CN111239302B - 一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法和应用 - Google Patents

一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法和应用 Download PDF

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CN111239302B CN202010142246.8A CN202010142246A CN111239302B CN 111239302 B CN111239302 B CN 111239302B CN 202010142246 A CN202010142246 A CN 202010142246A CN 111239302 B CN111239302 B CN 111239302B
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Abstract

本发明涉及一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法和应用。该方法通过在样品预处理过程中使用与胰蛋白酶不同的多种限制性内切酶处理胶原蛋白的方式，从胶原蛋白中获得专属性肽段，用来鉴别不同物种来源的皮类、胶类中药及其产品的真伪，并判断未知胶类样品的种属来源。并且本发明从高保守的胶原蛋白中获得专属性肽段的方法有利于中药皮类、胶类动物药的质量控制，可大大提高皮类、胶类动物药产品及行业的检测效率和准确度，特别是阿胶类中药及其中成药的鉴别，具有重要的科学意义与应用价值。

Description

一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法 和应用
技术领域
本发明属于医药与食品检测技术领域，具体涉及皮类、胶类中药专属性肽段的寻找与发现，可应用于皮类、胶类中药真伪鉴别，如阿胶及其制品真伪鉴别及判断其掺假物种。
背景技术
胶原蛋白(Collagen)是动物体内一类重要的蛋白质，约占动物总蛋白的30％，主要分布在皮肤、结缔组织、骨骼等部位，支撑着皮肤与各个组织器官形态、结构的完整性，有保护机体和支撑器官的重要作用。动物皮肤真皮层中富含大量的胶原蛋白。传统中药胶类药材如阿胶、黄明胶、鹿角胶等，是将动物的皮、角、骨或壳在高温高压条件下长时间熬制，使得胶原蛋白发生不同程度的水解并溶解，经过浓缩干燥后得到的药材，阿胶补血滋阴，润燥，止血；鹿角胶温补肝肾，益精养血；龟甲胶滋阴，养血，止血。胶类动物药多具滋阴补血的功效。
胶类动物药中以阿胶(Asini Corii Colla)尤为名贵，阿胶具补血滋阴，润燥，止血之功。用于血虚萎黄，眩晕心悸，肌痿无力，心烦不眠，虚风内动，肺燥咳嗽，劳嗽咯血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏。《本草纲目》载：“阿胶《本经》上品。弘景曰：‘出东阿，故名阿胶’”。道地阿胶表面平整，无油气孔，质硬而脆，断面光亮细腻，碎片对光照视呈棕色半透明状，李时珍赞其“黄透如琥珀色，光黑如瑿漆”。
然而，在现有市场上存在假阿胶、伪劣阿胶，并以次充好向市场销售，严重影响了广大人民群众的饮食和用药安全。目前不法企业常以马皮、牛皮、猪皮等掺杂制备阿胶来以次充好，导致阿胶造假事件屡禁不止的原因之一是缺少简单、可行、准确的鉴定技术支持，动物皮经过熬制后，很难鉴别出动物皮的来源。因此，寻找胶类动物药的专属性肽段以鉴别真伪非常必要。本发明利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法可发现专属性肽段，这对于胶类动物药真伪鉴别，解决中药行业问题具有重大意义。
发明内容
本发明目的在于基于多种蛋白质内切酶切割胶原蛋白的方法获得专属性肽段，通过该方法能有效的寻找发现不同种属样品的专属性肽段，以利于中药胶类动物药及其制品的真伪鉴别及掺假物种的判别。从而为中药胶类动物药质量标准的提升奠定基础，为保证中药胶类动物药及其制品的质量提供科学方法。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
一种利用除胰蛋白酶外的多种蛋白质内切酶切割胶原蛋白，以获得具有专属性特征的肽段的方法。
从蛋白质数据库中搜索下载驴、马、骡、牛、鹿、羊、猪、狗、猫、兔等的胶原蛋白全序列。通过同源蛋白的氨基酸序列比对，确定同源蛋白之间的差异氨基酸位点，进一步通过选择合适的一种或多种蛋白质限制性内切酶，以切割蛋白质获得专属性肽段。
本发明通过一种或多种蛋白质限制性内切酶对同源蛋白进行切割，所用的限制性内切酶包括：LysC、GluC、ArgC、LysN、AspN等。
本发明酶解反应条件为：胶原蛋白与每一种蛋白酶的摩尔比可从10000：1到1：1；酶解反应温度为10℃到45℃；酶解溶液的pH范围4.0到9.0；酶解反应时间为0.1小时到48小时。
本发明酶解反应的加酶方式：采用一次加入一种或多种限制性内切酶的方式酶解；或采用分两次加入一种限制性内切酶的方式酶解；或采用先后加入多种限制性内切酶的方式酶解。本发明酶解后样品的分析：采用基于shotgun混合蛋白鉴定技术的纳升液相-串联质谱(nano LC-MS/MS)方法，通过蛋白质搜库鉴定确定特征性肽段的氨基酸序列；或通过液相色谱-三重四极杆质谱(LC-QQQ-MS)方法的多反应监测(MRM)模式，通过离子对确认专属性肽段信息。特征性肽段信息中包括一些翻译后修饰：包含脯氨酸(Pro)的羟基化(Hydroxylation)修饰、天门冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)的脱酰胺(Deamidation)修饰。
本发明提供的方法可应用于包括阿胶、鹿皮胶、牛皮胶等胶类动物药及其相关产品的真伪鉴别，也可应用于阿胶等真品中掺假样品物种来源的判别。
(1)通过采用LysC切割胶原蛋白可获得不同物种的专属性肽段，肽段信息如下：
驴特征肽：
His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Val-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-
Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Arg-Gly-Asp-Lys
马特征肽：
His-Gly-His-Arg-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Val-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-
Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-Val-Arg-Gly-Asp-Lys
牛或鹿特征肽：
His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Val-
Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Arg-Gly-Asp-Lys
猪特征肽：
His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Val-
Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Arg-Gly-Glu-Lys
羊特征肽：
