CN106478768A - 一种n-磷酸化肽富集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种N-磷酸化肽富集方法:经过β-消除去除肽段样品中O-磷酸化肽干扰,随后利用磁性介孔二氧化钛复合纳米材料富集样品中N-磷酸化修饰肽段。对于丝氨酸和苏氨酸的O-磷酸化修饰,通过碱性条件下的β-消除方法将其去除,形成稳定的脱氢丙氨酸和β-甲基脱氢丙氨酸。通过溶剂法合成四氧化三铁磁性纳米材料,溶胶凝胶法在其表面包覆二氧化钛,经过水热法扩孔得到磁性介孔二氧化钛纳米复合材料。该磁性介孔二氧化钛纳米复合材料能够在弱酸缓冲体系下的条件下对N-磷酸化肽进行特异性富集。这种β-消除结合特异性富集的方法用于样品中的N-磷酸化肽富集。
Description
技术领域
本发明涉及一种经过β-消除去除肽段丝氨酸和苏氨酸的O-磷酸化修饰后,结合磁性介孔二氧化钛纳米复合材料对N-磷酸化肽进行特异性富集的方法。
背景技术
蛋白质的磷酸化修饰参与了细胞增殖和凋亡、发育和分化、信号传导等几乎所有生命活动(Nat.Biotechnol,2005,23,94-101)。特别是蛋白质的N-磷酸化修饰,其在生命进化、核小体组装、细胞转录、信号转导等核心的生命过程中发挥了举足轻重的作用。因此,研究蛋白质的磷酸化修饰具有重要的生物学意义。其中,丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸羟基上的磷酸化修饰(O-磷酸化修饰),其P-O磷酸酯键在强酸性条件下具有很好的稳定性,因此很容易在强酸条件下通过亲和色谱进行富集(Nat Protoc,2013,8,461-480)。然而,组氨酸、精氨酸和赖氨酸氨基上的磷酸化修饰(N-磷酸化修饰),其P-N酰胺键在pH小于3时会迅速水解,从而导致去磷酸化,因此无法将现有的在强酸条件下富集O-磷酸化肽的方法应用于N-磷酸化肽的富集。因此,发展温和条件下富集N-磷酸化肽的方法具有重要的科学意义。
在生物样品中,O-磷酸化修饰会干扰N-磷酸化修饰的富集和鉴定,因此,去除O-磷酸化修饰的干扰对研究N-磷酸化修饰是至关重要的。研究表明在碱性条件下,N-磷酸化肽具备良好的稳定性(Mol Cell Proteomics,2014,13,537-550),而O-磷酸化肽则会发生β-消除反应而去磷酸化修饰,因此可以利用这一性质,在碱性条件下消除O-磷酸化修饰,随后在温和环境下利用亲和色谱法特异性富集N-磷酸化肽。
发明内容
本发明涉及一种经过β-消除去除样品中O-磷酸化修饰的干扰,结合磁性介孔二氧化钛纳米复合材料的特异性富集,实现对样品中N-磷酸化修饰肽段的选择性富集的新方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
1.β-消除去除肽段样品中O-磷酸化肽干扰:消除反应在碱性条件(pH值大于等于8,且小于等于14的氢氧化钠溶液、氢氧化钡溶液、氢氧化锂溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化镁溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙胺溶液、三乙醇胺溶液、乙醇胺溶液、乙二胺溶液、三乙胺溶液、氨基苯酚溶液、甲胺溶液、丙胺溶液或丁胺溶液中的一种或二种以上)和一定温度(20-100℃)下完成,并加入金属离子(钡、锶、钙、镁或铍中的一种或二种以上)作为反应催化剂、加入有机试剂(甲醇、乙腈或二甲基亚砜中的一种或二种以上)降低副反应。丝氨酸和/或苏氨酸的O-磷酸化修饰经过消除反应产生不饱和双键,得到脱氢丙氨酸和/或β-甲基脱氢丙氨酸,达到去除磷酸化修饰的目的。
2.磁性介孔二氧化钛复合纳米材料富集样品中N-磷酸化修饰肽段:
通过溶剂法合成四氧化三铁磁性纳米材料,溶胶凝胶法在其表面包覆二氧化钛,经过水热法扩孔得到磁性介孔二氧化钛纳米复合材料。
