CN105536748B - 一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法 - Google Patents

一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105536748B
CN105536748B CN201510899008.0A CN201510899008A CN105536748B CN 105536748 B CN105536748 B CN 105536748B CN 201510899008 A CN201510899008 A CN 201510899008A CN 105536748 B CN105536748 B CN 105536748B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanocomposite
graphene
peptide section
dopamine
poly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510899008.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105536748A (zh
Inventor
邓春晖
姚继宗
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fudan University
Original Assignee
Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fudan University filed Critical Fudan University
Priority to CN201510899008.0A priority Critical patent/CN105536748B/zh
Publication of CN105536748A publication Critical patent/CN105536748A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105536748B publication Critical patent/CN105536748B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3828—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation, chelation or metal interaction chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D2015/3838—Ligand exchange chromatography, e.g. complexation chromatography, chelation chromatography, metal interaction chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Inorganic Compounds Of Heavy Metals (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)

Abstract

本发明涉及一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，将纳米复合材料配置成为分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与磷酸化肽段溶液加入50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中混合，在酶解仪中孵育；通过离心分离纳米复合材料，结合MALDI‑TOF MS质谱分析。该纳米复合材料为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料。本方法操作简单，成本低廉，灵敏迅速，被富集肽段信噪比放大倍数高，具有较好的选择性和高灵敏度，十分适用于复杂生物样品中的内源性磷酸化肽的检测。