His-Gly-Ser-Arg-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Val-
Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Arg-Gly-Asp-Lys
狗特征肽：
His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-
Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Arg-Gly-Asp-Lys
猫特征肽：
His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Val-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-
Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Thr-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Arg-Gly-Asp-Lys
兔特征肽：
His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Ser-Ile-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-
Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-Ile-Arg-Gly-Asp-Lys
火鸡特征肽：
Pro-Gly-Asn-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Phe-
Gly-Pro-Arg-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-Lys
鸡特征肽：
Pro-Gly-Asn-Arg-Gly-Asp-Pro-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Phe-
Gly-Pro-Arg-Gly-Leu-Ala-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-Lys
(2)本发明通过采用GluC切割胶原蛋白可获得不同物种的专属性肽段，肽段信息如下：
驴特征肽：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-His-
Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu
马特征肽：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-His-
Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-His-Arg-Gly-Glu
牛特征肽：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-
Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu
鹿特征肽：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Thr-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-
Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu
猪特征肽：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-
Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu
羊特征肽：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-
Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Ser-Arg-Gly-Glu
狗或猫特征肽：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-His-
Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu
兔特征肽：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-
Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu
(3)本发明通过采用GluC切割胶原蛋白可获得另外不同物种的专属性肽段，肽段信息如下：
驴特征肽：
Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu；
马特征肽：
Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Ser-Gly-Glu；
牛、鹿、猪、羊、狗、猫、兔均无相应特征肽。
作为优选方案，特征肽段中的Pro发生了羟基化修饰(Hydroxylation)、Asn和Gln发生了脱酰胺化修饰(Deamidation)后的肽段，也为对应物种的特征肽段。
本发明所述的阿胶及其制品真伪鉴别及判断其掺假物种的方法，所述的阿胶制品包括：阿胶膏、阿胶糕、阿胶口服液、阿胶浆、阿胶颗粒等。
本发明所述的阿胶及其制品真伪鉴别及判断其掺假物种的方法，阿胶伪品包括驴皮、马皮、猪皮、牛皮、鹿皮、羊皮、狗皮、猫皮、兔皮、火鸡皮、鸡皮等。
本发明所述的阿胶及其制品真伪鉴别及判断其掺假物种的方法，还可应用于牛皮、鹿皮、猪皮等样品的真伪鉴别及判断其掺假物种中应用。
本发明具有如下优点：
本发明通过大量实验筛选，采用特定的蛋白质内切酶切割胶原蛋白，其中LysC切割胶原蛋白获得的专属性肽段可用于同时区分：驴皮、马(或骡)皮、猪皮、牛(或鹿)皮、羊皮、狗皮、猫皮、兔皮、火鸡皮、鸡皮样品。
特别采用GluC切割胶原蛋白获得的专属性肽段可用于同时区分：驴皮、马(或骡)皮、猪皮、牛皮、鹿皮、羊皮、狗(或猫)皮、兔皮样品。
本发明提供的阿胶及其制品的鉴别方法，通过大量实验筛选出最佳的色谱条件和质谱条件。整个方法操作简单，判断准确，能准确区分阿胶与马皮胶。本发明提供的肽段序列及技术方法有利于阿胶的质量控制，且可鉴别市场上的各类阿胶制品，可大大提高阿胶及其产品的检测效率和准确度，对保证阿胶及其制品的质量具有重要的意义。
附图说明
图1为使用LysC切割胶原蛋白获得的专属性肽段比对结果。
图2为使用GluC切割胶原蛋白获得的专属性肽段比对结果。
图3为各种胶类样品的MRM检测图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
实施例1：使用LysC切割胶原蛋白获得专属性肽段
(1)通过www.uniprot.org网址下载驴、马、牛、鹿、羊、猪、狗、猫、兔、火鸡、鸡的I型胶原蛋白α2链(COL1A2)的Fasta序列格式，输入Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis(MEGA)软件进行序列比对，寻找同源蛋白质之间的差异氨基酸位点。
(2)LysC蛋白酶选择性的切断赖氨酸(Lys，K)后的酰胺键，对步骤(1)中所有胶原蛋白模拟LysC切割，结果发现，以驴源的COL1A2为例，当COL1A2被LysC切割后获得的His973～Lys1006肽段，具有最佳的专属性，因此与驴源的COL1A2中His973～Lys1006肽段对应的不同物种中的同源肽段可作为对应的专属性肽段。
