CN103736433A - 一种疏水磁性介孔微球及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于有机-无机复合纳米材料的制备领域,具体涉及一种疏水磁性介孔微球及其制备方法和应用。疏水磁性介孔微球制备过程如下:(1)通过溶胶-凝胶反应,以表面活性剂作为结构导向剂,在磁性无机纳米颗粒表面包覆上掺杂疏水基团的具有有序介孔结构的二氧化硅/表面活性剂复合材料;(2)再通过溶剂萃取除去表面活性剂,得到疏水磁性介孔微球。本发明制得的疏水磁性介孔微球具有良好的核-壳形貌,磁场感应性好,特异性强,在蛋白质组学等领域有良好的使用价值和潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于有机-无机复合材料的制备领域,具体涉及一种疏水磁性介孔微球及其制备方法和应用。
背景技术
近年来,随着质谱技术生物信息学的发展,人们发现内源性肽段包含了可能记录人类生理和病理状态的生物标记物,这些标记物可能比常规标记物具有更高的临床灵敏性和特异性,有望用于癌症等重大疾病的早期诊断。然而,这一研究面临的一个重要问题是复杂生物体体液(包括血液、淋巴和组织液)中高丰度生物大分子(如:蛋白质等)的大量存在对低丰度内源性肽产生夹带、包覆,以至掩盖的作用,以现有的分析技术和检测手段难以发现并分离鉴定低丰度的内源性肽,这已成为内源性研究的瓶颈问题之一。
目前复杂生物样品中分离富集肽段的方法有:固相萃取法(SPE)、硼酸富集法、反相色谱法等。寻找一种新的、快速、简便的富集方法是非常必要的,其中,基于疏水作用的材料由于具有极好的重现性、高选择性等优点,呈现出良好的应用潜力,得到了广泛的关注。
磁性介孔复合材料由于其良好的磁响应性、大的比表面积、均一的介孔孔道以及特殊的尺寸排阻效应,可作为一种简便有效的分离富集方法应用于肽段富集研究。目前疏水性的磁性介孔复合材料作为多肽的分离富集鲜有报道。因此迫切需要发明一种疏水磁性介孔微球。
发明内容
本发明的目的是针对疏水性磁性介孔复合材料鲜有用于多肽的分离富集,提供一种疏水磁性介孔微球及其制备方法和应用。经本发明制备的疏水磁性介孔微球具有良好的核-壳形貌,磁场感应性好,特异性强,能用于标准蛋白质、多肽混合液中多肽的选择性分离,以及人血清样品中疏水性肽段的富集,具有良好的使用价值和潜在的应用前景。
为了实现本发明,本发明采用的技术方案如下:
一种疏水磁性介孔微球的制备方法,以有机表面活性剂为辅助模板,将疏水性硅烷偶联剂掺杂修饰在磁性无机纳米颗粒表面,形成具有疏水基团的有序介孔微球;然后采用溶胶-凝胶法在微球表面包覆一层硅烷偶联剂用以覆盖疏水基团,通过溶剂萃取去除有机表面活性剂,即得到疏水磁性介孔微球。
所述的有机表面活性剂为非离子型表面活性剂或离子型表面活性剂;非离子型表面活性剂为含聚醚的小分子CnH2n+1EOm中的一种或几种,n=5-12、 m=10-20;离子型表面活性剂为烷基季铵盐类表面活性剂CnTAB或CnTAC中的一种或几种,n=12-18。
所述的疏水性硅烷偶联剂为正辛基三乙氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、苯胺甲基三乙氧基硅烷、正十八烷基三乙氧基硅烷中的一种或几种。
所述的磁性无机纳米颗粒为采用水热法合成的四氧化三铁纳米颗粒。
所述的硅烷偶联剂为氨丙基三乙氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷、氯丙基三乙氧基硅烷中的一种或几种。
所述的疏水磁性介孔微球的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)将磁性无机纳米颗粒分散在水溶液中,然后加入有机表面活性剂,超声处理,并加入乙醇、硅烷前驱体及疏水性硅烷偶联剂,再加入催化剂超声使其均匀混合;
(2)在温度为30℃-80℃,采用溶胶-凝胶法在磁性无机纳米颗粒表面形成一层掺杂有疏水基团的具有有序介孔结构的二氧化硅/表面活性剂复合纳米微球,再滴加硅烷偶联剂的醇溶液,覆盖微球表面的疏水基团;然后通过溶剂萃取除去有机表面活性剂,即得到疏水磁性介孔微球;
步骤(1)所述的硅烷前驱体为四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷中的一种或两种;所述的催化剂为酸性催化剂或碱性催化剂,碱性催化剂为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或几种,酸性催化剂为醋酸、盐酸中的一种或两种;