Description

一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法
技术领域
本发明属于先进纳米材料与纳米技术领域，具体涉及一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，特别是涉及一种石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料结合MALDI-TOF MS用于磷酸化肽富集与检测的方法。
技术背景
蛋白质或多肽的磷酸化是生命过程中最为普遍的翻译后修饰之一。它与细胞分裂、增殖、分化、迁移和细胞间信号传递等许多重要的复杂生物过程息息相关。内源性的磷酸化肽段指的是生物样品中天然含有的那些经过磷酸化修饰的肽段。一些研究表明，内源性的磷酸化肽段的表达水平与很多疾病关系密切，尤其是癌症等人类重大疾病。所以对内源性磷酸化肽的研究对疾病的早期诊断有着重要的意义。质谱分析是目前多肽组学所采用的主要分析手段。但内源性磷酸化肽的丰度往往非常低，并且内源性磷酸化肽段的质谱响应会受到非磷酸化肽和蛋白质的压制，样品中的盐分和表面活性剂同样也会对其质谱行为产生干扰，使得内源性磷酸化肽的电离效率非常低，质谱检测相对较为困难。因此在使用质谱方法分析复杂生物样品中的内源性磷酸化肽段之前，对样品中的内源性磷酸化肽段进行选择性富集是十分必要的。
随着近年来研究的不断深入，许多方法都被用来选择性分离富集磷酸化蛋白和多肽，比如免疫沉淀法、固相萃取法、超滤法、强阳离子交换色谱法、固定金属离子亲和层析法（IMAC）、金属氧化物亲和层析法（MOAC）等等。其中MOAC方法应用最为广泛，效果也较好。通过金属氧化物中金属中心与磷酸化多肽上的磷酸基团间发生配位相互作用，从而起到富集磷酸化多肽的效果。传统的MOAC方法操作简便、快速、成本低廉，并且相比于IMAC方法，选择性好、非磷酸化肽段干扰少。因此，许多MOAC材料被制备出来，广泛应用于磷酸化肽段的富集中。但是传统MOAC方法由于在富集前需要先对生物样品进行酶解，将所有蛋白质酶切为肽段后再进行富集和质谱分析。这个步骤不但会影响内源性磷酸化肽和非内源性磷酸化肽段的磷酸化水平，更会极大的增加数据分析的难度，使后续的数据处理步骤变得繁琐而困难。
介孔材料由于有着狭窄而有序的孔道、非常高的比表面积、连续可调的孔径等优点而被人们广泛关注，近年来发展迅速。由于介孔材料具有狭窄且十分有序的孔道，可以使体积较小的肽段钻入孔道，而将体积较大的蛋白质阻挡在材料外部，来实现对肽段的富集。这可以避免酶切步骤，从而大大降低了因为样品前处理步骤所引入的对样品复杂程度的影响。本发明首次合成了结合传统MOAC材料和介孔材料优点的纳米复合材料，并应用于内源性磷酸化肽段的分离富集。由于介孔二氧化硅良好的体积排阻效应和石墨烯高的表面积以及二氧化钛与磷酸基团间的亲和作用，使得该纳米复合材料可以对复杂生物样品中的内源性磷酸化肽段进行选择性富集，大大提高了磷酸化肽段的质谱信号。对磷酸化肽段的检测限可达5 amol/μL，对非磷酸化肽段的选择性达1:1000（质量比），与磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的体积排阻效应达1:500:500（质量比）。
本发明所涉及的具有介孔结构的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料，合成方法简单快速，二氧化钛微球对磷酸化肽具有高灵敏度和高选择性，石墨烯提高了有效表面，介孔二氧化硅层赋予了材料较好的体积排阻效应。此纳米复合材料可用于选择性地富集生物样品中的低丰度的磷酸化肽和内源性磷酸化肽，并用于MALDI-TOF MS检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法。
本发明提出的一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，具体步骤为：将纳米复合材料配置成为10mg/mL的分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与磷酸化肽段溶液加入到由体积比为50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合液中混合，在酶解仪中孵育30分钟；通过离心分离纳米复合材料，用体积比50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合液洗涤，随后用0.4M氨水洗脱；取1μL洗脱液直接在MALDI-TOF MS进样靶板上点靶，干燥后再点加1μL浓度为20mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液于该液滴上，形成基质结晶，进行质谱分析；
其中，所述的纳米复合材料为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料。
本发明中，纳米复合材料的具体制备步骤如下：
（1）用浓硝酸对石墨烯进行酸化，在60℃条件下反应7小时得到酸化石墨烯，随后用去离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗液呈中性为止，在40-60℃下真空干燥；
（2）配置三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液，溶剂为体积比为1：2的去离子水和乙醇，将步骤（1）所得的酸性石墨烯分散于缓冲液中，超声数分钟，加入多巴胺盐酸盐，在室温下机械搅拌反应6-20小时，制得聚多巴胺包覆的石墨烯；离心分离产物，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；
（3）在异丙醇中分散步骤（2）所得产物，超声20分钟，充分分散；加入二乙胺和异丙醇钛，搅拌均匀，反应温度为180-220℃，反应时间为17-24小时，反应结束后，离心分离产物，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤所得产物，在40-60℃下真空干燥，得到二氧化钛修饰的聚多巴胺包覆的石墨烯；
（4）将步骤（3）所得产物在400℃下煅烧2小时，随后将煅烧产物分散在十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）去离子水溶液中，超声数分钟后，加入氢氧化钠去离子水溶液和去离子水，超声数分钟，于60℃水浴条件下，加入正硅酸乙酯（TEOS）与乙醇混合液，在60℃水浴条件下机械搅拌反应12小时；
（5）步骤（4）所得产物离心分离后用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，随后用丙酮回流24小时两次；
（6）步骤（5）所得产物离心分离后，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥。
本发明中，步骤（1）中石墨烯和浓硝酸的比为（1-3）g：（30-70）ml，更进一步，步骤（1）中石墨烯和浓硝酸的比为2g：50ml。
本发明中，步骤（2）中三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值为8.5。
本发明中，步骤（2）中石墨烯和多巴胺盐酸盐的质量比为1：4。
本发明中，步骤（3）中聚多巴胺包覆的石墨烯和异丙醇的比为（40-60）mg：（35-55）ml，二乙胺和异丙醇钛的体积比为（0.02-0.04）：（1.5-2），更进一步，步骤（3）中聚多巴胺包覆的石墨烯和异丙醇的比为50mg：40ml，二乙胺和异丙醇钛的体积比为0.03：1.8。
本发明中，步骤（3）中反应温度为200℃，反应时间为24小时。
本发明中，步骤（4）中二氧化钛修饰的聚多巴胺包覆的石墨烯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1：10，乙醇与正硅酸乙酯的体积比为4：1。
本发明的有益效果在于：所提供的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料合成方法简单，比表面积较大，具有良好的体积排阻效应，可祛除大体积蛋白并使小分子肽段进入孔道，孔道底部的二氧化钛可同磷酸化肽段上带负电的磷酸基团发生配位作用，特异性富集内源性磷酸化肽段，对磷酸化肽段和内源性磷酸化肽具有较高的选择性、灵敏度和吸附作用，可用作磷酸化肽的固相微萃取吸附富集分离介质。本发明所提供的材料对磷酸化肽段的检测限达到5 amol/μL，对非磷酸化肽段的选择性达1:1000（质量比），对磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的体积排阻效应达1:500:500（质量比）。本方法操作简单，成本低廉，灵敏迅速，可结合MALDI-TOF MS对富集物进行质谱鉴定。被富集肽段信噪比放大倍数高，具有较好的选择性和高灵敏度，十分适用于复杂生物样品中的内源性磷酸化肽的检测。
附图说明
图1为实施例1的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的透射电子显微镜照片，其中a)为100nm的照片，b）为50nm的照片；
