CN108132180B - 一种磷酸化肽段富集试剂盒及富集方法 - Google Patents

一种磷酸化肽段富集试剂盒及富集方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108132180B
CN108132180B CN201711395960.2A CN201711395960A CN108132180B CN 108132180 B CN108132180 B CN 108132180B CN 201711395960 A CN201711395960 A CN 201711395960A CN 108132180 B CN108132180 B CN 108132180B
Authority
CN
China
Prior art keywords
wash buffer
centrifuging
precipitate
shaking
uniformly mixing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711395960.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108132180A (zh
Inventor
阮宏强
陈薇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Applied Protein Technology Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Applied Protein Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Applied Protein Technology Co Ltd filed Critical Shanghai Applied Protein Technology Co Ltd
Priority to CN201711395960.2A priority Critical patent/CN108132180B/zh
Publication of CN108132180A publication Critical patent/CN108132180A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108132180B publication Critical patent/CN108132180B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples
    • G01N1/4055—Concentrating samples by solubility techniques
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N30/08—Preparation using an enricher
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种磷酸化肽段富集试剂盒及其富集方法，属于蛋白质肽段富集技术领域，其通过二氧化钛填料高度特异性地结合肽段上磷酸化基团的特性对蛋白质酶解产物中的磷酸化肽段进行富集，同时优化实验条件和缓冲试剂，能够快速地实现大规模的磷酸化肽段富集，它具有检测灵敏度较高，特异性较强，数据分析结果准确等优点，该试剂盒可广泛适用于蛋白质及多肽类的磷酸化修饰位点确证。

Description

一种磷酸化肽段富集试剂盒及富集方法
技术领域
本发明属于蛋白质肽段富集技术领域，尤其涉及一种磷酸化肽段富集试剂盒，还涉及一种磷酸化肽段富集方法。
背景技术
蛋白质磷酸化是生物界中最为普遍也是非常重要的一种蛋白质修饰类型，在细胞内，大约有三分之一的蛋白质被认为有磷酸化修饰，蛋白质的磷酸化修饰几乎调节着生命活动的整个过程，包括DNA损伤修复、转录调节、信号转导、细胞凋亡的调节等。磷酸化蛋白质及多肽的研究可帮助我们阐明上述过程的机理，进一步理解生命系统如何在分子水平进行调控，从而认识生命的本质，在对磷酸化蛋白质或者多肽进行研究前必须先对研究对象进行富集，以提高研究的准确性。
当前磷酸化富集的手段有很多种，其中最主要的方法包括使用磷酸化抗体的免疫亲和色谱、离子交换色谱分离磷酸化与非磷酸化肽段、固相金属亲和色谱（immobilizedmetal affinity chromatography, IMAC）和金属氧化物亲和富集技术等。
但磷酸化抗体的免疫亲和色谱由于抗磷酸化抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差；离子交换色谱分离磷酸化与非磷酸化肽段在磷酸化肽所带电荷较多时会造成部分磷酸化肽的丢失；固相金属亲和色谱可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽，同时，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集，影响富集质量。
发明内容
基于现有技术存在上述问题，本发明提供一种磷酸化肽段富集试剂盒及其富集方法，其通过二氧化钛填料高度特异性地结合肽段上磷酸化基团的特性对蛋白质酶解产物中的磷酸化肽段进行富集，同时优化实验条件和缓冲试剂，能够快速地实现大规模的磷酸化肽段富集，它具有检测灵敏度较高，特异性较强，数据分析结果准确等优点，该试剂盒可广泛适用于蛋白质及多肽类的磷酸化修饰位点确证。
本发明通过以下详细技术方案达到目的：
一种磷酸化肽段富集试剂盒，其包括分离柱Tip Column、洗脱液Wash Buffer A、洗脱液Wash Buffer B、洗脱液Elution Buffer C，所述的分离柱Tip Column是使用C18填料为堵头的自填柱；所述的洗脱液Wash Buffer A包括75-85%乙腈、4-6%三氟乙酸和12-18%水，所述的洗脱液Wash Buffer B包括75-85%乙腈、0.05-0.15%三氟乙酸和18-21%水；所述的洗脱液Elution Buffer C包括75-85%乙腈、2-4%氨水和15-19%水；所述的试剂盒的使用方法包括如下步骤：
步骤S10，取Wash Buffer A加入到含0.2-0.4g 的2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有200-400μg的二氧化钛填料的试管中加入Elution Buffer C，Elution Buffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，再加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸没二氧化钛填料，混合均匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，重复多次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取0.1-1mg酶解冻干后的肽段样品，加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀1.5-3h，使用离心力为4000-6000g进行离心2-4min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入Wash Buffer B，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤，干燥沉淀物；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入Elution Buffer C，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用离心力2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入Elution Buffer C，使用2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液，多次重复后合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