步骤(2)所述的硅烷偶联剂的醇溶液为烷基醇和硅烷偶联剂的混合溶液,其中烷基醇为甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种,烷基醇、硅烷偶联剂的体积比为1~9: 1;
根据如上所述的制备方法制得的疏水磁性介孔微球。
根据如上所述的制备方法制得的疏水磁性介孔微球,能用于标准蛋白质、多肽混合液中多肽的选择性分离,以及人血清样品中疏水性肽段的富集。
步骤(2)所述的溶剂萃取:所使用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮的一种或几种。
本发明的有益效果在于:
(1)本发明制备的疏水磁性介孔微球可直接放入复杂生物样品中,无需特殊处理;疏水化肽段被吸附到微球上后,无需经过离心分离,采用简单磁性作用即可实现疏水肽段的特异性分离富集;
(2)经本发明制备的疏水磁性介孔微球具有良好的核-壳形貌,磁场感应性好,特异性强,能用于标准蛋白质、多肽混合液中多肽的选择性分离,以及人血清样品中疏水性肽段的富集,具有良好的使用价值和潜在的应用前景。
附图说明
图1为实施例1所合成的四氧化三铁纳米粒子(左)和疏水磁性介孔微球(右)的扫描电镜图;
图2为实施例1所合成的疏水磁性介孔微球的透射电镜图;
图3为实施例1所合成的去除模板CTAB的磁性介孔微球(a)、含有CTAB模板的磁性介孔微球(b)的红外谱图;
图4为实施例1所合成的磁性微球(a)和疏水磁性介孔微球(b)的磁滞回线图;
图5为疏水磁性介孔微球的尺寸排阻效应对于多肽和蛋白质HPLC分离色谱图,图中标准液(a)(含多肽+蛋白质原溶液)、上清液(b)、吸附后洗脱液(c);
图6为实施例1所合成的疏水磁性介孔微球用于富集复杂生物样品(人血清)中疏水性肽段HPLC分离色谱图,标准混合液(a),上清液(b),洗脱液(c)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。本发明采用的原材料可在市场购得,或可用本领域已知的方法合成。
实施例1
水热法合成磁性无机纳米颗粒:采用10.81 克FeCl3·6H2O,加入13.12 克醋酸钠作为分散剂,在200 mL乙二醇溶液中混匀,添加2.058 克二水柠檬酸三钠,然后将该溶液移入密闭加热容器中,在200 ℃条件下进行溶剂热反应,加热时间12 h,得到四氧化三铁磁性无机纳米颗粒;将产物洗涤干净后,在60 ℃下真空干燥12 h。
磁性介孔微球纳米颗粒的制备:将四氧化三铁磁性无机纳米颗粒与CTAB以1 mg/10mg的比例混合,溶解在50 mL水溶液中,超声处理,缓慢加入30 mL乙醇,超声直至无气泡产生,加入24 μL苯基三乙氧基硅烷和96 μL正硅烷四乙酯,在45 ℃下强力搅拌,然后加入氨水2 mL,反应6 小时,即得到含有模板的疏水磁性介孔微球。
溶剂萃取法去除表面活性剂:将上述所得的含有模板的疏水磁性介孔微球在60 mL乙醇中回流萃取五次,每次2小时,以除去表面活性剂,即得到疏水磁性介孔微球颗粒。
图1为实施例1中所合成的疏水磁性介孔微球的扫描电镜图,可以看出四氧化三铁纳米粒子(左)的粒径在400nm左右,分散性良好。合成后的疏水磁性介孔微球(右)表面发生了明显的变化,说明硅烷试剂确定包裹在磁性微粒表面。
图2为实施例1得到的疏水磁性介孔微球的透射电镜图,可以看出其具有明显的核-壳结构,且壳具有垂直有序介孔结构,说明磁性纳米粒子在溶胶-凝胶反应后成功地包覆上介孔SiO2壳,印证了扫描电镜结论。
图3为实施例1所合成的修饰后去除模板的磁性介孔微球(a)、修饰后含有CTAB模板的磁性介孔微球(b)的红外谱图。在图中出现了明显的Si-O-Si的振动吸收峰(1090cm-1),表明溶胶-凝胶反应顺利进行。同时,在(b)中出现了很强的甲基、亚甲基的振动吸收峰(2963 cm-1、2921 cm-1、2894 cm-1),说明磁性介孔微球中存在大量CTAB。而在(a)中甲基、亚甲基的振动吸收峰基本消失,说明CTAB在溶剂萃取过程中基本被除去。
图4为实施例1所合成的磁性微球(a)和疏水磁性介孔微球(b)的磁滞回线图,可见化学修饰前后磁球都具有很好的超顺磁性。
应用实施例1
疏水磁性介孔微球用于标准多肽和蛋白质混合液中的多肽富集
取200 μg实施例1制得的疏水磁性介孔微球,加入含有10 ppm缓激肽(L7)、23.5 ppm细胞色素C(Cyt C)和80 ppm辣根过氧化物酶(HRP)的标准多肽与蛋白质的混合水溶液400 μL(标准液),超声分散均匀后置于摇床上孵育0.5小时,用磁铁辅助吸附后去除上清液(收集备用、 HPLC待分析),加入400 μL水溶液,适量震荡后再用磁铁富集磁球,倒掉上清液,重复上述操作一次。加入含有0.2%甲酸的50%乙腈溶液20 μL,超声分散均匀,继续超声0.5小时,在磁铁辅助下收集上清液,重复操作一次,收集到40 μL洗脱液,加160 μL水溶液摇晃均匀,得到最终洗脱液。将标准溶液、上清液、洗脱液分别进HPLC,得到图5所示结果,说明磁性介孔微球兼具尺寸排阻效应和疏水性,可以进行多肽的选择性分离富集。
应用实施例2
疏水磁性介孔微球用于实际样(人血清)中的多肽富集
取500 μg疏水磁性介孔微球,加入含有25 ppm缓激肽(L7)的已稀释50倍的健康人血清400 μL(标准液),超声分散均匀,放于摇床上孵育0.5小时,用磁铁辅助吸附后去除上清液(上清液),加入1mL去离子水,振摇几次后置于磁铁上,富集磁球后去掉上清液,反复5次,洗去微球对血清中蛋白的非特异性吸附。加入含有0.2%甲酸的50%乙腈溶液20 μL,超声分散均匀,继续超声0.5小时,收集上清液后重复操作一次,得到40 μL洗脱液,加入160 μL水溶液摇晃均匀,得到最终洗脱液。将得到的标准液、上清液、洗脱液分别进HPLC,得到图6所示结果,可以看出,疏水磁性介孔微球可以很好的从复杂实际样中分离富集出疏水性肽段。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (10)
1.一种疏水磁性介孔微球的制备方法,其特征在于:以有机表面活性剂为辅助模板,将疏水性硅烷偶联剂掺杂修饰在磁性无机纳米颗粒表面,形成具有疏水基团的有序介孔微球;然后采用溶胶-凝胶法在微球表面包覆一层硅烷偶联剂用以覆盖疏水基团,通过溶剂萃取去除有机表面活性剂,即得到疏水磁性介孔微球。
2.根据权利要求1所述的疏水磁性介孔微球的制备方法,其特征在于:所述的有机表面活性剂为非离子型表面活性剂或离子型表面活性剂;非离子型表面活性剂为含聚醚的小分子CnH2n+1EOm中的一种或几种,n=5-12、 m=10-20;离子型表面活性剂为烷基季铵盐类表面活性剂CnTAB或CnTAC中的一种或几种,n=12-18。
3.根据权利要求1所述的疏水磁性介孔微球的制备方法,其特征在于:所述的疏水性硅烷偶联剂为正辛基三乙氧基硅烷、苯基三乙氧基硅烷、辛基三甲氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、苯胺甲基三乙氧基硅烷、正十八烷基三乙氧基硅烷中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的疏水磁性介孔微球的制备方法,其特征在于:所述的磁性无机纳米颗粒为采用水热法合成的四氧化三铁纳米颗粒。
5.根据权利要求1所述的疏水磁性介孔微球的制备方法,其特征在于:所述的硅烷偶联剂为氨丙基三乙氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷、氯丙基三乙氧基硅烷中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的疏水磁性介孔微球的制备方法,其特征在于:具体包括以下步骤:
(1)将磁性无机纳米颗粒分散在水溶液中,然后加入有机表面活性剂,超声处理,并加入乙醇、硅烷前驱体及疏水性硅烷偶联剂,再加入催化剂超声使其均匀混合;
(2)在温度为30℃-80℃,采用溶胶-凝胶法在磁性无机纳米颗粒表面形成一层掺杂有疏水基团的具有有序介孔结构的二氧化硅/表面活性剂复合纳米微球,再滴加硅烷偶联剂的醇溶液,覆盖微球表面的疏水基团;然后通过溶剂萃取除去有机表面活性剂,即得到疏水磁性介孔微球。
7.根据权利要求6所述的疏水磁性介孔微球的制备方法,其特征在于:步骤(1)所述的硅烷前驱体为四甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷中的一种或两种;所述的催化剂为酸性催化剂或碱性催化剂,碱性催化剂为氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或几种,酸性催化剂为醋酸、盐酸中的一种或两种。
8.根据权利要求6所述的疏水磁性介孔微球的制备方法,其特征在于:步骤(2)所述的硅烷偶联剂的醇溶液为烷基醇和硅烷偶联剂的混合溶液,其中烷基醇为甲醇、乙醇、异丙醇的一种或几种,烷基醇、硅烷偶联剂的体积比为1~9: 1。
9.根据权利要求1所述的制备方法制得的疏水磁性介孔微球。
10.根据权利要求1所述的制备方法制得的疏水磁性介孔微球的应用,其特征在于:用于标准蛋白质、多肽混合液中多肽的选择性分离,以及人血清样品中疏水性肽段的富集。
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