a)制备四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4NPs):通过水热法实现;将1质量份六水合氧化铁、氧化亚铁、二价铁盐或三价铁盐中的一种或二种以上,1-10质量份柠檬酸盐或己二胺中的一种或二种,超声分散于醇溶液中,加入1-10质量份无水乙醇钠,强烈搅拌0.5-10h,倒入反应釜中高温(100-500℃)反应5-24h,待反应釜冷却,将制备得到的四氧化三铁磁性纳米材料清洗后,45℃冷冻干燥待用;
b)包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料(Fe3O4@TiO2):二氧化钛作为磷酸化修饰的有效富集材料被包覆在四氧化三铁磁性纳米材料上;将步骤(a)制备的四氧化三铁磁性纳米材料分散于乙醇与乙腈体积比为10:1-1:10的混合溶液中,加入0.5-10mL钛酸酯盐和0.5-10mL28%氨水,水浴中搅拌反应0.5-24h;待反应釜冷却至室温,将制备得到的包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料用水清洗后,45℃冷冻干燥待用;
c)磁性介孔二氧化钛纳米复合材料(Fe3O4@mTiO2):通过烧结四氧化三铁磁性纳米复合材料表面包覆的二氧化钛层得到大比表面积的介孔材料。将步骤(b)制备的包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料分散于乙醇与水体积比为1:10-10:1的混合溶液中,加入0.5-10mL28%氨水,在反应釜中高温(100-500℃)反应,制备得到磁性介孔二氧化钛纳米复合材料(Fe3O4@mTiO2)。
3.磁性介孔二氧化钛复合纳米材料对N-磷酸化肽的特异性富集:N-磷酸化的富集是基于磁性介孔二氧化钛纳米复合材料中的钛对磷酸化修饰中的氧的配位作用实现的。富集时加入酸性缓冲溶液(pH小于等于7,大于等于3的醋酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、邻苯二甲酸缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液或硼酸缓冲溶液中的一种或二种以上)保证酸度,加入含羟基或羧基的试剂(乳酸、2,5-二羟基苯甲酸、羟基乙酸、没食子酸、丙三醇、谷氨酸铵、1-辛磺酸、β-羟基丙酸或柠檬酸中的一种或二种以上)以减少材料对肽段中非磷酸羟基或羧基的特异性吸附。非特异性吸附的去除是在高乙腈(乙腈浓度10%-90%)和强酸(pH小于等于7,大于等于1)条件下实现的。磷酸化肽段的洗脱是在碱性条件下(pH值大于等于8,小于等于14的氢氧化钠溶液、氢氧化钡溶液、氢氧化锂溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化镁溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙胺溶液、三乙醇胺溶液、乙醇胺溶液、乙二胺溶液、三乙胺溶液、氨基苯酚溶液、甲胺溶液、丙胺溶液或丁胺溶液中的一种或二种以上)实现的。
所述N-磷酸化肽富集方法可应用于蛋白质组学、代谢组学、生命研究中关键化学物质的检测和发现。
这种β-消除结合磁性介孔二氧化钛纳米复合材料富集的方法,首次用于N-磷酸化肽的富集。
本发明具有如下优点:
1)运用β-消除反应去除样品中的O-磷酸化修饰,减少干扰。
2)在弱酸性条件下富集N-磷酸化肽,减少N-磷酸化修饰的水解。
附图说明
图1为β-消除前后以及富集后肽段样品的MALDI-TOF图谱。
图2为四氧化三铁纳米材料的透射电镜图。
图3为包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料的透射电镜图。
图4为磁性介孔二氧化钛纳米复合材料的透射电镜图。
具体实施方式
实施例1
1.O-磷酸化肽的β-消除:将40ug肽段1与2(参见表1)溶解于pH=10的氢氧化钡碱性溶液中,37℃水浴反应1h。图1(a)(b)为β-消除前后肽段的MALDI-TOF图谱,图中星号标出的是N-磷酸化肽段,圆圈标出的是O-磷酸化肽段干扰。
