后用混合液洗脱，该混合洗脱液用超纯水配制，100ml混合洗脱液中含有30ml~55ml乙腈、0.05ml~1ml甲酸缓冲液与79mg~197.5mg碳酸氢铵；
（三）取1-3μL洗脱液直接在MALDI-TOF MS的进样靶板上点靶，干燥后再点加1-2μL浓度为15-25mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液，形成基质结晶，进行质谱分析；
其中，所述的纳米复合材料为磁性石墨烯表面包覆聚(二烯丙基二甲基氯化铵)和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性纳米复合材料。
2.根据权利要求1所述的亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法，其特征在于，所述的亲水性纳米复合材料具体制备步骤如下：
（1）用浓硝酸对石墨烯进行酸化，在55-65℃条件下反应6-8小时得到酸化石墨烯，随后用去离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗涤液呈中性为止，在40-60℃下真空干燥；
（2）步骤（1）所得的酸化石墨烯加入乙二醇中，加入六水合三氯化铁，超声分散0.5-1.5小时，再加入柠檬酸三钠，乙酸钠和聚乙二醇，室温下搅拌0.5-1小时后把混合物转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中，190-210℃条件下反应8-16小时，制得磁性石墨烯，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；
（3）配制氯金酸水溶液，磁力搅拌并加热至沸腾，再向其中加入柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌保持沸腾10-30分钟，然后自然冷却至室温，得到纳米金的水溶胶；
（4）配制含有三羟甲基氨基甲烷和氯化钠的溶液，再加入聚（二烯丙基二甲基氯化铵）溶液形成混合液，向混合液中加入步骤（2）所得的磁性石墨烯，超声分散，再机械搅拌30-45分钟，在外磁场作用下磁性分离并用去离子水充分洗涤；向洗涤后的反应物中加入步骤（3）所得纳米金的水溶胶，室温下机械搅拌1-4小时，得到纳米金颗粒修饰的聚（二烯丙基二甲基氯化铵）包覆的磁性石墨烯，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；
（5）配制磷酸盐缓冲液，加入2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐和氨基葡萄糖盐酸盐，在酶解仪上37-60℃反应30-60分钟，向其中加入步骤（4）所得产物纳米金颗粒修饰的聚（二烯丙基二甲基氯化铵）包覆的磁性石墨烯，50-70℃反应1-3小时，在外磁场作用下将产物从反应溶液中磁性分离，用去离子水充分洗涤，在40-60℃下真空干燥，得到磁性石墨烯表面包覆聚（二烯丙基二甲基氯化铵）和纳米金颗粒并修饰葡萄糖的亲水性复合纳米材料；
步骤（1）中石墨烯和浓硝酸的比为（0.3-2）g：（30-130）mL；
步骤（2）中酸化石墨烯、乙二醇、六水合三氯化铁、柠檬酸三钠、乙酸钠和聚乙二醇的比为（50-500）mg：（15-150）mL：（130-1000）mg：（50-500）mg：（600-6000）mg：（300-3300）mg；
步骤（3）中氯金酸、水和柠檬酸三钠的比为（2-10）mg：（20-100）mL：（4-20）mg；
步骤（4）中三羟甲基氨基甲烷，氯化钠和聚（二烯丙基二甲基氯化铵）的浓度比为（0.01-0.05）mol/L：（0.01-0.05）mol/L：（0.1-0.5）% ；
步骤（4）中磁性石墨烯和纳米金水溶胶的比为（5-50）mg：（15-250）mL；
步骤（5）中磷酸盐缓冲液的pH值为7.2-7.4；
步骤（5）中2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐和氨基葡萄糖盐酸盐的质量比为（4.8-5.2）：（2.7-3.2）；
步骤（5）中氨基葡萄糖盐酸盐和步骤（4）所得产物纳米金颗粒修饰的聚（二烯丙基二甲基氯化铵）包覆的磁性石墨烯的质量比为（0.7-1.2）：（0.9-1.4）。
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