(3)将与驴源的COL1A2中His973～Lys1006肽段对应的同源肽段输入MEGA软件比对，结果如图1所示，表明该同源肽段具有非常好的专属性，可用于同时区分以下物种：驴、马(或骡)、猪、牛(或鹿)、羊、狗、猫、兔、火鸡、鸡。
实施例2：使用GluC切割胶原蛋白获得专属性肽段
(1)通过www.uniprot.org网址下载驴、马、牛、鹿、羊、猪、狗、猫、兔的I型胶原蛋白α2链(COL1A2)的Fasta序列格式，输入Molecular Evolutionary Genetics Analysis(MEGA)软件进行序列比对，寻找同源蛋白质之间的差异氨基酸位点。
(2)GluC蛋白酶选择性的切断谷氨酸酸(Glu，E)后的酰胺键，对步骤(1)中所有胶原蛋白模拟GluC切割，结果发现，以驴源的COL1A2为例，当COL1A2被GluC切割后获得的Arg946～Glu979肽段，具有最佳的专属性，因此与驴源的COL1A2中Arg946～Glu979肽段对应的不同物种中的同源肽段可作为对应的专属性肽段。
(3)将与驴源的COL1A2中Arg946～Glu979肽段对应的同源肽段输入MEGA软件比对，结果如图2所示，表明该同源肽段具有非常好的专属性，可用于同时区分以下物种：驴、马(或骡)、猪、牛、鹿、羊、狗(或猫)、兔。
实施例3：阿胶、马皮胶、骡皮胶、牛皮胶、鹿皮胶、猪皮胶的鉴别
(1)收集阿胶、马皮胶、骡皮胶、牛皮胶(黄明胶)、鹿皮胶、猪皮胶(新阿胶)的样品，取各种胶类药材粉末0.1g，置于50ml锥形瓶中加入1％NH4HCO3溶液定容至刻度，使其溶解，配制LysC溶液(LysC酶100μg用Resuspension Buffer 1ml重新溶解)，取胶类药液200μl加入配制好的LysC蛋白酶溶液20μl，37℃酶解12h，加入10％三氟乙酸溶液10μl进行灭活，离心(10000r/min)，用Seppak C18固相萃取脱盐，样品液氮气吹干，加水溶解，备用。
(2)采用液相色谱-三重四极杆质谱法(LC-QQQ-MS)检测，色谱条件为：岛津NexeraUPLC LC-20A液相系统，色谱柱为Waters UPLC T3柱(2.1mm×50mm,1.7μm)，上样量为2μL，流速0.4mL/min，流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，0～4min为2％A，4～10min为2％～40％A，10～15min为40％A；质谱条件为：ESI正离子模式，离子源温度500℃，离子化电压5.5kV，脱溶剂气温度500℃，MRM模式。
(3)MRM模式的离子对包括：驴源肽段的离子对645.530(5+)→659.810(2+)、马源肽段离子对649.740(5+)→670.830(2+)、牛/鹿源肽段离子对791.900(4+)→974.510(2+)、猪源肽段离子对639.720(5+)→567.750(2+)。
(4)结果如图3所示，在阿胶样品中，有且仅有驴源肽段的离子对645.530(5+)→659.810(2+)；在马皮胶样品中，有且仅有马源肽段离子对649.740(5+)→670.830(2+)；在骡皮胶中，同时检测到驴源肽段的离子对645.530(5+)→659.810(2+)与马源肽段离子对649.740(5+)→670.830(2+)；在鹿皮胶和牛皮胶样品中，均检测到离子对791.900(4+)→974.510(2+)；在猪皮胶样品中，有且仅有猪源肽段离子对639.720(5+)→567.750(2+)。表明本发明可准确区分阿胶同其他各种胶类动物药。
实施例4：阿胶、马皮胶、骡皮胶、牛皮胶、猪皮胶、鹿皮胶、羊皮胶的鉴别
(1)收集阿胶、马皮胶、骡皮胶、牛皮胶、猪皮胶、鹿皮胶、羊皮胶样品，取各种胶类药材粉末0.1g，置于50ml锥形瓶中加入1％NH4HCO3溶液定容至刻度，使其溶解，配制GluC蛋白酶溶液(GluC酶100μg用Resuspension Buffer 1ml重新溶解)，取胶类药液200μl加入配制好的GluC蛋白酶溶液20μl，37℃酶解12h，加入10％三氟乙酸溶液10μl进行灭活，离心(10000r/min)，用Seppak C18固相萃取脱盐，样品液氮气吹干，加水溶解，备用。
(2)然后采用液相色谱-串连质谱法，以电喷雾正离子模式扫描，对带电荷大于2的肽段进行二级质谱扫描，获得MS/MS图谱；
Nano LC-MS/MS条件：
戴安U3000 NanoRSLC纳升液相系统，色谱柱为5μm Reprosil C18AQ(75μm×150mm)，上样量为2μg，流速300nL/min，流动相A(乙腈/甲酸/水＝2/0.2/98，v/v/v)，流动相B(乙腈/甲酸/水＝80/0.2/20，v/v/v)，2～30％B线性梯度洗脱150min。
质谱条件为：喷雾电压为2.5kV，离子传输毛细管温度为200℃；质谱一级全扫描范围为m/z 300～2000，分离宽度为3Da；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离(CID)二级串联质谱。
选择自建数据库搜索，数据库中包含：
>Donkey_Peptide_Glu_C
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-His-
Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu
>Horse_Peptide_Glu_C
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-His-
Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-His-Arg-Gly-Glu
>Cattle_Peptide_Glu_C
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-
Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu
>Deer_Peptide_Glu_C
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Thr-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-
Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu
>Pig_Peptide_Glu_C
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-
Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu
>Sheep_Peptide_Glu_C
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-
Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Ser-Arg-Gly-Glu
检索参数设置为：前体离子误差20ppm；子离子误差0.2Da；允许2个位点误切，假阳性率(FDR)≤1％；酶切方式选择胰酶(GluC)，唯一肽段数(unique peptides)≥2；其它参数为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义(P<0.05)被认定为有效的鉴定结果。