其中，所述的洗脱液Wash Buffer A包括80%乙腈、5%三氟乙酸和15%水，所述的洗脱液Wash Buffer B包括80%乙腈、0.1%三氟乙酸和19.9%水；所述的洗脱液Elution BufferC包括80%乙腈、3%氨水和17%水。
一种使用上述试剂盒的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤S10，取Wash Buffer A加入到含0.2-0.4g的2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有200-400μg的二氧化钛填料的试管中加入Elution Buffer C，Elution Buffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，再加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸没二氧化钛填料，混合均匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，重复多次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取0.1-1mg酶解冻干后的肽段样品，加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀1.5-3h，使用离心力为4000-6000g进行离心2-4min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入Wash Buffer B，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤，干燥沉淀物；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入Elution Buffer C，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用离心力2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入Elution Buffer C，使用2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液，多次重复后合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
优选地，使用上述试剂盒的磷酸化肽段富集方法包括以下详细步骤：
步骤S10，取2mL Wash Buffer A加入到含2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有二氧化钛填料的试管中加入0.5mL Elution Buffer C，ElutionBuffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，再加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸没二氧化钛填料，混合均匀，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，重复多次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取0.1-1mg酶解冻干后的肽段样品，加入0.5mL 步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀2h，使用离心力为5000g进行离心3min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入0.5mL 步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，多次重复本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入0.5mL Wash Buffer B，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，多次重复本步骤，干燥沉淀物；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入0.1mL Elution Buffer C，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用3000g离心2min，收集滤液；；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入0.05mL Elution Buffer C，使用3000g离心2min，收集滤液，多次重复后合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
其中，所述的步骤S20中加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心的重复次数是2-4次。
其中，所述的步骤S40和步骤S50的重复次数是2-4次。
其中，所述的步骤S70的重复次数是1-3次。
其中，所述的步骤S50中对沉淀物的干燥方法是使用风干5min或者使用冻干2min。
本发明具有的有益效果：通过二氧化钛特异性地结合肽段上的磷酸化基团，可高效地富集磷酸化肽段；通过加入DHB高效地去除非磷酸化肽段与二氧化钛的非特异性吸附，使得磷酸化肽段的富集效率可达90%以上，便于生物质谱的检测；实验周期短，一般3个小时即可完成磷酸化肽段富集且实验过程安全，试剂盒所含试剂均为蛋白质和一般无机盐水溶液，无可挥发性、有毒、有害物质。操作人员只需佩戴常规实验服、手套等实验护具。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述。
实施例一：磷酸化肽段富集试剂盒。
一种磷酸化肽段富集试剂盒，其包括分离柱Tip Column、洗脱液Wash Buffer A、洗脱液Wash Buffer B、洗脱液Elution Buffer C，所述的分离柱Tip Column是使用C18填料为堵头的自填柱。
其中，所述的洗脱液Wash Buffer A包括80%乙腈、5%三氟乙酸和15%水，所述的洗脱液Wash Buffer B包括80%乙腈、0.1%三氟乙酸和19.9%水；所述的洗脱液Elution BufferC包括80%乙腈、3%氨水和17%水。
实施例二：使用上述试剂盒富集Hela癌细胞磷酸化肽段