2.磁性介孔二氧化钛纳米复合材料(Fe3O4@mTiO2)的制备:
通过溶剂法合成四氧化三铁纳米材料。将1g六水合氧化铁,1.06g柠檬酸三钠超声分散于20mL乙二醇中,加入1.2g无水乙醇钠,室温强烈搅拌0.5h,倒入反应釜中200℃反应10h,待反应釜冷却至室温,将制备得到的四氧化三铁磁性纳米材料用水清洗后,45℃冷冻干燥待用。图2为四氧化三铁纳米材料的透射电镜图。
二氧化钛作为磷酸化修饰的有效富集材料被包覆在四氧化三铁磁性纳米材料上。将制备的四氧化三铁磁性纳米材料分散于乙醇与乙腈体积比为3:1的混合溶液中,加入1mL钛酸四丁酯和0.5mL28%氨水,在25℃水浴中搅拌反应2h。待反应釜冷却至室温,将制备得到的包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料用水清洗后,45℃冷冻干燥待用。图3为包覆二氧化钛的四氧化三铁纳米复合材料的透射电镜图。
通过氨水扩孔,水热法得到磁性介孔纳米复合材料。将制备的包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料分散于乙醇与水体积比为2:1的混合溶液中,加入1mL28%氨水,在反应釜中160℃反应20h,制备得到磁性介孔二氧化钛纳米复合材料(Fe3O4@mTiO2)。图4为磁性介孔二氧化钛纳米复合材料的透射电镜图。
3.材料表征:图2为四氧化三铁纳米材料的透射电镜图,图3为包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料的透射电镜图,图4为磁性介孔二氧化钛纳米复合材料的透射电镜图。
4.N-磷酸化肽富集:将经过β-消除后的肽段溶解于上样溶液中孵育10min;分别用上样溶液、洗涤溶液1、洗涤溶液2和洗涤溶液3洗涤材料;用洗脱溶液洗脱两次,得到N-磷酸化肽。图1(c)为富集后的肽段样品MALDI-TOF图谱。
上样溶液:12.5wt%乙酸,0.2wt%七氟丁酸,60wt%乙腈,28%氨水调节pH=4;水溶液;
洗涤溶液1:75wt%乙腈,2wt%TFA,2wt%七氟丁酸;水溶液;
洗涤溶液2:75wt%乙腈,10wt%乙酸,0.1wt%七氟丁酸,28%氨水调节pH=4;水溶液;
洗涤溶液3:80wt%乙腈,10wt%乙酸;水溶液;
洗脱溶液:10wt%氨水。
表1:发明中所用肽段氨基酸序列。
实施例2
1.O-磷酸化肽的β-消除:将40ug肽段1与2(参见表1)溶解于pH=12的氢氧化钠碱性溶液中,25℃水浴反应48h。
2.磁性介孔二氧化钛纳米复合材料(Fe3O4@mTiO2)的制备:
通过溶剂法合成四氧化三铁纳米材料。将1g六水合氧化铁,3.6g己二胺超声分散于50mL乙二醇中,加入4g无水乙醇钠,室温强烈搅拌1h,倒入反应釜中200℃反应6h,待反应釜冷却至室温,将制备得到的四氧化三铁磁性纳米材料清洗后,45℃冷冻干燥待用。
二氧化钛作为磷酸化修饰的有效富集材料被包覆在四氧化三铁磁性纳米材料上。将制备的四氧化三铁磁性纳米材料分散于乙醇与乙腈体积比为1:3的混合溶液中,加入2mL钛酸四丁酯和0.5mL28%氨水,在25℃水浴中搅拌反应12h。待反应釜冷却至室温,将制备得到的包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料用水清洗后,45℃冷冻干燥待用。
通过氨水扩孔,水热法得到磁性介孔纳米复合材料。将制备的包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料分散于乙醇与水体积比为1:2的混合溶液中,加入1mL28%氨水,在反应釜中200℃反应15h,制备得到磁性介孔二氧化钛纳米复合材料(Fe3O4@mTiO2)。
3.N-磷酸化肽富集:将经过β-消除后的肽段溶解于上样溶液中孵育1h;分别用上样溶液、洗涤溶液1、洗涤溶液2和洗涤溶液3洗涤材料;用洗脱溶液洗脱两次,得到N-磷酸化肽。
上样溶液:5wt%三氟乙酸,50wt%乙腈,200mg/mL2,5-二羟基苯甲酸,28%氨水调节pH=4;水溶液;
洗涤溶液1:75wt%乙腈,3wt%三氟乙酸,200mg/mL2,5-二羟基苯甲酸;水溶液;
洗涤溶液2:75wt%乙腈,10wt%乙酸,200mg/mL2,5-二羟基苯甲酸,28%氨水调节pH=4;水溶液;
洗涤溶液3:85wt%乙腈,10wt%乙酸;水溶液;
洗脱溶液:10wt%氨水,100mM磷酸铵。
实施例3
1.O-磷酸化肽的β-消除:将40ug肽段1与2(参见表1)溶解于pH大于14的氢氧化锂碱性溶液中,52℃水浴反应0.5h。
2.磁性介孔二氧化钛纳米复合材料(Fe3O4@mTiO2)的制备:
通过溶剂法合成四氧化三铁纳米材料。将1.06g六水合氧化铁,0.2g柠檬酸钠超声分散于20mL乙二醇中,加入1.2g无水乙醇钠,室温强烈搅拌0.5h,倒入反应釜中250℃反应20h,待反应釜冷却至室温,将制备得到的四氧化三铁磁性纳米材料用水清洗后,45℃冷冻干燥待用。
二氧化钛作为磷酸化修饰的有效富集材料被包覆在四氧化三铁磁性纳米材料上。将制备的四氧化三铁磁性纳米材料分散于乙醇与乙腈体积比为1:1的混合溶液中,加入3mL钛酸四丁酯和1mL28%氨水,在25℃水浴中搅拌反应20h。待反应釜冷却至室温,将制备得到的包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料清洗后,45℃冷冻干燥待用。
通过氨水扩孔,水热法得到磁性介孔纳米复合材料。将制备的包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料分散于乙醇与水体积比为1:1的混合溶液中,加入1mL28%氨水,在反应釜中120℃反应30h,制备得到磁性介孔二氧化钛纳米复合材料(Fe3O4@mTiO2)。
3.N-磷酸化肽富集:将经过β-消除后的肽段溶解于上样溶液中孵育3h;分别用上样溶液、洗涤溶液1、洗涤溶液2和洗涤溶液3洗涤材料;用洗脱溶液洗脱两次,得到N-磷酸化肽。
上样溶液:300mg/mL乳酸,12.5wt%乙酸,0.2wt%七氟丁酸,60wt%乙腈,28%氨水调节pH=4;水溶液;
洗涤溶液1:200mg/mL乳酸,75wt%乙腈,2wt%TFA,2wt%七氟丁酸;水溶液;
洗涤溶液2:200mg/mL乳酸,75%乙腈,10%乙酸,0.1%七氟丁酸,氨水调节pH=4;水溶液;
洗涤溶液3:80wt%乙腈,10wt%乙酸;水溶液;
洗脱溶液:1wt%氨水,30mM磷酸铵。
Claims (9)
1.一种N-磷酸化肽富集方法,其特征在于:经过β-消除去除肽段样品中O-磷酸化肽干扰,随后利用磁性介孔二氧化钛复合纳米材料富集样品中N-磷酸化修饰肽段。
2.根据权利要求1所述的N-磷酸化肽富集方法,其特征在于:肽段样品的β-消除反应在pH大于等于8、且小于等于14的碱性溶液条件和20-100℃下完成,并在反应体系中加入金属离子作为反应催化剂、加入有机试剂降低副反应;丝氨酸和/或苏氨酸的O-磷酸化修饰经过消除反应产生不饱和双键,得到脱氢丙氨酸和/或β-甲基脱氢丙氨酸,达到去除磷酸化修饰的目的。
3.根据权利要求2所述的N-磷酸化肽富集方法,其特征在于:碱性条件包括pH值大于等于8,且小于等于14的氢氧化钠溶液、氢氧化钡溶液、氢氧化锂溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化镁溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙胺溶液、三乙醇胺溶液、乙醇胺溶液、乙二胺溶液、三乙胺溶液、氨基苯酚溶液、甲胺溶液、丙胺溶液或丁胺溶液;
所述的金属离子包括:钡、锶、钙、镁或铍中的一种或二种以上,金属离子于反应体系中的终浓度为1mM-1M;
所述的有机试剂包括:甲醇、乙腈或二甲基亚砜中的一种或二种以上,有机试剂于反应体系中的终浓度为1%-80%。
4.根据权利要求2所述的N-磷酸化肽富集方法,其特征在于:β-消除反应是将肽段溶解于pH大于等于8、且小于等于14的碱性溶液中,20-100℃水浴反应0.5~48h。
5.根据权利要求1所述的N-磷酸化肽富集方法,其特征在于:通过溶剂法合成四氧化三铁磁性纳米材料,溶胶凝胶法在其表面包覆二氧化钛,经过水热法扩孔得到磁性介孔二氧化钛纳米复合材料;该磁性介孔二氧化钛纳米复合材料能够在pH小于7、大于等于3的弱酸缓冲体系下对N-磷酸化肽进行特异性富集。
6.根据权利要求1或5所述的N-磷酸化肽富集方法,其特征在于:磁性介孔二氧化钛复合纳米材料的制备过程如下,
a)制备四氧化三铁磁性纳米材料(Fe3O4NPs):通过水热法实现;将1质量份六水合氧化铁、氧化亚铁、二价铁盐或三价铁盐中的一种或二种以上,1-10质量份柠檬酸盐或己二胺中的一种或二种,超声分散于醇溶液中,加入1-10质量份无水乙醇钠,强烈搅拌0.5-10h,倒入反应釜中高温(100-500℃)反应5-24h,待反应釜冷却,将制备得到的四氧化三铁磁性纳米材料清洗后,30-60℃冷冻干燥待用;
b)包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料(Fe3O4@TiO2):二氧化钛作为磷酸化修饰的有效富集材料被包覆在四氧化三铁磁性纳米材料上;将步骤(a)制备的四氧化三铁磁性纳米材料分散于乙醇与乙腈体积比为10:1-1:10的混合溶液中,加入0.5-10mL钛酸酯盐和0.5-10mL质量浓度28-30%氨水,水浴中搅拌反应0.5-24h;待反应釜冷却至室温,将制备得到的包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料用水清洗后,30-60℃冷冻干燥待用;
c)磁性介孔二氧化钛纳米复合材料(Fe3O4@mTiO2):通过烧结四氧化三铁磁性纳米复合材料表面包覆的二氧化钛层得到大比表面积的介孔材料;将步骤(b)制备的包覆二氧化钛的四氧化三铁磁性纳米复合材料分散于乙醇与水体积比为1:10-10:1的混合溶液中,加入0.5-10mL质量浓度28-30%氨水,在反应釜中高温(100-500℃)反应,制备得到磁性介孔二氧化钛纳米复合材料(Fe3O4@mTiO2)。
7.根据权利要求1或5所述的N-磷酸化肽富集方法,其特征在于:磁性介孔二氧化钛复合纳米材料对N-磷酸化肽进行特异性富集的过程,N-磷酸化的富集是基于磁性介孔二氧化钛纳米复合材料中的钛对磷酸化修饰中的氧的配位作用实现的;富集时加入酸性缓冲溶液保证酸度为pH小于7、大于等于3,并加入含1mg/mL-1000mg/mL羟基或羧基的试剂以减少材料对肽段中非磷酸羟基或羧基的特异性吸附;非特异性吸附的去除是在10%-90%乙腈和pH小于7、大于等于1的酸条件下实现的;磷酸化肽段的洗脱是在pH小于等于14、大于7碱性条件下实现的。
8.根据权利要求7所述的N-磷酸化肽富集方法,缓冲溶液包括:pH小于7、大于等于3的醋酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、邻苯二甲酸缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液或硼酸缓冲溶液;
所述的含羟基或羧基的试剂包括:乳酸、2,5-二羟基苯甲酸、羟基乙酸、没食子酸、丙三醇、谷氨酸铵、1-辛磺酸、β-羟基丙酸或柠檬酸。
9.根据权利要求7所述的N-磷酸化肽富集方法,碱性洗脱条件包括:pH值大于等于8、且小于等于14的氢氧化钠溶液、氢氧化钡溶液、氢氧化锂溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化镁溶液、氢氧化钙溶液、氨水溶液、乙胺溶液、三乙醇胺溶液、乙醇胺溶液、乙二胺溶液、三乙胺溶液、氨基苯酚溶液、甲胺溶液、丙胺溶液或丁胺溶液;
所述的去除非特异性吸附的条件包括:乙腈浓度10%-90%,pH小于7、大于等于1的酸性溶液。
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