CN105301165A - 一种驴特征性多肽及其在检测驴皮源性成分中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种驴特征性多肽及其在检测驴皮源性成分中的应用，本发明所提供的驴特征性多肽，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，该多肽为驴的胶原蛋白中所特有。此外，本发明还提供了一种检测胶类中药中驴皮源性成分的方法，包括采用胰蛋白酶或精氨酸-C酶酶切胶类中药，使特征性多肽从胶原蛋白中游离出，然后采用液相色谱-串联质谱检测，从而判断是否含有驴皮源性成分。该方法具有特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能准确鉴定胶类中药中是否含有驴皮源性成分。

Description

一种驴特征性多肽及其在检测驴皮源性成分中的应用

技术领域

本发明涉及一种动物物种和动物源性成分鉴定的方法，具体涉及一种驴皮源性成分的检测方法；此外，本发明还涉及检测驴皮源性成分的特征性多肽。

背景技术

阿胶作为一种传统名贵中药，已有数千年的食用历史，具有补血滋阴，润燥，止血的功效。中国药典规定，阿胶为马科动物驴EquusasinusL.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶。纯正的阿胶必需来自百分百的驴皮，方能保证产品的功效。从原料生物分类学上看，驴属于奇蹄目马科驴属，包括非洲野驴、藏野驴、中亚野驴、家驴等品种。其中中国饲养的家驴包括关中驴、德州驴、广灵驴、佳米驴、泌阳驴、淮阳驴、庆阳驴、华北驴、新疆驴、西南驴等众多地方品种。由于驴的畜牧价值不断下降，而其经济价值却未见提高，驴的数量在世界范围内急剧下降，驴皮的供应也逐年紧张，价格不断上涨。市场上出现了很多不法分子，在生产阿胶时，部分甚至全部用各种其他动物皮包括马皮、牛皮、猪皮等，甚至脏皮、烂皮、病死动物的皮等来取代驴皮进行熬制。这些伪品的存在严重干扰了市场正常秩序，损害消费者利益，影响正规产品的信誉。

胶类中药一般经长时间高温蒸煮浓缩而成，主要成分非常相近且不同厂家的生产工艺存有差异，采用红外、近红外、X-衍射等方法对胶类中药纯品进行真伪鉴别常存在判断不准确、缺乏足够说服力等。目前已报道的比较权威的方法主要是DNA分子鉴定方法和检测特征性肽段的液质联用方法。DNA分子鉴定方法是鉴别动物DNA非常成熟的方法，但在胶类的熬制过程中，DNA被严重破坏、降解，残存量极少，大大限制了该方法在胶类鉴别中的有效应用。液质联用法测定蛋白质酶解肽的方法已经很成熟，只要找到动物源性成分稳定存在的特征性多肽，便可用于检测；已报道的液质联用方法鉴别胶类中药的成分包括牛皮源性成分、猪皮源性成分、龟源性成分、鹿源性成分等，虽有驴皮源性成分检测方法的报道，但实为驴马共有成分，无法区分阿胶和马皮胶。目前仍没有用液质联用仪检测驴皮源性成分的检测方法，这不但因为稳定存在的特征性多肽的寻找、鉴定及确认工作本身需付出大量的努力，而且驴和马的亲缘关系非常近，它们在生物学本质上的差异也十分有限，因此很难找到驴的特征性多肽用于驴皮源性成分的液质联用检测方法。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种驴特征性多肽以及一种检测胶类中药中驴皮源性成分的方法，所述方法操作简单，特征性强，灵敏度高，能准确鉴定胶类中药中是否含有驴皮源性成分。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的一种驴特征性多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

进一步的，本发明还提出了一种检测胶类中药中驴皮源性成分的方法，其特征在于包括：将待检测的胶类中药样品用胰蛋白酶或精氨酸-C酶进行酶切后，取酶解溶液放入液质联用仪，以待检测的胶类中药样品为基质，加入SEQIDNO.1所示的驴特征多肽或阿胶纯品作为对照，采用二级质谱模式，选择三电荷母离子m/z690.8及其子离子的离子对进行监测；如果检测出该离子的保留时间与对照品一致，且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有驴皮源性成分。

在本发明所述的方法中，优选的，所述胶类中药包括阿胶、黄明胶、龟甲胶、鹿角胶、狗骨胶以及海龙胶。

在本发明所述的方法中，优选的，所述的酶切是按照以下方法进行：取0.05g待检测的胶类中药样品于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液，超声使样品完全溶解，然后用1％(w/w)，pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取滤液100μl加入2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。

在本发明所述的方法中，优选的，液质联用仪检测的液相条件为：采用2.1mm×100mm，1.8μmC₁₈反相色谱柱，流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～40min，2％～50％B；质谱条件为：电喷雾正离子模式进行多反应监测，选择m/z690.8→752.4，809.5，908.5作为检测离子对进行MRM扫描。

采用本发明的方法，能够快速检测胶类中药中是否含有驴皮源性成分，虽然该驴特征多肽(SEQIDNO.1所示)的肽链中间含有精氨酸，但其特殊的空间结构，阻碍了胰蛋白酶或精氨酸-C酶的酶切，从而保留了完整的肽链；尽管胶类中药中胶原蛋白多肽有一定水解与破坏，但本发明基于其主要成分胶原蛋白中的差异性多肽，其含量高，采用液质联用仪完全能够达到检测目的，不但能够将亲缘关系较近的驴源性成分和马种源性成分进行区分，而且能对驴皮源性成分进行定量。

