CN108132180A - 一种磷酸化肽段富集试剂盒及富集方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种磷酸化肽段富集试剂盒及其富集方法，属于蛋白质肽段富集技术领域，其通过二氧化钛填料高度特异性地结合肽段上磷酸化基团的特性对蛋白质酶解产物中的磷酸化肽段进行富集，同时优化实验条件和缓冲试剂，能够快速地实现大规模的磷酸化肽段富集，它具有检测灵敏度较高，特异性较强，数据分析结果准确等优点，该试剂盒可广泛适用于蛋白质及多肽类的磷酸化修饰位点确证。

Description

一种磷酸化肽段富集试剂盒及富集方法
技术领域
本发明属于蛋白质肽段富集技术领域，尤其涉及一种磷酸化肽段富集试剂盒，还涉及一种磷酸化肽段富集方法。
背景技术
蛋白质磷酸化是生物界中最为普遍也是非常重要的一种蛋白质修饰类型，在细胞内，大约有三分之一的蛋白质被认为有磷酸化修饰，蛋白质的磷酸化修饰几乎调节着生命活动的整个过程，包括DNA损伤修复、转录调节、信号转导、细胞凋亡的调节等。磷酸化蛋白质及多肽的研究可帮助我们阐明上述过程的机理，进一步理解生命系统如何在分子水平进行调控，从而认识生命的本质，在对磷酸化蛋白质或者多肽进行研究前必须先对研究对象进行富集，以提高研究的准确性。
当前磷酸化富集的手段有很多种，其中最主要的方法包括使用磷酸化抗体的免疫亲和色谱、离子交换色谱分离磷酸化与非磷酸化肽段、固相金属亲和色谱(immobilizedmetal affinity chromatography,IMAC)和金属氧化物亲和富集技术等。
但磷酸化抗体的免疫亲和色谱由于抗磷酸化抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差；离子交换色谱分离磷酸化与非磷酸化肽段在磷酸化肽所带电荷较多时会造成部分磷酸化肽的丢失；固相金属亲和色谱可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽，同时，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集，影响富集质量。
发明内容
基于现有技术存在上述问题，本发明提供一种磷酸化肽段富集试剂盒及其富集方法，其通过二氧化钛填料高度特异性地结合肽段上磷酸化基团的特性对蛋白质酶解产物中的磷酸化肽段进行富集，同时优化实验条件和缓冲试剂，能够快速地实现大规模的磷酸化肽段富集，它具有检测灵敏度较高，特异性较强，数据分析结果准确等优点，该试剂盒可广泛适用于蛋白质及多肽类的磷酸化修饰位点确证。
本发明通过以下详细技术方案达到目的：
一种磷酸化肽段富集试剂盒，其包括分离柱Tip Column、洗脱液Wash Buffer A、洗脱液Wash Buffer B、洗脱液Elution Buffer C，所述的分离柱Tip Column是使用C18填料为堵头的自填柱；所述的脱液Wash Buffer A包括75-85％乙腈、4-6％三氟乙酸和12-18％水，所述的洗脱液Wash Buffer B包括75-85％乙腈、0.05-0.15％三氟乙酸和18-21％水；所述的洗脱液Elution Buffer C包括75-85％乙腈、2-4％氨水和15-19％水。
其中，所述的脱液Wash Buffer A包括80％乙腈、5％三氟乙酸和15％水，所述的洗脱液Wash Buffer B包括80％乙腈、0.1％三氟乙酸和19.9％水；所述的洗脱液ElutionBuffer C包括80％乙腈、3％氨水和17％水。
一种使用上述试剂盒的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤S10，取Wash Buffer A加入到含0.2-0.4g的2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有200-400μg的二氧化钛填料的试管中加入Elution Buffer C，ElutionBuffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，再加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸没二氧化钛填料，混合均匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，重复多次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取酶解冻干后的肽段样品，加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的WashbufferA进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀1.5-3h，使用离心力为4000-6000g进行离心2-4min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Washbuffer A，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入Wash Buffer B，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤，干燥沉淀物；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入Elution Buffer C，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用离心力2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入Elution Buffer C，使用2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液，多次重复后合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
优选地，使用上述试剂盒的磷酸化肽段富集方法包括以下详细步骤：
步骤S10，取2mL Wash Buffer A加入到含2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有二氧化钛填料的试管中加入0.5mL Elution Buffer C，ElutionBuffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，再加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸没二氧化钛填料，混合均匀，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，重复多次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取0.1-1mg酶解冻干后的肽段样品，加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀2h，使用离心力为5000g进行离心3min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，多次重复本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入0.5mL Wash Buffer B，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，多次重复本步骤，干燥沉淀物；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入0.1mL Elution Buffer C，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用3000g离心2min，收集滤液；；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入0.05mL Elution Buffer C，使用3000g离心2min，收集滤液，多次重复后合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
其中，所述的步骤S20中加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心的重复次数是2-4次。
其中，所述的步骤S40和步骤S50的重复次数是2-4次。
其中，所述的步骤S70的重复次数是1-3次。
其中，所述的步骤S50中对沉淀物的干燥方法是使用风干5min或者使用冻干2min。
本发明具有的有益效果：通过二氧化钛特异性地结合肽段上的磷酸化基团，可高效地富集磷酸化肽段；通过加入DHB高效地去除非磷酸化肽段与二氧化钛的非特异性吸附，使得磷酸化肽段的富集效率可达90％以上，便于生物质谱的检测；实验周期短，一般3个小时即可完成磷酸化肽段富集且实验过程安全，试剂盒所含试剂均为蛋白质和一般无机盐水溶液，无可挥发性、有毒、有害物质。操作人员只需佩戴常规实验服、手套等实验护具。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述。
实施例一：磷酸化肽段富集试剂盒。
一种磷酸化肽段富集试剂盒，其包括分离柱Tip Column、洗脱液Wash Buffer A、洗脱液Wash Buffer B、洗脱液Elution Buffer C，所述的分离柱Tip Column是使用C18填料为堵头的自填柱。
其中，所述的脱液Wash Buffer A包括80％乙腈、5％三氟乙酸和15％水，所述的洗脱液Wash Buffer B包括80％乙腈、0.1％三氟乙酸和19.9％水；所述的洗脱液ElutionBuffer C包括80％乙腈、3％氨水和17％水。
实施例二：使用上述试剂盒富集Hela癌细胞磷酸化肽段
