CN106589114A - 一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程 - Google Patents
一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106589114A CN106589114A CN201611148597.XA CN201611148597A CN106589114A CN 106589114 A CN106589114 A CN 106589114A CN 201611148597 A CN201611148597 A CN 201611148597A CN 106589114 A CN106589114 A CN 106589114A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mobile phase
- sus domestica
- property feature
- source property
- feature peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 67
- 108010052008 colla corii asini Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 20
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 54
- 241000282894 Sus scrofa domesticus Species 0.000 claims description 53
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 37
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 28
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 claims description 14
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 13
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 10
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 9
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 claims description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 241000283898 Ovis Species 0.000 claims description 8
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 8
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 8
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 8
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 8
- YTJSFYQNRXLOIC-UHFFFAOYSA-N octadecylsilane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC[SiH3] YTJSFYQNRXLOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 4
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 4
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 239000011260 aqueous acid Substances 0.000 claims 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 abstract 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 abstract 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 abstract 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 57
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 41
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 18
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 7
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 150000001343 alkyl silanes Chemical group 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 2
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 101710180313 Protease 3 Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- HQVFCQRVQFYGRJ-UHFFFAOYSA-N formic acid;hydrate Chemical compound O.OC=O HQVFCQRVQFYGRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程，包括一种猪源性特征肽，所述其氨基酸序列为GPTGPAGVR，猪源性特征肽在猪皮鉴定方面的应用流包括如下步骤：步骤一：将皮样去除毛、皮下脂肪及杂质；步骤二：将皮样采用胰蛋白酶酶解；步骤三：液质联用检测；步骤四：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测；猪源性特征肽在阿胶中猪皮源成分检测中的应用流程包括如下步骤：步骤一：将阿胶样品采用胰蛋白酶酶解；步骤二：进行液质联用检测；步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测。本发明的有益效果是，特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能够对猪皮和阿胶中的猪源性成分进行定性分析。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料应用，特别是一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程。
背景技术
阿胶由驴皮熬制而成，具有滋阴补血等多重，深受广大消费者的欢迎，目前阿胶及阿胶相关的药品、食品、保健食品等系列产品年产值已经超过300亿。由于阿胶的需求大，驴皮的供应量少，价格昂贵。猪皮供应量大，价格便宜。在利益的驱动下不法商家掺入猪皮生产阿胶，这损害了消费者的权益，也扰乱了市场秩序，阻碍了阿胶产业的健康发展，因此建立特异性的检测驴皮中掺入的猪皮和阿胶中猪皮源性的方法具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程。
实现上述目的本发明的技术方案为，一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程，包括一种猪源性特征肽，所述其氨基酸序列为GPTGPAGVR。
猪源性特征肽在猪皮鉴定方面的应用流程，包括如下步骤：
步骤一：将皮样去除毛、皮下脂肪及杂质；
步骤二：将皮样采用胰蛋白酶酶解：利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg皮类样品加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液，进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液；
步骤三：液质联用检测：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；
步骤四：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据检测结果可以从驴皮、马皮、牛皮、羊皮和猪皮中区分猪皮，检出猪源性特征肽，则该皮样为猪皮：选择m/z 406.55→657.81,556.81作为离子对进行MRM扫描。
步骤二中，所述变性缓冲液为0.5MTris-HCl，2.75mM乙二胺四乙酸，0.5M盐酸胍，pH8.0的缓冲液。
步骤四中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器。
猪源性特征肽在猪皮鉴定方面的应用流程，步骤四中，所述电喷雾离子源为ESI+
猪源性特征肽在阿胶中猪皮源成分检测中的应用流程，包括如下步骤：
步骤一：将阿胶样品采用胰蛋白酶酶解：称取胶类样品溶于碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液；
步骤二：进行液质联用检测：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；
步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，如果检出猪源性特征肽，则该阿胶样品中含有猪皮源性成分：选择m/z 406.55→657.81,556.81作为离子对进行MRM扫描。
步骤三中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器。
步骤三中，所述电喷雾离子源为ESI+。
利用本发明的技术方案制作的一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程，基于聚合酶链式反应(PCR)的DNA检测技术是食品中源性成分鉴定的常用方法，但是由于阿胶是经过长时间高温熬制而成，阿胶的DNA破坏严重，难以被有效的检测。胶原蛋白是驴皮中的主要蛋白，占85％以上，皮类熬制的胶中含有大量胶原蛋白的多肽序列。液质联用技术测定物种特异性蛋白质的的特征肽，从而对食品药品进行物种溯源的方法已经比较成熟。本发明通过Uniprot提供的Peptidemass功能模拟胰蛋白酶酶解不同物种胶原蛋白的结果，并通过将猪的胶原蛋白序列与其他物种胶原蛋白的序列比对获得一条猪源性特征肽序列，并将其应用到驴皮和阿胶的检测或鉴定中，该方法具有特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能够对猪皮和阿胶中的猪源性成分进行定性分析。
附图说明
图1是本发明所述猪源性特征肽在猪皮鉴定方面的应用流程的结构示意图；
图2是本发明所述猪源性特征肽在阿胶中猪皮源成分检测中的应用流程的结构示意图；
图3是本发明所述猪源性特征肽的液相质谱检测图；
图4是本发明所述含3％猪皮胶的阿胶中猪源性特征肽的MRM色谱图的结构示意图；
具体实施方式
下面结合附图对本发明进行具体描述，如图1-4所示，一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程，包括一种猪源性特征肽，所述其氨基酸序列为GPTGPAGVR；猪源性特征肽在猪皮鉴定方面的应用流程，包括如下步骤：步骤一：将皮样去除毛、皮下脂肪及杂质；步骤二：将皮样采用胰蛋白酶酶解：利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg皮类样品加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液，进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液；步骤三：液质联用检测：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；步骤四：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据检测结果可以从驴皮、马皮、牛皮、羊皮和猪皮中区分猪皮，检出猪源性特征肽，则该皮样为猪皮：选择m/z 406.55→657.81,556.81作为离子对进行MRM扫描；步骤二中，所述变性缓冲液为0.5MTris-HCl，2.75mM乙二胺四乙酸，0.5M盐酸胍，pH8.0的缓冲液；步骤四中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器；步骤四中，所述电喷雾离子源为ESI+；猪源性特征肽在阿胶中猪皮源成分检测中的应用流程，包括如下步骤：步骤一：将阿胶样品采用胰蛋白酶酶解：称取胶类样品溶于碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液；步骤二：进行液质联用检测：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，如果检出猪源性特征肽，则该阿胶样品中含有猪皮源性成分：选择m/z406.55→657.81,556.81作为离子对进行MRM扫描；步骤三中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器；步骤三中，所述电喷雾离子源为ESI+。
本实施方案的特点为，包括一种猪源性特征肽，所述其氨基酸序列为GPTGPAGVR，猪源性特征肽在猪皮鉴定方面的应用流程，包括如下步骤：步骤一：将皮样去除毛、皮下脂肪及杂质；步骤二：将皮样采用胰蛋白酶酶解；步骤三：液质联用检测：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；步骤四：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据检测结果可以从驴皮、马皮、牛皮、羊皮和猪皮中区分猪皮，检出猪源性特征肽，则该皮样为猪皮；猪源性特征肽在阿胶中猪皮源成分检测中的应用流程，包括如下步骤：步骤一：将阿胶样品采用胰蛋白酶酶解；步骤二：进行液质联用检测；步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，如果检出猪源性特征肽，则该该阿胶样品中含有猪皮源性成分，基于聚合酶链式反应(PCR)的DNA检测技术是食品中成分鉴定的常用方法，但是由于阿胶是经过长时间高温熬制而成，阿胶的DNA破坏严重，难以被有效的检测。胶原蛋白是驴皮中的主要蛋白，占85％以上，皮类熬制的胶中含有大量胶原蛋白的多肽序列。液质联用技术测定物种特异性蛋白质的的特征肽，从而对食品药品进行物种溯源的方法已经比较成熟。本发明通过Uniprot提供的Peptidemass功能模拟胰蛋白酶酶解不同物种胶原蛋白的结果，并通过将猪的胶原蛋白序列与其他物种胶原蛋白的序列比对获得猪相对于其他物种的特征性多肽序列，并将其应用到驴皮和阿胶的检测或鉴定中，该方法具有特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能够对猪皮和阿胶中的猪源性成分进行定性分析。
在本实施方案中，碳酸氢铵，胰蛋白酶购自Sigma公司、乙腈、甲酸购自Merck公司。所有试剂均为色谱纯。猪源性特征肽其氨基酸序列为GPTGPAGVR，猪源性特征肽在猪皮鉴定方面的应用流程包括如下步骤：步骤一：将皮样去除毛、皮下脂肪及杂质；步骤二：将皮样采用胰蛋白酶酶解：利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg皮类样品加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液，变性缓冲液为0.5MTris-HCl，2.75mM乙二胺四乙酸，0.5M盐酸胍，pH8.0的缓冲液，进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液；步骤三：采用HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法进行分析。HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法的条件如下：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱的内径为2.1mm；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；步骤四：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器，电喷雾离子源为ESI+，如果检出猪源性特征肽，则该阿胶样品中含有猪皮源性成分：选择m/z 406.55→657.81,556.81作为离子对进行MRM扫描。
在本实施方案中，猪源性特征肽在阿胶中猪皮源成分检测中的应用流程包括如下步骤：步骤一：将阿胶样品采用胰蛋白酶酶解：称取胶类样品溶于碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液；步骤二：采用HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法进行分析。HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法的条件如下：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱的内径为2.1mm；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器，电喷雾离子源为ESI+，如果检出猪源性特征肽，则该阿胶样品中含有猪皮源性成分：选择m/z 406.55→657.81,556.81作为离子对进行MRM扫描。
在本实施方案中，通过Uniprot提供的Peptidemass功能模拟胰蛋白酶酶解不同物种胶原蛋白的结果，并通过将猪的胶原蛋白序列与其他物种胶原蛋白的序列比对获得猪相对于其他物种的特征性多肽序列，并将其应用于猪皮和胶类药材中的猪皮源性成分检测，该方法具有特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能够对猪皮和阿胶中的猪源性成分进行定性分析。
在本实施方案中，实施例1猪源性特征肽的鉴定：
胶原蛋白是动物真皮中的主要蛋白，因此本发明在胶原蛋白中选择合适的多肽作为猪皮胶原蛋白的特征性多肽。利用Uniport提供的PeptideMass功能模拟获得胰蛋白酶酶解驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的结果；利用分子生物学软件MEGA5.0对驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的序列进行比对，获得的理论的猪源性特征肽序列为GPTGPAGVR。为了验证猪源性特征肽，选择了驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮，根据上文所述的样品预处理方法以及EASY-nLC1000-Orbitrap Fusion液质联用分析方法。检测结果如图3猪源性特征肽的液相质谱检测图所示，A：提取离子流；B：一级质谱；C：二级质谱图，特征肽的分子量和二级质谱都与理论值相符。
其中，EASY-nLC 1000-Orbitrap Fusion液质联用分析方法的检测条件为：第一，采用EASY-nLC 1000纳升液相系统进行分离。其中使用流动相A为2％乙腈的0.1％的甲酸水溶液和流动相B为98％乙腈的0.1％的甲酸水溶液作为检测试剂。其中工作人员可进行设备设置，洗脱梯度设置为第一阶段0→15min，流速为300nL·min-1，流动相A为100％，第二阶段15→70min，流速为300nL·min-1，流动相A为93％→78％，第三阶段70→90min，流速为300nL·min-1，流动相A为78％→65％，第四阶段90→95min，流速为300nL·min-1，流动相A为65％→10％，第五阶段95→105min，流速为450nL·min-1，流动相A为10％，其中的进样量均为1μl。第二，采用0.2mm×3.5cm(5μm粒径)的ReproSil-Pur C18-AQ Trap column进行脱盐富集工作，其中采用的仪器为实验室自制75μm×25cm(3μm粒径)的ReproSil-Pur C18-AQ纳升分析柱分离设备。第三，采用Thermo Scientific公司Fusion-Orbitrap高分辨质谱仪进行检测，其中离子源为Nanospray Flex纳喷源。采用正离子模式进行分析，喷雾电压为2.1kV，离子传输毛细管温度为275℃，S-Lens传输效率设置为60％。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60,000(m/z＝400)，采集范围为350-1,650Th。二级质谱采用离子阱作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top20数据依赖模式进行母离子选择，采用CID模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为35％，从而完成检测工作。
在本实施方案中，实施例2阿胶中猪皮源性成分的检测：
《中国药典》2015年版中规定，药屑杂质通常不得过3％，考虑到质谱仪器的检测误差及不同工艺条件下猪皮胶中猪源性特征肽的含量可能存在差别，因此在阿胶中添加了3％的猪皮胶验证特征肽的方法检测阿胶中掺入猪皮源性成分的可行性。根据上文所述的样品预处理方法以及HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法。检测结果如图4含3％猪皮胶的阿胶中猪源性特征肽的MRM色谱图所示，说明利用猪源性特征肽可以检测出阿胶中掺入的3％的猪皮胶。选择了阿胶、马皮胶、牛皮胶、羊皮胶、猪皮胶，根据上文所述的样品预处理方法以及HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法。
其中，HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法同权利要求书中所述的液质联用检测方法。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种猪源性特征肽，其特征在于，包括一种猪源性特征肽，所述其氨基酸序列为GPTGPAGVR。
2.一种根据权利要求1中猪源性特征肽在猪皮鉴定方面的应用流程，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将皮样去除毛、皮下脂肪及杂质；