结果阿胶样品中仅鉴定出专属肽段：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu；
马皮胶中仅鉴定出肽段骡皮胶中同时鉴定出肽段：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu和Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-His-Arg-Gly-Glu；
牛皮胶中仅鉴定出肽段：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu；
鹿皮胶中仅鉴定出肽段：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Thr-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu；
羊皮胶中仅鉴定出肽段：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Ser-Arg-Gly-Glu；
猪皮胶中仅鉴定出肽段：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Pro-Gly-Pro-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-Gln-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu。
实施例5：阿胶、马皮胶、骡皮胶的鉴别
(1)收集阿胶、马皮胶、骡皮胶样品，取各种胶类药材粉末0.1g，置于50ml锥形瓶中加入1％NH4HCO3溶液定容至刻度，使其溶解，配制GluC蛋白酶溶液(GluC酶100μg用Resuspension Buffer 1ml重新溶解)，取胶类药液200μl加入配制好的GluC蛋白酶溶液20μl，37℃酶解12h，加入10％三氟乙酸溶液10μl进行灭活，离心(10000r/min)，用Seppak C18固相萃取脱盐，样品液氮气吹干，加水溶解，备用。
(2)然后采用液相色谱-串连质谱法，以电喷雾正离子模式扫描，对带电荷大于2的肽段进行二级质谱扫描，获得MS/MS图谱；
Nano LC-MS/MS条件：
戴安U3000 NanoRSLC纳升液相系统，色谱柱为5μm Reprosil C18AQ(75μm×150mm)，上样量为2μg，流速300nL/min，流动相A(乙腈/甲酸/水＝2/0.2/98，v/v/v)，流动相B(乙腈/甲酸/水＝80/0.2/20，v/v/v)，2～30％B线性梯度洗脱150min。
质谱条件为：喷雾电压为2.5kV，离子传输毛细管温度为200℃；质谱一级全扫描范围为m/z 300～2000，分离宽度为3Da；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离(CID)二级串联质谱。
选择自建数据库搜索，数据库中包含：
>Donkey_Peptide_Glu_C
Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu
>Horse_Peptide_Glu_C
Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Ser-Gly-Glu
检索参数设置为：前体离子误差20ppm；子离子误差0.2Da；允许2个位点误切，假阳性率(FDR)≤1％；酶切方式选择胰酶(GluC)，唯一肽段数(unique peptides)≥2；其它参数为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义(P<0.05)被认定为有效的鉴定结果。
结果阿胶样品中仅鉴定出专属肽段：
Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu；
马皮胶中仅鉴定出肽段骡皮胶中同时鉴定出肽段：
Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu和Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Ser-Gly-Glu；
判定标准：如样品中仅检测出肽段Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu，则为阿胶；如仅检测出肽段Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Ser-Gly-Glu，则为马皮胶；如同时检测出肽段Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu和Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Ser-Gly-Glu，则为掺了马皮的阿胶或骡皮胶。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京中医药大学
<120> 一种利用蛋白质内切酶切割胶原蛋白获得专属性肽段的方法和应用
<141> 2020-03-04
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Arg Gly Tyr Pro Gly Asn Ala Gly Pro Val Gly Ala Val Gly Ala Pro
1 5 10 15
Gly Pro His Gly Pro Val Gly Pro Thr Gly Lys His Gly Asn Arg Gly
20 25 30
Glu
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Pro Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Thr Gly Glu
1 5 10 15
<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
His Gly Asn Arg Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Ser Val Gly Pro Val
1 5 10 15
Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Val Arg Gly
20 25 30
Asp Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
His Gly His Arg Gly Glu Pro Gly Pro Val Gly Ser Val Gly Pro Val
1 5 10 15
Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Val Arg Gly
20 25 30
Asp Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
His Gly Asn Arg Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Ala
1 5 10 15
Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Ile Arg Gly