一种使用上述试剂盒的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤S10，取2mL Wash Buffer A加入到含0.3g的2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀30s，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有300μg的二氧化钛填料的试管中加入0.5mL Elution Buffer C，Elution Buffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，颠倒10次，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，再加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash bufferA浸没二氧化钛填料，混合均匀，颠倒10次，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，重复3次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取0.5mg酶解冻干后的Hela癌细胞肽段样品，加入0.5mL 步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀2h，使用离心力为5000g进行离心3min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入0.5mL 步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，震荡溶解混匀10s，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，重复3次本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入0.5mL Wash Buffer B，震荡溶解混匀10s，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，重复3次本步骤，将沉淀物使用冷冻干燥2min；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入0.1mL Elution Buffer C，震荡溶解混匀5min，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用3000g离心2min，收集滤液；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入0.05mL Elution Buffer C，使用3000g离心2min，收集滤液，重复2次本步骤，收集合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
将本实施例得到的富集产物和正常酶解冻干后的Hela癌细胞肽段样品进质谱鉴定，鉴定结果如下：
质谱鉴定结果 富集 不富集
蛋白鉴定数目 3027 3402
磷酸化蛋白鉴定数目 2927 50
肽段鉴定数目 7718 18471
磷酸化肽段鉴定数目 7446 60
磷酸化位点鉴定数目 9724 71
磷酸化肽段富集效率 0.965 0.003
从上述结果中可以看出，本发明提供的富集方法具有超过95%的富集效率，极大地方便和满足目前蛋白质研究的需要。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种磷酸化肽段富集试剂盒，其特征在于，其包括分离柱Tip Column、洗脱液WashBuffer A、洗脱液Wash Buffer B、洗脱液Elution Buffer C，所述的分离柱Tip Column是使用C18填料为堵头的自填柱；所述的洗脱液Wash Buffer A包括75-85%乙腈、4-6%三氟乙酸和12-18%水，所述的洗脱液Wash Buffer B包括75-85%乙腈、0.05-0.15%三氟乙酸和18-21%水；所述的洗脱液Elution Buffer C包括75-85%乙腈、2-4%氨水和15-19%水；所述的试剂盒的使用方法包括如下步骤：
步骤S10，取Wash Buffer A加入到含0.2-0.4g 的2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有200-400μg的二氧化钛填料的试管中加入Elution Buffer C，ElutionBuffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，再加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸没二氧化钛填料，混合均匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，重复多次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取0.1-1mg酶解冻干后的肽段样品，加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀1.5-3h，使用离心力为4000-6000g进行离心2-4min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Washbuffer A，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入Wash Buffer B，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤，干燥沉淀物；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入Elution Buffer C，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用离心力2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入Elution Buffer C，使用2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液，多次重复后合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
2.根据权利要求1所述的一种磷酸化肽段富集试剂盒，其特征在于，所述的洗脱液WashBuffer A包括80%乙腈、5%三氟乙酸和15%水，所述的洗脱液Wash Buffer B包括80%乙腈、0.1%三氟乙酸和19.9%水；所述的洗脱液Elution Buffer C包括80%乙腈、3%氨水和17%水。
3.一种使用如权利要求1-2任一所述的试剂盒的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，其包括以下步骤：