图2为实施例1的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的扫描电子显微镜照片, 其中a)为10μm的照片，b）为10μm的照片；
图3为实施例1的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的能量色散X射线光谱；
图4为实施例1的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的X射线衍射图样；
图5为实施例1的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的氮吸附曲线；右边的小图：孔径分布曲线；
图6为实施例2中2mg/mL 的β-Casein酶解液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料a)为富集前原液的质谱图，b)为富集后洗脱液的质谱图；
图7为实施例2中β-Casein酶解液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后质谱图， a)为0.1 fmol/μLβ-Casein酶解液富集后的质谱图; b)为0.01 fmol/μLβ-Casein酶解液富集后的质谱图; c)为5 amol/μLβ-Casein酶解液富集后的质谱图；
图8为实施例3中质量比为1:1000的β-Casein和BSA酶解液的混合溶液a)富集前的质谱图；b) 经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后质谱图；
图9为实施例4中质量比为1:500:500的β-Casein酶解液和磷酸化蛋白α-Casein和非磷酸化蛋白BSA混合溶液，a)为原液质谱图; b)为经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后上清液质谱图; c)为经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后洗脱液质谱图，附图为蛋白情况；
图10为实施例5中未经过酶解处理的健康人血清a)为原液质谱图，b)为经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后上清液质谱图，c)为经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后洗脱液质谱图。
具体实施方式
下面的实施实例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：一种石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的合成。
（1）用浓硝酸对石墨烯进行酸化，1g石墨烯分散于40mL浓硝酸中，在60℃条件下反应7小时；随后用去离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗液呈中性为止，在40-60℃下真空干燥；
（2）配置三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（溶剂为去离子水和乙醇，体积比1:2，pH=8.5），将步骤（1）所获酸化石墨烯10 mg分散于30 mL缓冲液中，超声10分钟，加入15 mL溶解有40 mg多巴胺盐酸盐的水溶液，在室温下机械搅拌反应6-20小时，制得聚多巴胺包覆的石墨烯；离心分离产物，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；
（3）在40mL异丙醇中分散步骤（2）所得产物50mg，超声20分钟，充分分散；加入二乙胺0.03 mL和异丙醇钛1.8 mL，搅拌均匀，200℃加热24小时，反应结束后，离心分离产物，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤所得产物，在40-60℃下真空干燥；
（4）将步骤（3）所得产品在400℃下煅烧2小时，随后将煅烧产物50mg分散在50mL含有500 mg十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的溶液中（溶剂为去离子水），超声30分钟后，加入50 mL 0.01 M的氢氧化钠溶液（溶剂为去离子水）和400 mL去离子水，再超声10分钟，于60℃水浴条件下，加入2.5 mL的正硅酸乙酯（TEOS）与乙醇混合液（体积比为1:4），继续在60℃水浴条件下机械搅拌反应12小时；
（5）步骤（4）所得产物离心分离后用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，随后用丙酮回流24小时，回流两次；
（6）步骤（5）所得产物离心分离后，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥。
图1为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的透射电子显微镜照片；透射电镜型号为JEM-2100F(J0EL)，将纯化后的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的乙醇分散液滴在覆有碳膜的铜网上，干燥后进行透射电子显微镜观察并拍照。其中a)为100nm的照片，b）为50nm的照片，证明材料表面成功包覆了介孔二氧化硅层。
图2为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的扫描电子显微镜照片；扫描电镜型号为Philips XL30，将纯化后的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料均匀涂抹在导电胶上，喷金后进行SEM表征。其中a)为10μm的照片，b）为10μm的照片，表征了材料形貌，证明二氧化钛微球成功地修饰在了聚多巴胺包覆的石墨烯表面。
图3为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的能量色散X射线光谱。
表1 石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料元素分布表
原子序数 元素符号 元素名称 质量浓度 误差
22 Ti 钛 46.7 0.1
14 Si 硅 13.9 0.0
6 C 碳 4.1 1.0
8 O 氧 31.1 0.5
7 N 氮 4.2 0.5
证明了材料中含有C、N、O、Si和Ti元素。
图4为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的X射线衍射图样；X射线衍射仪型号为Bruker D4 X-ray diffractometer。证明了合成步骤可以保持石墨烯和二氧化钛微球的晶型与形态。
图5为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的氮吸附曲线；右边的小图：孔径分布曲线。证明了材料存在介孔结构，孔径约为3.01nm。
实施例2：将实施例1得到的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质用于低浓度β-Casein酶解液的富集与MALDI-TOF MS检测。
（1）标准蛋白酶解液的制备：准确称取2mgβ-Casein标准蛋白，用25mM碳酸氢铵溶液配成浓度为 2mg/mL的标准蛋白溶液，pH大约为8.0，煮沸十分钟。按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育15小时，可得到2 mg/mL的β-Casein胰蛋白酶解液。
（2）样品的富集：用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液配制10mg/mL石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的溶液。在0.6 mL的离心管内加入1 μL的2mg/mL的β-Casein酶解液和179 μL的体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液，混匀后加入20 μL的材料溶液，在37°C下震荡富集30分钟；离心分离材料，吸去上清液，用50%乙腈0.1%TFA溶液洗涤材料三遍，然后加入10 μL的0.4 mol/L的氨水，37℃震荡洗脱30分钟，离心分离材料,吸出洗脱液备后用。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOFMS进样靶板上，干燥后再点加1 μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析。
（4）质谱分析以石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质富集得到的磷酸化肽并与富集前的原液质谱图作对比。
浓度为417 fmol/ μL的β-Casein酶解液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后，质谱图中出现了六条归属于β-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=1031.44，m/z=1279.04，m/z=1562.14，m/z=2061.81，m/z=2556.05，m/z=3122.18），四条去磷酸化峰（m/z=1963.88，m/z=2458.01，m/s=2927.29，m/z=3024.24）以及一条来源于α-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=1466.59）。当浓度为5 amol/μL的β-Casein酶解液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后，质谱图中出现了三条归属于β-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=2061.98，m/z=2556.22，m/z=3122.37）以及一条去磷酸化峰（m/z=2465.18）。
实施例3：将实施例1得到的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质用于β-Casein酶解液和牛血清白蛋白（BSA）酶解液的混合溶液的富集与MALDI-TOF MS检测。
（1）标准蛋白酶解液的制备：准确称取2mg标准蛋白β-Casein和5mg标准蛋白BSA，用25 mM碳酸氢铵溶液配成浓度为2 mg/mL和5 mg/mL的标准蛋白溶液，pH大约为8.0，煮沸10分钟。按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育15小时，可得到2 mg/mL的β-Casein胰蛋白酶解液和5 mg/mL的BSA酶解液。
（2）样品的富集：先加入1μL的2mg/mL的β-Casein酶解液后，分别按照β-Casein和BSA的质量比为1:100、1:500和1:1000加入BSA酶解液，随后加入相应体积的体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液使体系配成总体积为180 μL的体系，然后用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液配制10 mg/mL石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的溶液，在上述体系中分别加入20 μL的材料溶液，在37°C下震荡富集30分钟；离心分离材料，吸去上清液，用50%乙腈0.1%TFA溶液洗涤材料三遍，然后加入10 μL的0.4 mol/L的氨水，37℃震荡洗脱30分钟，离心分离材料,吸出洗脱液备后用。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOFMS进样靶板上，干燥后再点加1 μL浓度为20 mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析。
（4）质谱分析以石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质富集得到的磷酸化肽并与富集前的原液质谱图作对比。
质量比为1:1000的β-Casein和BSA的酶解液混合液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后，从质谱图中可以清楚地看到五条来源于β-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=1279.06，m/z=1562.17，m/z=2061.93，m/z=2556.29，m/z=3122.61），四条去磷酸化峰（m/z=1952.04，m/z=2433.23，m/s=2927.61，m/z=3024.61）。
实施例4：将实施例1得到的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质用于β-Casein酶解液、α-Casein蛋白和牛血清白蛋白（BSA）的混合溶液的富集与MALDI-TOF MS检测。
（1）标准蛋白酶解液的制备：准确称取2mg的β-Casein标准蛋白，用25mM碳酸氢铵溶液配成浓度为2 mg/mL的标准蛋白溶液，pH大约为8.0，煮沸十分钟。按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育15小时，可得到2 mg/mL的β-Casein胰蛋白酶解液。
（2）样品的富集：用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液配制10mg/mL石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的溶液。用高纯水配制5 mg/mL的α-Casein和BSA蛋白溶液。在0.6 mL的离心管内加入1 μL的2mg/mL的β-Casein酶解液，按照β-Casein、α-Casein和BSA的质量比为1:100:100、1:300:300和1:500:500的比例加入相应的α-Casein和BSA溶液，并用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液补全体积到180 μL，混匀后加入20 μL的材料溶液，在37°C下震荡富集30分钟；离心分离材料，吸去上清液，用50%乙腈0.1%TFA溶液洗涤材料三遍，然后加入10 μL的0.4 mol/L的氨水，37℃震荡洗脱30分钟，离心分离材料,吸出洗脱液备后用。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOFMS进样靶板上，干燥后再点加1 μL浓度为20 mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析。
（4）质谱分析以石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质富集得到的磷酸化肽并与富集前的原液和富集后的上清液的质谱图作对比。
质量比为1:500:500的β-Casein、α-Casein和BSA的混合液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后，从质谱图中可以清楚地看到四条来源于β-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=1035.55，m/z=2061.93，m/z=2556.29，m/z=3122.61），三条去磷酸化峰（m/z=1962.21， m/s=2927.61，m/z=3025.53）。
实施例5：将实施例1得到的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质用于健康人血清样品中内源性磷酸化肽的富集与MALDI-TOF MS检测。
（1）样品准备：用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液稀释健康人血清样品十倍。用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液配制10 mg/mL石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的溶液。
（2）样品的富集：在0.6mL的离心管内加入10μL的稀释过的健康人血清，加入170 μL的体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液，混匀后加入20 μL的材料溶液，在37°C下震荡富集30分钟；离心分离材料，吸去上清液，用50%乙腈0.1%TFA溶液洗涤材料三遍，然后加入10 μL的0.4 mol/L的氨水，37℃震荡洗脱30分钟，离心分离材料,吸出洗脱液备后用。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOFMS进样靶板上，干燥后再点加1 μL浓度为20 mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析。
（4）质谱分析以石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质富集得到的内源性磷酸化肽并与富集前的原液和富集后的上清液的质谱图作对比。
健康人血清富集前，由于受到严重的烦扰，无法看到内源性磷酸化肽的质谱峰，而经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后，质谱图中可以看到四条健康人血清中的内源性磷酸化肽的峰（m/z=1389.41，m/z=1460.55，m/z=1545.52，m/z=1616.56）。