一种使用上述试剂盒的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤S10，取2mL Wash Buffer A加入到含0.3g的2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀30s，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有300μg的二氧化钛填料的试管中加入0.5mL Elution Buffer C，Elution Buffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，颠倒10次，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，再加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash bufferA浸没二氧化钛填料，混合均匀，颠倒10次，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，重复3次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取0.5mg酶解冻干后的Hela癌细胞肽段样品，加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀2h，使用离心力为5000g进行离心3min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Washbuffer A，震荡溶解混匀10s，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，重复3次本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入0.5mL Wash Buffer B，震荡溶解混匀10s，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，重复3次本步骤，将沉淀物使用冷冻干燥2min；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入0.1mL Elution Buffer C，震荡溶解混匀5min，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用3000g离心2min，收集滤液；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入0.05mL Elution Buffer C，使用3000g离心2min，收集滤液，重复2次本步骤，收集合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
将本实施例得到的富集产物和正常酶解冻干后的Hela癌细胞肽段样品进质谱鉴定，鉴定结果如下：
质谱鉴定结果 富集 不富集
蛋白鉴定数目 3027 3402
磷酸化蛋白鉴定数目 2927 50
肽段鉴定数目 7718 18471
磷酸化肽段鉴定数目 7446 60
磷酸化位点鉴定数目 9724 71
磷酸化肽段富集效率 0.965 0.003
从上述结果中可以看出，本发明提供的富集方法具有超过95％的富集效率，极大地方便和满足目前蛋白质研究的需要。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种磷酸化肽段富集试剂盒，其特征在于，其包括分离柱Tip Column、洗脱液WashBuffer A、洗脱液Wash Buffer B、洗脱液Elution Buffer C，所述的分离柱Tip Column是使用C18填料为堵头的自填柱；所述的脱液Wash Buffer A包括75-85％乙腈、4-6％三氟乙酸和12-18％水，所述的洗脱液Wash Buffer B包括75-85％乙腈、0.05-0.15％三氟乙酸和18-21％水；所述的洗脱液Elution Buffer C包括75-85％乙腈、2-4％氨水和15-19％水。
2.根据权利要求1所述的一种磷酸化肽段富集试剂盒，其特征在于，所述的脱液WashBuffer A包括80％乙腈、5％三氟乙酸和15％水，所述的洗脱液Wash Buffer B包括80％乙腈、0.1％三氟乙酸和19.9％水；所述的洗脱液Elution Buffer C包括80％乙腈、3％氨水和17％水。
3.一种使用如权利要求1-2任一所述的试剂盒的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤S10，取Wash Buffer A加入到含0.2-0.4g的2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有200-400μg的二氧化钛填料的试管中加入Elution Buffer C，ElutionBuffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，再加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸没二氧化钛填料，混合均匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，重复多次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取酶解冻干后的肽段样品，加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Washbuffer A进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀1.5-3h，使用离心力为4000-6000g进行离心2-4min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Washbuffer A，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入Wash Buffer B，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤，干燥沉淀物；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入Elution Buffer C，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用离心力2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入Elution Buffer C，使用2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液，多次重复后合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
4.根据权利要求3所述的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，其包括以下详细步骤：
步骤S10，取2mL Wash Buffer A加入到含2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有二氧化钛填料的试管中加入0.5mL Elution Buffer C，ElutionBuffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，再加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸没二氧化钛填料，混合均匀，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，重复多次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取0.1-1mg酶解冻干后的肽段样品，加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀2h，使用离心力为5000g进行离心3min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，多次重复本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入0.5mL Wash Buffer B，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，多次重复本步骤，干燥沉淀物；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入0.1mL Elution Buffer C，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用3000g离心2min，收集滤液；；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入0.05mL Elution Buffer C，使用3000g离心2min，收集滤液，多次重复后合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
5.根据权利要求3或4所述的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，所述的步骤S20中加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心的重复次数是2-4次。
6.根据权利要求3或4所述的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，所述的步骤S40和步骤S50的重复次数是2-4次。
7.根据权利要求3或4所述的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，所述的步骤S70的重复次数是1-3次。
8.根据权利要求3或4所述的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，所述的步骤S50中对沉淀物的干燥方法是使用风干5min或者使用冻干2min。
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