步骤S10，取Wash Buffer A加入到含0.2-0.4g 的2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有200-400μg的二氧化钛填料的试管中加入Elution Buffer C，ElutionBuffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，再加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸没二氧化钛填料，混合均匀，使用离心力4000-6000g离心45-75s，弃上清液，重复多次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取0.1-1mg酶解冻干后的肽段样品，加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀1.5-3h，使用离心力为4000-6000g进行离心2-4min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Washbuffer A，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入Wash Buffer B，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力4000-6000g离心45-75s，取沉淀物，多次重复本步骤，干燥沉淀物；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入Elution Buffer C，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用离心力2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入Elution Buffer C，使用2500-3500g离心1.5-2.5min，收集滤液，多次重复后合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
4.根据权利要求3所述的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，其包括以下详细步骤：
步骤S10，取2mL Wash Buffer A加入到含2,5-二羟基苯甲酸的试管中，震荡混匀，充分溶解2,5-二羟基苯甲酸，得到含有2,5-二羟基苯甲酸的Wash Buffer A，备用；
步骤S20往含有二氧化钛填料的试管中加入0.5mL Elution Buffer C，ElutionBuffer C浸没二氧化钛填料，震荡混匀，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，再加入0.5mL步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，Wash buffer A浸没二氧化钛填料，混合均匀，使用离心力5000g离心1min，弃上清液，重复多次加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心；
步骤S30，取0.1-1mg酶解冻干后的肽段样品，加入0.5mL 步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A进行复溶，肽段样品全部溶解后加入经过步骤S20处理的二氧化钛，震荡混匀2h，使用离心力为5000g进行离心3min，取沉淀物，备用；
步骤S40，向步骤S30取得的沉淀物中加入0.5mL 步骤S10制成的含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash buffer A混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，多次重复本步骤；
步骤S50，向步骤S40取得的沉淀物中加入0.5mL Wash Buffer B，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Wash Buffer B混匀后，使用离心力5000g离心1min，取沉淀物，多次重复本步骤，干燥沉淀物；
步骤S60，向步骤S50取得的沉淀物中加入0.1mL Elution Buffer C，震荡溶解混匀，沉淀物完全溶解和Elution Buffer C混匀后，将混合物转移至分离柱Tip Column中，使用3000g离心2min，收集滤液；
步骤S70再向分离柱Tip Column中加入0.05mL Elution Buffer C，使用3000g离心2min，收集滤液，多次重复后合并所有滤液，对滤液进行浓缩干燥。
5.根据权利要求3或4所述的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，所述的步骤S20中加入含2,5-二羟基苯甲酸的Wash buffer A混匀和离心的重复次数是2-4次。
6.根据权利要求3或4所述的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，所述的步骤S40和步骤S50的重复次数是2-4次。
7.根据权利要求3或4所述的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，所述的步骤S70的重复次数是1-3次。
8.根据权利要求3或4所述的磷酸化肽段富集方法，其特征在于，所述的步骤S50中对沉淀物的干燥方法是使用风干5min或者使用冻干2min。
CN201711395960.2A 2017-12-21 2017-12-21 一种磷酸化肽段富集试剂盒及富集方法 Active CN108132180B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711395960.2A CN108132180B (zh) 2017-12-21 2017-12-21 一种磷酸化肽段富集试剂盒及富集方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711395960.2A CN108132180B (zh) 2017-12-21 2017-12-21 一种磷酸化肽段富集试剂盒及富集方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108132180A CN108132180A (zh) 2018-06-08
CN108132180B true CN108132180B (zh) 2020-11-06

Family

ID=62392141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711395960.2A Active CN108132180B (zh) 2017-12-21 2017-12-21 一种磷酸化肽段富集试剂盒及富集方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108132180B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7087900B2 (ja) * 2018-10-03 2022-06-21 株式会社島津製作所 分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キット
CN110128499A (zh) * 2019-04-28 2019-08-16 北京谷海天目生物医学科技有限公司 磷酸化肽段富集的方法、检测和定量的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008148645A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-11 Syddansk Universitet Separation of mono- from multi-phoshorylated peptides