本发明考察了大量的不同驴种的驴皮熬制成的胶，这些驴种包括关中驴、德州驴、广灵驴、晋南驴、佳米驴、泌阳驴、淮阳驴、庆阳驴、华北驴、新疆驴、西南驴等；同时也考察了大量的不同马种的马皮熬制成的胶，这些马种包括蒙古马、伊利马、西南马、云南马、百色马、贵州马、三河马、巴里坤马等，证明本发明中的驴特征性多肽在各种驴皮及所熬制的胶中均含有，而在各种马皮及所熬制的胶中均不含有，进一步证明了方法的可靠性。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1是纯品胶MRM扫描模式下选择离子对m/z690.8→752.4，809.5，908.5监测的质谱图；

图2是加入5％阿胶的混合胶MRM扫描模式下选择离子对m/z690.8→752.4，809.5，908.5监测的质谱图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实例进行详细描述。优选实例中没有注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件进行。

实施例1各种纯品胶中驴特征性多肽的检测

1、材料和试剂

材料：各种纯品胶类中药，包括阿胶、马皮胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶、鹿角胶、狗骨胶、海龙胶，分别用驴皮、马皮、牛皮、猪皮、龟甲、鹿角、狗腿骨、海龙煎煮获得。

试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)。

2、检测方法

(1)取0.05g待测胶类中药样品于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。

(2)取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：C₁₈反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～40min，2％～50％B。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)进行多反应监测，选择m/z690.8→752.4，809.5，908.5作为检测离子对进行MRM扫描。

3、结果

结果见图1，18.3min处只有阿胶中检出相应的离子峰，其他均没有检出，可见该法能够特异性检测驴皮源性成分，而与其他各种动物源性成分包括马、牛、猪、龟、鹿等进行区分。

实施例2胶类中药中驴皮源性成分的检测

1、材料和试剂

材料：混合胶样品由实施例1中的纯品胶样品分别加入5％(w/w)阿胶制成，包括含5％(w/w)阿胶的马皮胶、含5％(w/w)阿胶的黄明胶、5％(w/w)阿胶的猪皮胶、含5％(w/w)阿胶的龟甲胶、含5％(w/w)阿胶的鹿角胶、含5％(w/w)阿胶的狗骨胶、含5％(w/w)阿胶的海龙胶。

试剂：碳酸氢铵(分析纯)、胰蛋白酶(序列纯，购自中国药品生物制品检定研究院)。

2、检测方法

(1)取0.05g待测样品于25ml量瓶中，加少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液，超声使样品完全溶解，用1％(w/w)NH₄HCO₃溶液(pH8.0)稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取滤液100μl加2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。

(2)取5μl酶解溶液放入液质联用仪检测。液相条件：C₁₈反相色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)，流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～40min，2％～50％B。质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI⁺)进行多反应监测，选择m/z690.8→752.4，809.5，908.5作为检测离子对进行MRM扫描。

3、结果

结果见图2，18.3min处加入5％阿胶的混合胶样品中均检出相应的离子峰，而实施例1中的马皮胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶、鹿角胶、狗骨胶以及海龙胶中均没有检出相应的离子峰。可见该法能够特异性检测混入驴皮源性成分的胶类中药。

综上所述，针对驴的胶原蛋白序列中包含其专属性多肽His-Gly-Asn-Arg-Gly-Glu-Hyp-Gly-Pro-Val-Gly-Ser-Val-Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Arg(SEQIDNO.1所示)，经胰蛋白酶或精氨酸-C酶酶切从胶原蛋白中游离出，采用液相色谱-串联质谱，可检测胶类中药中的驴皮源性成分。

需要说明的是，以上实施例仅用以说明发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域技术人员对本发明作的各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

Claims (5)

1.一种驴特征性多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.一种检测胶类中药中驴皮源性成分的方法，其特征在于包括：将待检测的胶类中药样品用胰蛋白酶或精氨酸-C酶进行酶切后，取酶解溶液放入液质联用仪，以待检测的胶类中药样品为基质，加入SEQIDNO.1所示的驴特征多肽或阿胶纯品作为对照，采用二级质谱模式，选择三电荷母离子m/z690.8及其子离子的离子对进行监测；如果检测出该离子的保留时间与对照品一致，且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有驴皮源性成分。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述胶类中药包括阿胶、黄明胶、龟甲胶、鹿角胶、狗骨胶以及海龙胶。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的酶切是按照以下方法进行：取0.05g待检测的胶类中药样品于25ml量瓶中，加入少量1％(w/w)NH₄HCO₃溶液，超声使样品完全溶解，然后用1％(w/w)，pH8.0的NH₄HCO₃溶液稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，精密量取滤液100μl加入2mg/ml的胰蛋白酶溶液10μl，37℃恒温酶解12h。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，液质联用仪检测的液相条件为：采用2.1mm×100mm，1.8μmC₁₈反相色谱柱，流动相A为0.1％(v/v)甲酸溶液，流动相B为乙腈，流速0.3ml/min；梯度洗脱：0～40min，2％～50％B；质谱条件为：电喷雾正离子模式进行多反应监测，选择m/z690.8→752.4，809.5，908.5作为检测离子对进行MRM扫描。