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Asp Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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His Gly Asn Arg Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Val Gly Pro Ala
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Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Ile Arg Gly
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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Ile Arg Gly
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Asp Lys
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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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His Gly Asn Arg Gly Glu Pro Gly Pro Ala Gly Ser Val Gly Pro Val
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Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Ile Arg Gly
20 25 30
Asp Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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Gly Ala Val Gly Pro Arg Gly Pro Thr Gly Pro Gln Gly Ile Arg Gly
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Asp Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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Gly Ala Ala Gly Pro Arg Gly Pro Ser Gly Pro Gln Gly Ile Arg Gly
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Asp Lys
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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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Gly Ala Phe Gly Pro Arg Gly Leu Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly
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Glu Lys
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Pro Gly Asn Arg Gly Asp Pro Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Pro Ala
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Gly Ala Phe Gly Pro Arg Gly Leu Ala Gly Pro Gln Gly Pro Arg Gly
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Glu Lys
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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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Gly Pro His Gly Pro Val Gly Pro Thr Gly Lys His Gly His Arg Gly
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Glu
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Gly Pro Gln Gly Pro Val Gly Pro Val Gly Lys His Gly Asn Arg Gly
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Glu
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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 19
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Pro Gly Asn Ile Gly Phe Pro Gly Pro Lys Gly Pro Ser Gly Glu
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Claims (2)

1.用于鉴别阿胶及其制品的驴源性特征肽段，其特征在于，所述的特征肽段为2条，2条特征肽段的序列分别为：
Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ala-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Ala-Pro-Gly-Pro-His-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Thr-Gly-Lys-His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu和
Pro-Gly-Asn-Ile-Gly-Phe-Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Pro-Thr-Gly-Glu。
2.权利要求1所述的用于鉴别阿胶及其制品的驴源性特征肽段在鉴别阿胶、马皮、牛皮、羊、鹿皮或猪皮中的应用。
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特征肽段检测技术用于胶类药材专属性鉴别方法研究;程显隆;《中国药学杂志》;20150131;第50卷(第2期);摘要，第2-3小节 *

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