CN103163010A (zh) * 2011-12-14 2013-06-19 天津市国际生物医药联合研究院 相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法
CN103940894A (zh) * 2013-01-23 2014-07-23 复旦大学 一种同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段并质谱分析的方法
CN104119422A (zh) * 2014-07-09 2014-10-29 深圳华大基因研究院 一种磷酸化肽的吸附富集方法、添加剂及其应用
CN106478768A (zh) * 2015-09-01 2017-03-08 中国科学院大连化学物理研究所 一种n-磷酸化肽富集方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008148645A1 (en) * 2007-06-07 2008-12-11 Syddansk Universitet Separation of mono- from multi-phoshorylated peptides
CN103163010A (zh) * 2011-12-14 2013-06-19 天津市国际生物医药联合研究院 相对定量分析蛋白质磷酸化修饰水平的方法
CN103940894A (zh) * 2013-01-23 2014-07-23 复旦大学 一种同时富集磷酸化肽段和糖基化肽段并质谱分析的方法
CN104119422A (zh) * 2014-07-09 2014-10-29 深圳华大基因研究院 一种磷酸化肽的吸附富集方法、添加剂及其应用
CN106478768A (zh) * 2015-09-01 2017-03-08 中国科学院大连化学物理研究所 一种n-磷酸化肽富集方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns;Martin R. Larsen et al.;《MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS》;20050731;第4卷(第7期);第873-886页 *
Optimizing TiO2-based phosphopeptide enrichment for automated multidimensional liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry;Greg T. Cantin et al.;《Anal. Chem.》;20070615;第79卷(第12期);第4666-4673页 *
二氧化钛富集磷酸肽方法的优化及在小鼠肝脏磷酸化蛋白组学研究中的应用;林威;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20130115(第01期);第5-6页"2.3 实验方法" *
天然产物Genistein抑制人胃癌细胞的磷酸化蛋白组学研究;贾红玲等;《药物生物技术》;20101231;第17卷(第4期);第298页"1.2.5 富集磷酸化肽段" *
硅锆复合氧化物的制备、表征及其在磷酸化肽段富集中的应用;吴剑虹等;《分析化学 研究报告》;20100930;第38卷(第9期);第1232-1233页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108132180A (zh) 2018-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schoemaker et al. Photo-induced joining of a transfer RNA with its cognate aminoacyl-transfer RNA synthetase
CN112213401B (zh) 一种阿胶及其制品的驴源性特征肽及其阿胶及其制品的鉴别方法
CN105044222B (zh) 生物活性多肽的分析测试和鉴定方法
Edelmann Strong cation exchange chromatography in analysis of posttranslational modifications: innovations and perspectives
CN108132180B (zh) 一种磷酸化肽段富集试剂盒及富集方法
CN111239302B (zh) 一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法和应用
CN116284247B (zh) 一种鉴别鹿角胶混淆品的特征多肽及其组合方法、应用
CN106093244A (zh) 一种羊特征性多肽及其应用
CN106053697B (zh) 一种牛源性特征性多肽及其应用
CN107478839B (zh) 赖氨酸氮连接磷酸化翻译后修饰富集和鉴定的方法
CN108548876B (zh) 一种改进的生物样本中磷酸化肽段的鉴定及定量方法
CN103267822B (zh) 一种牛乳铁蛋白定量检测试剂盒及其应用
CN110426522B (zh) 一种圆斑蝰蛇蛇毒的鉴定方法及其应用
CN102199189A (zh) 一种酪氨酸磷酸化肽的纯化方法
CN112063603B (zh) 一种与中枢神经衰老相关的乙酰化修饰cnp蛋白标记分子及其应用
US20170261513A1 (en) Monoclonal antibody based online phosphoprotein proteomics analysis method using microbore hollow fiber enzymatic reactor-tandem mass spectrometry
CN103512997A (zh) 一种两维短梯度高效蛋白质组分离鉴定方法
JP2010148442A (ja) 硫酸化糖鎖を有する糖ペプチドを濃縮する方法及びそのためのキット
US20190346460A1 (en) Mass spectrometric standards for hemoglobin beta and hemoglobin beta sickle and uses thereof
CN111024867A (zh) 一类基于稳定同位素的高通量蛋白质组学定量试剂
Wang et al. Profiling of ubiquitination modification sites in talin in colorectal carcinoma by mass spectrometry
Fang-Jie et al. High concentration trypsin assisted fast in-gel digestion for phosphoproteome analysis
Hu et al. An efficient strategy with a synergistic effect of hydrophilic and electrostatic interactions for simultaneous enrichment of N-and O-glycopeptides
CN108828126A (zh) 基于二维液相色谱串联质谱定性鉴定草莓柱头蛋白的方法
CN116239666B (zh) 一种螯合钙肽混合物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant