CN106198790A

CN106198790A - 一种马和骡共有特征性多肽及其应用

Info

Publication number: CN106198790A
Application number: CN201610504874.XA
Authority: CN
Inventors: 石峰; 巩丽萍; 李雪; 杭宝建; 咸瑞卿; 迟连利
Original assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Current assignee: Shandong Institute for Food and Drug Control
Priority date: 2016-07-01
Filing date: 2016-07-01
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2036-07-01
Also published as: CN106198790B

Abstract

本发明公开了一种马和骡共有特征性多肽及其在皮类和胶类中药马源性和骡源性成分检测中的应用，本发明所提供的特征性多肽的氨基酸序列如GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK所示，该多肽为马皮和骡皮胶原蛋白所特有。此外，本发明提供了一种马皮和骡皮的鉴别方法，包括采用胰蛋白酶处理皮，采用液相色谱‑串联质谱检测特征肽，从而鉴定皮是否是马皮或者骡皮。本发明还提供了检测胶类中药中马源性和骡源性成分的方法，包括采用胰蛋白酶酶切胶类中药，使特征性多肽从胶原蛋白中游离出来，采用液相色谱‑串联质谱检测，从而判断胶类中药中是否掺入了马源性成分或骡源性成分。该方法具有特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能够准确的鉴定胶类中药中是否含有马源性成分或骡源成分。

Description

一种马和骡共有特征性多肽及其应用

（一）技术领域

本发明涉及检测及应用领域，特别涉及一种马和骡共有特征性多肽及其应用。

（二）背景技术

阿胶由驴皮熬制而成，具有滋阴补血等多重，深受广大消费者的欢迎，目前阿胶及阿胶相关的药品、食品、保健食品等系列产品年产值已经超过300亿。据悉，目前市场阿胶的产量远远超出了驴皮的保有量，即使加上越来越量大的进口驴皮，也不能满足阿胶生产需要。在驴皮与杂皮价格相差10到20倍的巨大利益空间的诱惑下，不法企业铤而走险，利用价格低的马皮，骡皮原料来生产阿胶。马皮胶的特性与驴皮胶的特性截然不同，这中掺假现象给消费者的健康带来了严重的隐患，同时也扰乱了阿胶市场的秩序，阻碍了阿胶产业的健康发展。目前无论是药品标准还是食品标准均无专属性强、灵敏度高的方法，对以上违法行为进行有效打击，无法有效保证公众饮食用药安全和保护消费者的利益，因此找到快速鉴别阿胶真伪的方法具有十分重要的意义。

基于聚合酶链式反应（PCR）的DNA检测技术是食品中成分鉴定的常用方法，但是由于阿胶是经过长时间高温熬制而成，阿胶的DNA破坏严重，难以被有效的检测。胶原蛋白是动物皮类中的主要蛋白，皮类熬制的胶中含有大量胶原蛋白的多肽序列。液质联用技术测定物种特异性蛋白质的的特征肽，从而对食品药品进行物种溯源的方法已经比较成熟。已经报道很多利用液质联用方法鉴定胶类中药源性成分生物方法，包括牛皮源性成分、猪皮源性成分、龟源性成分、驴源性成分、鹿源性成分，但这些方法都是通过液质联用检测不同源性胶的酶切产物，然后比较不同来源胶的检测结果获得特征性多肽。但是由于酶切不彻底，检测到的特征性多肽可能是没有酶切完全的多肽；另外质谱扫描条件的限制不可能扫描到全部的酶切后的肽段。这样就可能造成所发现的特征性多肽并不具有特异性或者发现不了真实存在的特征肽。

（三）发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种马和骡共有特征性多肽及其应用。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种马和骡共有特征性多肽及其应用，其特征为：氨基酸序列为GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK。

具体的，液质联用检测动物皮的马源性和骡源性及用于检测胶类中药中的马源性和骡源性成分的内标物特征在于，氨基酸序列为GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK。

具体的，所述液质联用检测动物皮的马源性和骡源性方法，包括步骤如下：将待测的皮类样品用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解溶液加入液质联用仪，以待检测的样品为基质，加入权利2所述的内标物采用质谱MRM模式，选择母离子及其子离子对进行监测；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则鉴定该皮是马皮或者骡皮。

具体的，包括驴皮、马皮、骡皮、牛皮、羊皮、猪皮。

具体的，称取皮类样品，利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液（0.5MTris-HCl，2.75 mM EDTA ，0.5M Guanadine，pH8.0），进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液用于特征肽的分析。

具体的，将待测的胶类中药样品用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解溶液加入液质联用仪，以待检测的胶类中药样品为基质加入权利2所述的内标物采用质谱MRM模式，选择母离子及其子离子对进行监测；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有马源性或者骡源性成分。

具体的，所述的胶类中药包括驴皮胶、马皮胶、骡皮胶、牛皮胶、羊皮胶、猪皮胶。

具体的，胶类样品的处理方法为：称取胶类样品溶于碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液用于特征肽的分析。

具体的，液质联用条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～25分钟，A 95%→80%，B 5%→20%；25～40分钟，A 80%→50%，B 20%→50%。流速为0.3ml/min。以Waters 三重四级杆质谱仪作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 386.25（双电荷）→499.25, m/z 386.25（双电荷）→643.28，m/z 563.24（双电荷）→499.25, m/z 416.22（双电荷）→698.37为检测离子对。

本发明通过uniprot提供的peptidemass功能模拟trypsin酶解不同物种胶原蛋白的结果，并通过将马的胶原蛋白序列与其他物种胶原蛋白的序列比对获得马皮胶原蛋白和骡皮胶原蛋白所特有的特征性多肽序列，并将其应用到皮类和胶类的检测或鉴定中，该方法具有特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能够准确的鉴定胶类中药中是否含有马源性成分或骡源成分。

（四）附图说明

下面结合附图对发明作进一步的说明。

图1为马皮处理样品中特征肽GASGPAGVR的一级质谱图；

图2 为马皮处理样品中特征肽GASGPAGVR的二级质谱图；

图3 为马皮处理样品中特征肽GPSGEPGKPGDK的一级质谱图；

图4 为马皮处理样品中特征肽GPSGEPGKPGDK的二级质谱图；

（五）具体实施方式

本发明采用的仪器设备、化学试剂及实验步骤。具体如下：

Waters三重四级杆串联质谱仪，NanoLC-Ultra NanoLC-Ultra系列超高效纳升级液相色谱串联Thermo Scientific公司LTQ-Orbitrap Velos Pro高分辨质谱，碳酸氢铵，胰蛋白酶购自Sigma公司、乙腈、甲酸购自Merck公司。所有试剂均为色谱纯。

特征肽的标准品GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK由中国上海吉尔生化有限公司合成，纯度大于98%；超纯水由Milli-Q超纯水净化系统制备获得。

皮类样品的处理方法为：

称取皮类样品，利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液（0.5MTris-HCl，2.75 mM EDTA，0.5M Guanadine，pH8.0），进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin 37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液用于特征肽的分析。

胶类样品的处理方法为：

称取胶类样品溶于碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液用于特征肽的分析。

nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS 的检测条件如下：

色谱条件：采用EksigentNanoLC Ultra 2D纳升液相系统分离。约1.5μg样品经0.2mmx3.5mm（5μm粒径）的ReproSil-Pur C18-AQ Trap Column脱盐富集，采用75μmx25cm（5μm粒径）的ReproSil-Pur C18-AQ纳升分析柱分离。纳升分离泵流速为300nL/min。流动相A：2%乙腈，0.1%甲酸水溶液（v/v）；流动相B：70%乙腈，0.1%甲酸水溶液（v/v）。洗脱梯度为：0-5min流动相A为300nL/min；5-20min流动相A降低到270nL/min；20-75min流动相A降低到204nL/min；75-95min流动相A降低到150nL/min；95-110min流动相A为0nL/min；110-120min流动相A为300nL/min。质谱条件：质谱系统为Thermo Scientific公司LTQ-Orbitrap VelosPro串联高分辨质谱，离子源为Nanospray Flex纳喷源。采用正离子模式进行分析，喷雾电压为2.1kv，离子传输毛细管温度为275℃，S-Lens传输效率为60%。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000（m/z=400），采集范围为350-1650Th。二级质谱采用线性离子阱作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top20数据依赖模式进行母离子选择，采用CID模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为35%。

HPLC-TQ-S MS/MS的条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～25min，A 95%→80%，B 5%→20%；25～40min，A 80%→50%，B20%→50%。流速为0.3ml/min。以Waters 三重四极杆质谱作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 386.25（双电荷）→499.25, m/z 386.25（双电荷）→643.28，m/z 563.24（双电荷）→416.22, m/z 563.24（双电荷）→698.37为检测离子对。

实施例1：

马和骡共有特征肽的筛选和确定：

胶原蛋白是动物真皮中的主要蛋白，因此本发明在胶原蛋白中选择合适的多肽作为马皮胶原蛋白的特征性多肽。利用Uniport提供的PeptideMass功能模拟获得Trypsin酶解驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的结果；利用分子生物学软件MEGA5.0对驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的序列进行比对，理论上可获得两条相对于驴、牛、羊、猪具有物种特异性的马的特征性多肽，序列分别为GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK。另外由于骡子具有马胶原蛋白的基因，骡皮中也含有马胶原蛋白，所以GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK理论上是马皮胶原蛋白和骡皮胶原蛋白共有的特征肽。

为了验证马皮胶原蛋白和骡皮胶原蛋白共有的特征肽GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK，选择了驴皮、马皮、骡皮、牛皮、羊皮、猪皮，根据上文所述的样品预处理方法以及nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS液质联用分析方法。

检测结果表明，马皮酶解产物中检测出离子m/z386.2088(双电荷)（如图1）和563.2806（双电荷）（如图3所示），离子m/z386.2088(双电荷)所产生的碎片离子峰与特征肽GASGPAGVR的理论的离子碎片峰y5，y6，y7相吻合（如图2所示），离子563.2806（双电荷）所产生的碎片离子峰与特征肽GPSGEPGKPGDK的理论的离子碎片峰b5，b8，b11，y7相吻合（如图4所示），说明马皮样品中可以检测到特征肽GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK。另外在骡皮中也可以检测到特征肽GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK，在驴皮、牛皮、羊皮、猪皮中特征肽GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK均没有检出。以上结果可以说明GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK是马和骡共有的特征肽。

利用三重四级杆液质联用对以上特征肽进行MRM参数的优化，优化后的MRM参数如表1所示：

表1 特征肽的MRM参数

特征肽序列	一级离子（m/z）	二级子离子（m/z）	锥孔电压(V)	裂解能量(eV)
					GASGPAGVR	386.25	499.25,643.28	15	15
GPSGEPGKPGDK	563.24	416.22,698.37	30	25

实施例2：

多反应监测（MRM）检测皮类样品中的马源性和骡源性成分

选择了驴皮、马皮、骡皮、牛皮、羊皮、猪皮，根据上文所述的样品预处理方法以及HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法。检测结果如表2所示，表明只有在马皮和骡皮中可以检测到特征肽GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK。

表2 皮类样品中的特征肽检测结果

特征肽

驴

马

骡

牛

羊

猪

GASGPAGVR

-

+

-

GPSGEPGKPGDK

-

+

-

“+”表示检出；“-”表示未检出

实施例3：

多反应监测（MRM）检测纯品胶中的马源性和骡源性成分

胶类中药是由动物皮经过长时间的高温熬制而成，在高温熬制的过程中胶原蛋白不可避免的参与到一系列的反应中去，从而导致胶原蛋白的变性水解，为了验证本发明在检测胶类样品中马源性和骡源性成分的可行性，分别用驴皮、马皮，骡皮，牛皮，羊皮，猪皮熬制成胶。根据上文所述的胶类样品预处理方法以及HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法。检测结果如表3所示，表明只有在马皮胶和骡皮胶中可以检测到特征肽GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK。

表3 胶类样品中的特征肽检测结果

特征肽

驴皮胶

骡皮胶

牛皮胶

羊皮胶

猪皮胶

GASGPAGVR

-

+

-

GPSGEPGKPGDK

-

+

-

“+”表示检出；“-”表示未检出

实施例4：

多反应监测（MRM）检测胶类中药中的马源性和骡源性成分；

混合胶样品由实施例3中的纯品胶混合而得分别为驴皮胶加5%（w/w）马皮胶，牛皮胶加5%（w/w）的马皮胶，羊皮胶加5%（w/w）马皮胶，猪皮胶加5%（w/w）马皮胶，驴皮胶加5%（w/w）骡皮胶，牛皮胶加5%（w/w）的骡皮胶，羊皮胶加5%（w/w）骡皮胶，猪皮胶加5%（w/w）骡皮胶。根据上文所述的胶类样品预处理方法以及HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法。检测结果显示添加了马皮胶和骡皮胶的混合样品中均可以检测到特征肽GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK。而实施例3中驴皮胶、牛皮胶中、羊皮胶，猪皮胶中均没有检测到相应的特征肽。因此该方法可以用来检测驴皮胶、牛皮胶、羊皮胶、猪皮胶中掺入的马源性和骡源性成分。

本发明不局限于上述实施方式，任何人应得知在本发明的启示下做出的与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。

Claims

1.一种马皮和骡皮胶原蛋白共有特征性多肽及其应用，其特征为：氨基酸序列为GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK。

2.根据权利要求1所述的一种马皮和骡皮胶原蛋白共有特征性多肽及其应用，其特征在于：液质联用检测动物皮的马源性和骡源性及用于检测胶类中药中的马源性和骡源性成分的内标物特征在于，氨基酸序列为GASGPAGVR和GPSGEPGKPGDK。

3.根据权利要求2所述的一种马皮和骡皮胶原蛋白共有特征性多肽及其应用，其特征在于：所述液质联用检测动物皮的马源性和骡源性方法，包括步骤如下：将待测的皮类样品用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解溶液超滤后加入液质联用仪，以待检测的皮类样品为基质，加入权利2所述的内标物采用二级质谱模式，选择母离子与子离子对进行MRM检测；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则鉴定该皮是马皮或者骡皮。

4.根据权利3所述的动物皮，包括驴皮、马皮、骡皮、牛皮、羊皮、猪皮。

5.根据权利要求2所述的液质联用检测胶类中药中马源性和骡源性成分的方法，其特征在于包括：将待测的胶类中药样品用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解溶液超滤后加入液质联用仪，以待检测的胶类中药样品为基质加入权利2所述的内标物采用二级质谱模式，选择母离子与子离子对进行MRM检测；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有马源性或者骡源性成分。

6.根据权利要求5所述的胶类中药包括驴皮胶、马皮胶、骡皮胶、牛皮胶、羊皮胶、猪皮胶。

7.根据权利3和权利5中所述的的液质联用条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～25分钟，A 95%→80%，B 5%→20%；25～40分钟，A 80%→50%，B 20%→50%，流速为0.3ml/min，以质谱仪作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 386.25（双电荷）→499.25, m/z 386.25（双电荷）→643.28，m/z 563.24（双电荷）→416.22, m/z 563.24（双电荷）→698.37为检测离子对。