步骤二：将皮样采用胰蛋白酶酶解：利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg皮类样品加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液，进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液；
步骤三：液质联用检测：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；
步骤四：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，根据检测结果可以从驴皮、马皮、牛皮、羊皮和猪皮中区分猪皮，检出猪源性特征肽，则该皮样为猪皮：选择m/z 406.55→657.81,556.81作为离子对进行MRM扫描。
3.根据权利要求2所述的一种根据权利要求1中猪源性特征肽在猪皮鉴定方面的应用流程，其特征在于，步骤二中，所述变性缓冲液为0.5MTris-HCl，2.75mM乙二胺四乙酸，0.5M盐酸胍，pH8.0的缓冲液。
4.根据权利要求2所述的一种根据权利要求1中猪源性特征肽在猪皮鉴定方面的应用流程，其特征在于，步骤四中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器。
5.根据权利要求2所述的一种根据权利要求1中猪源性特征肽在猪皮鉴定方面的应用流程，其特征在于，步骤四中，所述电喷雾离子源为ESI+。
6.一种根据权利要求1中猪源性特征肽在阿胶中猪皮源成分检测中的应用流程，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：将阿胶样品采用胰蛋白酶酶解：称取胶类样品溶于碳酸氢氨缓冲液，加入胰蛋白酶37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液；
步骤二：进行液质联用检测：采用的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0→5min，流动相A为95％；5→8min，流动相A为95％→92％；8→10min，流动相A为92％→50％；10→12min，流动相A为50％；12→12.1min，流动相A为50％→95％；12.1→15min，流动相A为95％,流速为0.3ml/min；
步骤三：采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，如果检出猪源性特征肽，则该阿胶样品中含有猪皮源性成分：选择m/z 406.55→657.81,556.81作为离子对进行MRM扫描。
7.根据权利要求6所述的一种根据权利要求1中猪源性特征肽在阿胶中猪皮源成分检测中的应用流程，其特征在于，步骤三中，所述电喷雾正离子模式以三重四极杆质谱作为检测器。
8.根据权利要求6所述的一种根据权利要求1中猪源性特征肽在阿胶中猪皮源成分检测中的应用流程，其特征在于，步骤三中，所述电喷雾离子源为ESI+。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611148597.XA CN106589114A (zh) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | 一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611148597.XA CN106589114A (zh) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | 一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106589114A true CN106589114A (zh) | 2017-04-26 |
Family
ID=58802284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611148597.XA Pending CN106589114A (zh) | 2016-12-13 | 2016-12-13 | 一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106589114A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109187835A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-11 | 南京中医药大学 | 一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法 |
| CN109280077A (zh) * | 2018-10-24 | 2019-01-29 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种鉴别阿胶及含阿胶制品中猪皮源性成分的多肽 |
| CN110596283A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-12-20 | 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） | 一种鉴定皮革制品猪牛羊物种属性的液质联用方法 |
| CN116462749A (zh) * | 2023-03-07 | 2023-07-21 | 山东省食品药品检验研究院 | 促肝细胞生长素特征多肽组及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105301165A (zh) * | 2015-10-09 | 2016-02-03 | 东阿阿胶股份有限公司 | 一种驴特征性多肽及其在检测驴皮源性成分中的应用 |
| WO2016157250A1 (ja) * | 2015-03-30 | 2016-10-06 | 国立大学法人神戸大学 | 動物種鑑別方法及び装置 |
| CN106198783A (zh) * | 2016-06-27 | 2016-12-07 | 成都中医药大学 | 一种阿胶的液质联用检测方法 |
-
2016
- 2016-12-13 CN CN201611148597.XA patent/CN106589114A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016157250A1 (ja) * | 2015-03-30 | 2016-10-06 | 国立大学法人神戸大学 | 動物種鑑別方法及び装置 |
| CN105301165A (zh) * | 2015-10-09 | 2016-02-03 | 东阿阿胶股份有限公司 | 一种驴特征性多肽及其在检测驴皮源性成分中的应用 |
| CN106198783A (zh) * | 2016-06-27 | 2016-12-07 | 成都中医药大学 | 一种阿胶的液质联用检测方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| MUSTAFA TAHSIN YILMAZ,ET AL.: "A novel method to differentiate bovine and porcine gelatins in food products: NanoUPLC-ESI-Q-TOF-MS based data independent acquisition technique to detect marker peptides in gelatin", 《FOOD CHEMISTRY》 * |
| 吴梧桐: "《生物制药工艺学》", 29 February 2016, 中国医药科技出版社 * |
| 张贵锋等: "高效液相色谱/质谱法识别不同明胶酶解产物中特征多肽", 《分析化学》 * |
| 曾跃: "《本科化学实验 2》", 31 October 2008, 湖南师范大学出版社 * |
| 李国英等: "《胶原化学》", 30 April 2013, 中国轻工业出版社 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109187835A (zh) * | 2018-09-17 | 2019-01-11 | 南京中医药大学 | 一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法 |
| CN109187835B (zh) * | 2018-09-17 | 2021-03-23 | 南京中医药大学 | 一种含蛋白质类中药的专属性肽段的鉴别方法 |
| CN109280077A (zh) * | 2018-10-24 | 2019-01-29 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种鉴别阿胶及含阿胶制品中猪皮源性成分的多肽 |
| CN109280077B (zh) * | 2018-10-24 | 2022-04-29 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种鉴别阿胶及含阿胶制品中猪皮源性成分的多肽 |
| CN110596283A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-12-20 | 深圳市计量质量检测研究院（国家高新技术计量站、国家数字电子产品质量监督检验中心） | 一种鉴定皮革制品猪牛羊物种属性的液质联用方法 |
| CN116462749A (zh) * | 2023-03-07 | 2023-07-21 | 山东省食品药品检验研究院 | 促肝细胞生长素特征多肽组及其应用 |
| CN116462749B (zh) * | 2023-03-07 | 2024-02-27 | 山东省食品药品检验研究院 | 促肝细胞生长素特征多肽组及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kennedy et al. | In vivo neurochemical monitoring by microdialysis and capillary separations | |
| Klepárník | Recent advances in combination of capillary electrophoresis with mass spectrometry: methodology and theory | |
| Warren | Organic N molecules in the soil solution: what is known, what is unknown and the path forwards | |
| Andjelković et al. | Mass spectrometry based proteomics as foodomics tool in research and assurance of food quality and safety | |
| CN106589114A (zh) | 一种猪源性特征肽及其猪皮和阿胶定性检测中的应用流程 | |
| Sidoli et al. | One minute analysis of 200 histone posttranslational modifications by direct injection mass spectrometry | |
| Saluti et al. | Simultaneous determination of aminoglycosides and colistins in food | |
| Maizels et al. | A LC/MS method for the determination of cyanobacteria toxins in water | |
| CN106093244A (zh) | 一种羊特征性多肽及其应用 | |
| CN106589063A (zh) | 一组驴源性特征肽及其在驴皮和阿胶胶定性检测中的应用流程 | |
| Simó et al. | CE‐TOF MS analysis of complex protein hydrolyzates from genetically modified soybeans–A tool for foodomics | |
| Jorge et al. | High‐sensitivity analysis of specific peptides in complex samples by selected MS/MS ion monitoring and linear ion trap mass spectrometry: application to biological studies | |
| Chakraborty et al. | Use of an integrated MS–multiplexed MS/MS data acquisition strategy for high‐coverage peptide mapping studies | |
| Suzuki et al. | Quantitative LC-MS and MS/MS analysis of sialylated glycans modified by linkage-specific alkylamidation | |
| Cordewener et al. | Untargeted LC‐Q‐TOF mass spectrometry method for the detection of adulterations in skimmed‐milk powder | |
| CN107290470B (zh) | 一种快速测定鸡蛋中磺胺类和喹诺酮类药物残留的方法 | |
| CN106198790B (zh) | 一种马和骡共有特征性多肽及其应用 | |
| CN109791131A (zh) | 用于生肉和加工肉类产品的肉种鉴定的lc/ms/ms分析 | |
| Hellinger et al. | Peptidomics | |
| CN106053697B (zh) | 一种牛源性特征性多肽及其应用 | |
| Luo et al. | Simultaneous determination of 169 veterinary drugs in chicken eggs with EMR-Lipid clean-up using ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry | |
| Losito et al. | Development of a method for the quantification of caseinate traces in Italian commercial white wines based on liquid chromatography–electrospray ionization–ion trap–mass spectrometry | |
| CN111443134A (zh) | 一种羊源性成分的标记肽及在明胶和明胶制品检测中的应用 | |
| CN114113381B (zh) | 一种舒氏海龙特征多肽及其应用和鉴别舒适海龙的方法 | |
| CN107064390A (zh) | 一种巧克力中过敏原的检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170426 |