CN103232991A - 一种多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米技术领域，具体涉及一种多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成方法及其应用。首先，将磁性介孔硅材料分散至多巴胺水溶液中，分散均匀；加入浓度为0.2M的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，所得溶液在室温下振荡反应2-4小时；充分洗涤；分散于浓度为0.2M的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中，并加入戊二醛，所得溶液在室温下振荡反应0.5-1小时；充分洗涤；分散于含2mg/mL的胰蛋白酶的浓度为25mM的碳酸氢铵缓冲溶液中，在室温下振荡反应2小时；充分洗涤，除去产物表面的杂质，即得所需材料。该材料以磁性微球为骨架，提供磁性，利于后续分离分析，具有较好的孔径分布和生物相容性，合成方法简单、成本低，可在孔道内部固定酶进行体积排阻选择性酶解。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料与纳米技术领域，具体涉及一种用于体积排阻选择性酶解的多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成方法及其应用。
背景技术
近年来，蛋白质组学已成为发展最快的生物研究领域之一，成为生命科学研究不可或缺的一部分。如果要获得蛋白的详细结构信息，常常选择通过化学水解或酶消化将蛋白质裂解成较小的多肽片段，然后将所得的多肽混合物进入质谱分析。肽指纹图谱（PMF）的定性鉴定仍是目前研究中最强大和最简单的方法。目前，小分子量的蛋白质已被证明是了解生物标志物和信号分子的病理学应用以及详细信息的重要研究对象，在生物生物系统中发挥重要的作用。然而由于生物样品的复杂性，其中大分子量的蛋白质的干扰严重影响了生物样品中的低分子量的蛋白质的测定。于是，体积排阻酶解的方法被提出来可以有效地解决这一问题。
磁性四氧化三铁微球有着成熟简便的合成工艺，成本低廉，具有良好的磁性。在外加磁场的作用下可以简便的将材料与溶液体系分离，大大简化了由于离心等其他分离手段带来的实验操作步骤。
将介孔硅包覆在磁性四氧化三铁微球表面，可以使得材料有较窄的孔径分布，较高的比表面积和孔容积。利用自组装的方法，通过控制模板剂分子的尺寸来控制孔径的大小，然后通过进一步修饰上官能团来改变材料的性质。此后在其孔道内部固定酶，可以作为纳米级的生物催化剂提供高速、高通量的蛋白分析。
因此，可以提出一种用于体积排阻选择性酶解的多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成及其应用。
发明内容
本发明目的在于提供一种多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成方法及其应用。
本发明提出的一种多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成方法，具体步骤如下：
（1）将磁性介孔硅分散至多巴胺水溶液中，分散均匀，其中，磁性介孔硅与多巴胺的用量比是1g:0.5mmol-1g:1.5mmol；
（2）在步骤（1）所得的产物中加入浓度为0.15M-0.25M的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，所得溶液在室温下振荡反应2-4小时；
（3）将步骤（2）所得的产物充分洗涤；
（4）将步骤（3）所得的产物分散于浓度为0.15M-0.25M的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中，并加入体积分数为20%-30%的戊二醛，所得溶液在室温下振荡反应0.5-1.5小时；
（5）将步骤（4）所得的产物充分洗涤，除去产物表面的杂质；
（6）将步骤（5）所得的产物分散于含1.5-2.5 mg/mL的胰蛋白酶的浓度为25mM的碳酸氢铵缓冲溶液中，在室温下振荡反应2小时；
（7）将步骤（6）所得的产物充分洗涤，除去产物表面的杂质，即得所需材料。
本发明中，步骤（1）中的磁性介孔硅的合成步骤如下：
（1）将1.30g-1.40g六水合氯化铁溶解于70-80mL乙二醇中，搅拌至澄清；
（2）在步骤（1）所得的产物中加入3.4g-3.8g醋酸钠，搅拌至澄清后持续搅拌1-3小时；
（3）将步骤（2）所得的产物超声5min后转入反应釜，在200摄氏度条件下反应16小时；
（4）将步骤（3）所得的产物充分洗涤，得到磁性介孔硅。
本发明中，将得到的的多巴胺修饰的磁性介孔硅材料作为固定酶对蛋白样品的体积排阻酶解的应用，具体为：将混合蛋白与多巴胺修饰的磁性介孔硅材料充分混合，分散均匀，在37℃-38℃下振荡酶解10-15min，利用磁铁将多巴胺修饰的磁性介孔硅材料与溶液分离。
将小分子量的蛋白与大分子量的蛋白进行混合，利用该种材料进行快速酶解，进行质谱检测之后，小蛋白得以成功酶解，而大蛋白没有被酶解。利用模板剂合成的磁性介孔硅材料具有较窄的孔径分布，约为6.2nm，将酶固定在孔道内部，尺寸小于孔径的小蛋白得以选择性地酶解。
本发明的有益效果在于：磁性四氧化三铁微球的引入可以简便的将材料与溶液体系分离，大大简化了实验操作。利用聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯作为模板剂，在磁性微球表面包覆一层介孔硅，并进一步修饰上多巴胺以及戊二醛，最终在孔道内固定酶进行对蛋白样品的体积排阻酶解。多巴胺的引入使得材料具有优秀的环境稳定性和生物相容性，与戊二醛的简单结合也使得固定酶的方法变得简单快捷。其合成方法简单、成本低，可以够作为纳米级的生物催化剂提供高速、高通量的蛋白分析。
附图说明
图1为实施例1中多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的扫描电子显微镜照片；
图2为实施例1中多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的透射电子显微镜照片；
图3为实施例1中多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的红外谱图；
图4 为实施例4中传统溶液过夜酶解对Cyt c与Pho b混合样品的酶解质谱图；
图5为实施例4中多巴胺修饰的磁性介孔硅材料对Cyt c与Pho b混合样品的酶解质谱图；
图6为实施例4中传统溶液过夜酶解对myoglobin与Pho b混合样品的酶解质谱图；
图7为实施例4中多巴胺修饰的磁性介孔硅材料对myoglobin与Pho b混合样品的酶解质谱图；
图8为实施例5中多巴胺修饰的磁性介孔硅材料对实际脱脂奶粉与Pho b混合样品进行体积排阻酶解结果。
图9为实施例5中传统溶液过夜酶解对实际脱脂奶粉与Pho b混合样品的酶解结果。
其中，*为Cyt c和 myoglobin酶解肽段；○为Pho b酶解肽段。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1
磁性介孔硅材料的合成步骤如下：
（1）将1.35g 六水合氯化铁溶解于75mL乙二醇中，搅拌至澄清；
（2）体系中加入3.6g醋酸钠，搅拌至澄清后持续搅拌1小时；
（3）将体系超声5min后转入反应釜，在200摄氏度条件下反应16小时；
（4）所得产物用去离子水洗5次后，得到四氧化三铁磁性微球。
多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成方法与固定酶
（1）将10mg磁性介孔硅材料分散至浓度为1.0mM/L的10mL多巴胺水溶液中，超声30min使其分散均匀；
（2）体系中加入30mL浓度为0.2M（pH为7.4）的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，所得溶液在室温下振荡反应3小时；
（3）所得产物用去离子水洗涤三次，除去产物表面的杂质；
（4）将产物分散于5mL 浓度为0.2M（pH为7.4）的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中，并加入200μL 体积分数比为25%的戊二醛，所得溶液在室温下振荡反应0.5小时；
（5）所得产物用去离子水洗涤三次，除去产物表面的杂质；
（6）将产物分散于含2mg/mL 的胰蛋白酶的浓度为25mM的碳酸氢铵缓冲溶液中，在室温下振荡反应2小时；
（7）将步骤（6）所得的产物用去离子水洗涤三次，除去产物表面的杂质，得到最终孔道内固定酶的磁性介孔硅材料。
如图1-3，所得的多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的扫描电子显微镜照片 (20 KV，飞利浦 XL30电子显微镜，荷兰) 如图1所示，透射电子显微镜照片 (200KV，日本株式会社2011显微镜，日本) 如图2所示，红外谱图（扫描次数：32 Nicolet Nexus 470红外光谱仪，美国）如图3所示。
实施例2:
磁性介孔硅材料的合成，具体步骤如下：
（1）将1.3g 六水合氯化铁溶解于70mL乙二醇中，搅拌至澄清；
（2）体系中加入3.4g醋酸钠，搅拌至澄清后持续搅拌1小时；
（3）将体系超声5min后转入反应釜，在200摄氏度条件下反应16小时；
（4）所得产物用去离子水洗5次后，得到四氧化三铁磁性微球。
多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成与固定酶的步骤如下：
（1）将10mg磁性介孔硅材料分散至浓度为0.5mM/L的10mL多巴胺水溶液中，超声30min使其分散均匀；
（2）体系中加入30mL浓度为0.15M的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，所得溶液在室温下振荡反应2小时；
（3）所得产物用去离子水洗涤三次，除去产物表面的杂质；
（4）将产物分散于5mL 浓度为0.15M的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中，并加入200μL体积分数比为 20%的戊二醛，所得溶液在室温下振荡反应0.5小时；
（5）所得产物用去离子水洗涤三次，除去产物表面的杂质；
（6）将产物分散于含1.5mg/mL 的胰蛋白酶的浓度为25mM的碳酸氢铵缓冲溶液中，在室温下振荡反应2小时；
（7）将步骤（6）所得的产物用去离子水洗涤三次，除去产物表面的杂质，得到最终孔道内固定酶的磁性介孔硅材料。
实施例3:
磁性介孔硅材料的合成，具体步骤如下：
（1）将1.4g 六水合氯化铁溶解于80mL乙二醇中，搅拌至澄清；
（2）体系中加入3.8g醋酸钠，搅拌至澄清后持续搅拌3小时；
（3）将体系超声5min后转入反应釜，在200摄氏度条件下反应16小时；
（4）所得产物用去离子水洗5次后，得到四氧化三铁磁性微球。
多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成与固定酶，具体步骤如下：
（1）将10mg磁性介孔硅材料分散至浓度为1.5mM/L的10mL多巴胺水溶液中，超声30min使其分散均匀；
（2）体系中加入30mL浓度为0.25M的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，所得溶液在室温下振荡反应2小时；
（3）所得产物用去离子水洗涤三次，除去产物表面的杂质；
（4）将产物分散于5mL 浓度为0.25M的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中，并加入200μL体积分数比为 30%的戊二醛，所得溶液在室温下振荡反应0.5小时；
（5）所得产物用去离子水洗涤三次，除去产物表面的杂质；
（6）将产物分散于含2.5mg/mL 的胰蛋白酶的浓度为25mM的碳酸氢铵缓冲溶液中，在室温下振荡反应2小时；
（7）将步骤（6）所得的产物用去离子水洗涤三次，除去产物表面的杂质，得到最终孔道内固定酶的磁性介孔硅材料。
实施例4：
多巴胺修饰的磁性介孔硅材料固定酶进行选择性体积排阻酶解标准蛋白
（1）试样准备：以由Phosphorylase b from rabbit muscle (Pho b MW=97,200Da) 作为大分子量的蛋白，分别与cytochrome c (Cyt c MW=12384Da) 和myoglobin(MW=17000Da) 等比例混合进行酶解实验。配置浓度分别为0.1mg/mL的MYO与Pho b蛋白混合溶液以及浓度分别为0.1mg/mL的Cyt c与Pho b蛋白混合溶液（以25mM的NH4HCO3为缓冲溶液）。煮沸变性。
（2）酶解：取20μL混合蛋白与200μg实施例1得到的多巴胺修饰的磁性介孔硅材料混合，超声分散1min，在37℃条件下振荡酶解10min，利用磁铁将材料与溶液分离。
（3）将材料固定酶酶解混合蛋白与传统溶液过夜酶解混合蛋白的进行质谱分析。
如图4-7，可以看出：从图4与图5的对比，以及图6与图7的对比中可以看出，经过多巴胺修饰的磁性介孔硅体积排阻酶解之后，Pho b蛋白的酶解得到了有效的抑制。在体积排阻酶解图中几乎看不到Pho b蛋白的酶解肽段峰；而小分子量的Cyt c 和MYO蛋白的酶解肽段峰仍能够准确地观察到。
实施例5
多巴胺修饰的磁性介孔硅材料固定酶进行选择性体积排阻酶解脱脂奶粉实际样品
（1）试样准备：以由Phosphorylase b from rabbit muscle (Pho b MW=97,200Da) 作为大分子量的蛋白，与脱脂奶粉提取出的蛋白进行等比例混合进行酶解实验。配置浓度分别为0.1mg/mL的脱脂奶粉蛋白与Pho b蛋白混合溶液（以25mM的NH4HCO3为缓冲溶液）。煮沸变性。
（2）酶解：取20μL混合蛋白与200μg实施例2得到的多巴胺修饰的磁性介孔硅材料混合，超声分散1min，在37℃条件下振荡酶解30min，利用磁铁将材料与溶液分离。
（3）将材料固定酶酶解混合蛋白样品的酶解液以及传统溶液过夜酶解的酶解液进行LC-MS/MS分析并搜库比较。
LC-MS/MS 分析步骤如下：
1）将酶解后的肽段完全冻干。干粉使用色谱流动相A相溶解(0.5%乙酸水溶液)后，15000rpm转速以上离心5分钟，吸取上清；
2）取20μL进样，设置线性分离的色谱流动相B（0.5%乙酸+80%乙腈水溶液）从5%到35%，再以75 nl/min的流速，以90%的B相进行洗脱。梯度的时长为140min；
3）LC系统直接与LTQ线性离子阱质谱相连，源工作电压为2.1kV,离子传输管在200摄氏度下工作。质谱设定为数据相关模式进行分析。
如图8-9，可以看出：传统过夜酶解混合蛋白搜库的结果显示，得到酶解的蛋白的分子量主要集中在60-100KDa，而经过多巴胺修饰的磁性介孔硅体积排阻酶解后，得到酶解的蛋白的分子量主要集中在了20-40KDa，小分子量的蛋白得到了选择性的酶解。从而说明材料在体积排阻酶解方面的成功应用。
Claims (3)
1.一种多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成方法，其特征在于具体步骤如下：
（1）将磁性介孔硅分散至多巴胺水溶液中，分散均匀，其中，磁性介孔硅与多巴胺的用量比是1g:0.5mmol-1g:1.5mmol；
（2）在步骤（1）所得的产物中加入浓度为0.15M-0.25M的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液，所得溶液在室温下振荡反应2-4小时；
（3）将步骤（2）所得的产物充分洗涤；
（4）将步骤（3）所得的产物分散于浓度为0.15M-0.25M的磷酸一氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液中，并加入体积分数为20%-30%的戊二醛，所得溶液在室温下振荡反应0.5-1.5小时；
（5）将步骤（4）所得的产物充分洗涤，除去产物表面的杂质；
（6）将步骤（5）所得的产物分散于含1.5-2.5 mg/mL的胰蛋白酶的浓度为25mM的碳酸氢铵缓冲溶液中，在室温下振荡反应2小时；
（7）将步骤（6）所得的产物充分洗涤，除去产物表面的杂质，即得所需材料。
2.根据权利要求1所述的一种多巴胺修饰的磁性介孔硅材料的合成方法，其特征在于步骤（1）中的磁性介孔硅的合成步骤是：
（1）将1.30g-1.40g六水合氯化铁溶解于70-80mL乙二醇中，搅拌至澄清；
（2）在步骤（1）所得的产物中加入3.4g-3.8g醋酸钠，搅拌至澄清后持续搅拌1-3小时；
（3）将步骤（2）所得的产物超声5min后转入反应釜，在200摄氏度条件下反应16小时；
（4）将步骤（3）所得的产物充分洗涤，得到磁性介孔硅。
3.一种如权利要求1所述合成方法得到的的多巴胺修饰的磁性介孔硅材料作为固定酶对蛋白样品的体积排阻酶解的应用，其特征在于将混合蛋白与多巴胺修饰的磁性介孔硅材料充分混合，分散均匀，在37℃-38℃下振荡酶解10-15min，利用磁铁将多巴胺修饰的磁性介孔硅材料与溶液分离。
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