Claims (9)

1.一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于具体步骤为：将纳米复合材料配置成为10mg/mL的分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与磷酸化肽段溶液加入到由体积比为50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合液中混合，在酶解仪中孵育30分钟；通过离心分离纳米复合材料，用体积比50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合液洗涤，随后用0.4M氨水洗脱；取1μL洗脱液直接在MALDI-TOF MS进样靶板上点靶，干燥后再点加1μL浓度为20mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液于该液滴上，形成基质结晶，进行质谱分析；
其中，所述的纳米复合材料为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料，所述的纳米复合材料具体制备步骤如下：
（1）、用浓硝酸对石墨烯进行酸化，在60℃条件下反应7小时得到酸化石墨烯，随后用去离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗液呈中性为止，在40-60℃下真空干燥；
（２）、配置三羟甲基氨基甲烷缓冲液，溶剂采用体积比为1：2的去离子水和乙醇，将步骤（1）所得的酸化石墨烯分散于缓冲液中，超声10分钟，加入多巴胺盐酸盐，在室温下机械搅拌反应6-20小时，制得聚多巴胺包覆的石墨烯；离心分离产物，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；
（３）、在异丙醇中分散步骤（2）所得产物，超声20分钟，充分分散；加入二乙胺和异丙醇钛，搅拌均匀，反应温度为180-220℃，反应时间为17-24小时，反应结束后，离心分离产物，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤所得产物，在40-60℃下真空干燥，得到二氧化钛修饰的聚多巴胺包覆的石墨烯；
（４）、将步骤（3）所得产物在400℃下煅烧2小时，随后将煅烧产物分散在十六烷基三甲基溴化铵去离子水溶液中，超声30分钟后，加入氢氧化钠去离子水溶液和去离子水，超声10分钟，于60℃水浴条件下，加入正硅酸乙酯与乙醇混合液，在60℃水浴条件下机械搅拌反应12小时；
（５）、步骤（4）所得产物离心分离后用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，随后用丙酮回流24小时，回流两次；
（６）、步骤（5）所得产物离心分离后，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥。
2.根据权利要求1所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（1）中石墨烯和浓硝酸的比为（1-3）g：（30-70）ml。
3.根据权利要求2所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（1）中石墨烯和浓硝酸的比为2g：50ml。
4.根据权利要求1所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（2）中三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值为8.5。
5.根据权利要求1所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（2）中石墨烯和多巴胺盐酸盐的质量比为1：4。
6.根据权利要求1所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（3）中聚多巴胺包覆的石墨烯和异丙醇的比为（40-60）mg：（35-55）ml，二乙胺和异丙醇钛的体积比为（0.02-0.04）：（1.5-2）。
7.根据权利要求6所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（3）中聚多巴胺包覆的石墨烯和异丙醇的比为50mg：40ml，二乙胺和异丙醇钛的体积比为0.03：1.8。
8.根据权利要求6所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（3）中所述反应温度为200℃，反应时间为24小时。
9.根据权利要求1所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（4）中二氧化钛修饰的聚多巴胺包覆的石墨烯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1：10，乙醇与正硅酸乙酯的体积比为4：1。
CN201510899008.0A 2015-12-09 2015-12-09 一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法 Expired - Fee Related CN105536748B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510899008.0A CN105536748B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510899008.0A CN105536748B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105536748A CN105536748A (zh) 2016-05-04
CN105536748B true CN105536748B (zh) 2018-10-16

Family

ID=55816586

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510899008.0A Expired - Fee Related CN105536748B (zh) 2015-12-09 2015-12-09 一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105536748B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106140094A (zh) * 2016-07-04 2016-11-23 复旦大学 金属有机骨架修饰的磁性石墨烯复合材料的合成方法和应用
CN106581688A (zh) * 2016-11-08 2017-04-26 国家纳米科学中心 一种基于石墨烯的药物载体及其制备方法
CN106884156A (zh) * 2017-02-08 2017-06-23 复旦大学 一种靶板上修饰二氧化钛纳米薄膜的方法及其应用
CN106732408A (zh) * 2017-02-09 2017-05-31 复旦大学 一种亲水性磁性介孔硅材料的合成方法及其应用
CN107167542B (zh) * 2017-06-28 2020-07-14 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种用于磷酸肽富集和分离的离心式装置
CN111834636B (zh) * 2020-07-21 2021-11-02 陕西师范大学 一种大比表面积氮掺杂TiO锂硫电池正极载体的制备方法
CN115245813B (zh) * 2021-04-25 2023-09-26 中国科学院大连化学物理研究所 一种复合微球及其制备和在磷酸化肽吸附中的应用
CN117567426B (zh) * 2024-01-19 2024-04-23 寿光金远东变性淀粉有限公司 一种丙交酯生产方法及装置

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101066988A (zh) * 2007-05-10 2007-11-07 复旦大学 一种具有核壳结构的磁性金属氧化物微球及其制备方法
CN103012806A (zh) * 2012-12-27 2013-04-03 复旦大学 一种聚多巴胺修饰的碳纳米管复合材料的合成方法及其应用
CN103232991A (zh) * 2013-04-11 2013-08-07 复旦大学 一种多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成方法及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1358202A2 (en) * 2000-02-08 2003-11-05 The Regents Of The University Of Michigan Protein separation and display

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101066988A (zh) * 2007-05-10 2007-11-07 复旦大学 一种具有核壳结构的磁性金属氧化物微球及其制备方法
CN103012806A (zh) * 2012-12-27 2013-04-03 复旦大学 一种聚多巴胺修饰的碳纳米管复合材料的合成方法及其应用
CN103232991A (zh) * 2013-04-11 2013-08-07 复旦大学 一种多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hydrophilic Polydopamine-Coated Graphene for Metal Ion Immobilization as a Novel Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography Platform for Phosphoproteome Analysis;Yinghua Yan et al.;《Analytical Chemistry》;20130813;第85卷;第8483-8487页 *
基于聚多巴胺修饰的ZipTip吸管尖选择性富集分离磷酸化肽;史辰漪 等;《第二十届全国色谱学术报告会及仪器展览会论文集》;20150419;第190页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105536748A (zh) 2016-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105536748B (zh) 一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法
CN103894161B (zh) 一种磁性金属有机骨架复合材料的合成方法及其应用
Sun et al. Hydrophilic Nb5+-immobilized magnetic core–shell microsphere–A novel immobilized metal ion affinity chromatography material for highly selective enrichment of phosphopeptides
CN106512965A (zh) 一种金属有机骨架纳米复合材料的合成方法及其应用
Leitner et al. Tools for analyzing the phosphoproteome and other phosphorylated biomolecules: a review
Sun et al. Magnetite nanoparticles coated with mercaptosuccinic acid-modified mesoporous titania as a hydrophilic sorbent for glycopeptides and phosphopeptides prior to their quantitation by LC-MS/MS
Lin et al. Development of immobilized Sn4+ affinity chromatography material for highly selective enrichment of phosphopeptides
CN105363426B (zh) 一种介孔二氧化硅复合材料结合质谱鉴定肽段的方法
US7560030B2 (en) Method for separation and enrichment of phosphopeptides
Yao et al. Rapid synthesis of titanium (IV)‐immobilized magnetic mesoporous silica nanoparticles for endogenous phosphopeptides enrichment
CN103940894B (zh) 一种同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段并质谱分析的方法
CN106268707A (zh) 一种基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法
CN101054406A (zh) 采用金属氧化物磁性微球分离富集磷酸化肽段的方法
Zhang et al. Phytic acid functionalized Fe 3 O 4 nanoparticles loaded with Ti (IV) ions for phosphopeptide enrichment in mass spectrometric analysis
CN107607640A (zh) 一种硼酸修饰的纳米复合材料的糖肽富集与质谱检测方法
CN106770614B (zh) 亲水性纳米复合材料结合质谱分析鉴定糖基化肽段的方法
CN106732409A (zh) 磺酸基修饰的金属有机骨架纳米复合材料的合成方法及其应用
CN108440641A (zh) 一种特异性分离富集磷酸化肽和糖基化肽的方法
Zhai et al. Evaluation of serum phosphopeptides as potential cancer biomarkers by mass spectrometric absolute quantification
CN109942667A (zh) 二维金属有机骨架纳米片富集磷酸化肽段的方法和应用
Hu et al. Dual metal cations coated magnetic mesoporous silica probe for highly selective capture of endogenous phosphopeptides in biological samples
Han et al. Simple preparation of magnetic metal-organic frameworks composite as a “bait” for phosphoproteome research
Müller et al. Dual-polarity SALDI FT-ICR MS imaging and Kendrick mass defect data filtering for lipid analysis
Wei et al. Enrichment of serum biomarkers by magnetic metal-organic framework composites
CN104109187B (zh) 一种胍基功能化石墨烯材料及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20181016

Termination date: 20211209

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee