CN106053697B - 一种牛源性特征性多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牛源性特征性多肽及其应用及其在皮类和胶类中药牛源性成分检测中的应用，本发明所提供的特征性多肽的氨基酸序列为GEGGPQGPR，该多肽为牛皮胶原蛋白所特有。本发明通过uniprot提供的peptidemass功能模拟trypsin酶解不同物种胶原蛋白的结果，并通过将牛的胶原蛋白序列与其他物种胶原蛋白的序列比对，获得牛皮胶原蛋白所特有的特征性多肽序列，并将其应用到皮类和胶类的检测或鉴定中，该方法具有特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能够准确的鉴定胶类中药中是否含有牛源性成分。
Description
技术领域
本发明涉及检测及应用领域，特别涉及一种牛源性特征性多肽及其应用。
背景技术
牛源性生物骨由于具有来源广泛、易于保存等优点，越来越多的应用于临床骨移植修复手术中，例如：用于骨科、口腔科及整形外科等需要进行的骨缺损及各种凹陷修复等。
常用的荧光定量pcr技术使得胶类中药中DNA的破坏严重，检测数据不准确，已有的利用液质联用特征检测肽鉴别胶类中药中的源性成分方法缺点是通过液质联用检测不同源性胶的酶切产物，然后比较检测结果获得特征性多肽，但是由于酶切不彻底，检测到的特征性多肽可能是没有酶切完全的多肽；另外质谱扫描条件的限制不可能扫描到全部的酶切后的肽段。这样就可能造成所发现的特征性多肽并不具有特异性或者发现不了真正的特性多肽；本发明旨在用高效的方法对牛源性生物骨材料进行准确无误的检测处理。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种牛源性特征性多肽及其应用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种牛源性特征性多肽及其应用，其特征在于：氨基酸序列为GEGGPQGPR。
具体的，使用nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS液质联用分析方法检测胶类中药中的牛源性特征性多肽的内标物特征在于，氨基酸序列为GEGGPQGPR。
具体的，所述nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS液质联用分析方法，包括步骤如下：称取皮类样品，利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液（0.5MTris-HCl，2.75 mM EDTA，0.5M Guanadine，pH8.0），进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin 37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液用于特征肽的分析。
具体的，所述的动物皮，包括驴皮、牛皮、骡皮、牛皮、羊皮、猪皮。
具体的，所述的nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS液质联用分析方法，其特征在于，将待测的胶类中药样品用胰蛋白酶进行酶切处理后，取酶解溶液加入液质联用仪，以待检测的胶类中药样品为基质加入权利2所述的内标物采用二级质谱模式，选择母离子与子离子对进行MRM监测；如果检测出的该离子的保留时间与对照品一致，而且其子离子与对照品的子离子一致，则所述样品中含有牛源性或者骡源性成分。
具体的，所述的胶类中药样品中包括驴皮胶、牛皮胶、羊皮胶、牛皮胶、骡皮胶、猪皮胶。
具体的，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～25分钟，A 95%→80%，B 5%→20%；25～40分钟，A 80%→50%，B 20%→50%。流速为0.3ml/min。以Waters三重四级杆串联质谱仪作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 427.76（双电荷）→329.25, m/z 427.76（双电荷）→668.26为检测离子对。
本发明通过uniprot提供的peptidemass功能模拟trypsin酶解不同物种胶原蛋白的结果，并通过将牛的胶原蛋白序列与其他物种胶原蛋白的序列比对，获得牛皮胶原蛋白所特有的特征性多肽序列，并将其应用到皮类和胶类的检测或鉴定中，该方法具有特征性强，灵敏度高，操作简单等优点，能够准确的鉴定胶类中药中是否含有牛源性成分。
附图说明
下面结合附图对发明作进一步的说明。
图1为牛皮处理样品中特征肽GEGGPQGPR的一级质谱图；
图2 为牛皮处理样品中特征肽GEGGPQGPR二级质谱图；
具体实施方式
本发明采用的仪器设备、化学试剂及实验步骤。具体如下：
仪器及化学用品：
Waters三重四级杆串联质谱仪，NanoLC-Ultra NanoLC-Ultra系列超高效纳升级液相色谱串联Thermo Scientific公司LTQ-OrbitrapVelos Pro高分辨质谱，碳酸氢铵、胰蛋白酶购自Sigma公司、乙腈、甲酸购自Merck公司。所有试剂均为色谱纯。
特征肽的标准品GASGPAGVR由中国上海吉尔生化有限公司合成，纯度大于98%。超纯水由Milli-Q超纯水净化系统制备获得。
2 皮类样品处理方法如下：
称取皮类样品，利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将皮溶解，冷冻干燥后称取1.5mg加入去离子水配成一定浓度的蛋白样品，加入变性缓冲液（0.5MTris-HCl，2.75 mMEDTA，0.5M Guanadine，pH8.0），进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin 37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液用于特征肽的分析。
3 胶类样品的处理方法如下：
称取胶类样品溶于碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液用于特征肽的分析。
nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS 的检测条件如下：
色谱条件：采用EksigentNanoLC Ultra 2D纳升液相系统分离。约1.5μg样品经0.2mmx3.5mm（5μm粒径）的ReproSil-Pur C18-AQ Trap Column 脱盐富集，采用75μmx25cm（5μm粒径）的ReproSil-Pur C18-AQ 纳升分析柱分离。纳升分离泵流速为300nL/min。流动相A：2%乙腈，0.1%甲酸水溶液（v/v）；流动相B：70%乙腈，0.1%甲酸水溶液（v/v）。洗脱梯度为：0-5min 流动相A为300nL/min；5-20min流动相A降低到270nL/min；20-75min流动相A降低到204nL/min；75-95min流动相A降低到150nL/min；95-110min流动相A为0nL/min；110-120min流动相A为300nL/min。质谱条件：质谱系统为Thermo Scientific公司LTQ-OrbitrapVelos Pro串联高分辨质谱，离子源为Nanospray Flex纳喷源。采用正离子模式进行分析，喷雾电压为2.1kv，离子传输毛细管温度为275℃，S-Lens传输效率为60%。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000（m/z=400），采集范围为350-1650Th。二级质谱采用线性离子阱作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top20数据依赖模式进行母离子选择，采用CID模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为35%。
HPLC-TQ-S MS/MS的条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（色谱柱内径2.1mm）；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～25分钟，A 95%→80%，B 5%→20%；25～40分钟，A 80%→50%，B 20%→50%。流速为0.3ml/min。以Waters三重四级杆串联质谱仪作为检测器，电喷雾离子源：ESI+，多反应监测（MRM），选择m/z 427.76（双电荷）→329.25, m/z 427.76（双电荷）→668.26为检测离子对。
实施例1 ：
牛特征肽的筛选和确定：
胶原蛋白是动物真皮中的主要蛋白，因此本发明在胶原蛋白中选择合适的多肽作为牛皮胶原蛋白的特征性多肽。利用Uniport提供的PeptideMass功能模拟获得Trypsin酶解驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的结果；利用分子生物学软件 MEGA5.0对驴皮、马皮、牛皮、羊皮、猪皮胶原蛋白的序列进行比对，获得一条相对于驴、牛、羊、猪具有物种特异性的牛的特征性多肽，序列分别为GEGGPQGPR。为了验证牛皮胶原蛋白的特征肽GEGGPQGPR，选择了驴皮、马皮、骡皮、牛皮、羊皮、猪皮。根据上文所述的样品预处理方法以及nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS液质联用分析方法。检测结果表明，牛皮酶解产物中检测出离子m/z 427.7094(双电荷)（如图1所示），离子m/z 427.7094 (双电荷)所产生的碎片离子峰与特征肽GEGGPQGPR的理论的离子碎片峰y6，y13相吻合（如图2所示），说明牛皮样品中可以检测到特征肽GEGGPQGPR。在驴皮、牛皮、羊皮、猪皮中特征肽GEGGPQGPR均没有检出。以上结果可以说明GEGGPQGPR是牛的特征肽。
利用三重四级杆液质联用对以上特征肽进行MRM监测，MRM参数如表1：
表1 特征肽的MRM监测参数
| 特征肽序列 | 一级离子（m/z） | 二级子离子（m/z） | 锥孔电压(V) | 裂解能量(eV) |
| GEGGPQGPR | 427.76 | 329.25,668.26 | 20 | 18 |
实施例 2 ：
多反应监测（MRM）检测皮类样品中的马源性和骡源性成分
选择了驴皮、马皮、骡皮、牛皮、羊皮、猪皮，根据上文所述的样品预处理方法以及HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法。特征肽GEGGPQGPR的一级离子和二级子离子在驴皮、马皮、骡皮、羊皮、猪皮检测不到，在牛皮中可以检测到，说明特征肽可以用于牛皮的鉴定。
实施例3 ：
多反应监测（MRM）检测纯品胶中的马源性和骡源性成分
胶类中药是由动物皮经过长时间的高温熬制而成，在高温熬制的过程中胶原蛋白不可避免的参与到一系列的反应中去，从而导致胶原蛋白的变性，为了验证本发明在检测胶类样品中牛源性成分的可行性，分别用驴皮、马皮，骡皮，牛皮，羊皮，猪皮熬制成胶。根据上文所述的胶类样品预处理方法以及HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法。特征肽GEGGPQGPR的一级离子和二级子离子在驴皮胶、马皮胶、骡皮胶、羊皮胶、猪皮胶检测不到，在牛皮胶中可以检测到，说明特征肽GEGGPQGPR是牛皮胶所特有的。
实施例4 ：
多反应监测（MRM）检测胶类中药中的牛源性成分；
混合胶样品由实施例2中的纯品胶混合而得分别为驴皮胶加5%（w/w）牛皮胶，骡皮胶加5%（w/w）的马牛皮胶，羊皮胶加5%（w/w）牛皮胶，猪皮胶加5%（w/w）牛皮胶。根据上文所述的胶类样品预处理方法以及HPLC-TQ-S MS/MS液质联用分析方法。检测结果显示添加了牛皮胶的混合样品中均可以检测到特征肽GEGGPQGPR。而实施例2中驴皮胶、马皮胶、骡皮胶中、羊皮胶、猪皮胶中均没有检测到相应的特征肽。因此该方法可以用来检测驴皮胶、骡皮胶、马皮胶、羊皮胶、猪皮胶中掺入的牛源性成分。
本发明不局限于上述实施方式，任何人应得知在本发明的启示下做出的与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。
本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
Claims (6)
1.一种皮类或胶类样品中牛源性成分的检测方法，样品为牛、驴、马、骡、羊和猪的皮类或胶类中药，以GEGGPQGPR序列为牛源性特征肽，采用nano-LC-ESI LTQ-Orbitrap MS/MS检测，检测条件如下：
色谱条件：样品经ReproSil-Pur C18-AQ Trap Column 脱盐富集，采用ReproSil-PurC18-AQ 纳升分析柱分离，纳升分离泵流速为300nL/min，流动相A：2%乙腈、98% 0.1%甲酸水溶液，流动相B：70%乙腈、30% 0.1%甲酸水溶液，洗脱梯度为：0-5min流动相A为300nL/min；5-20min流动相A降低到270nL/min；20-75min流动相A降低到204nL/min；75-95min流动相A降低到150nL/min；95-110min流动相A为0nL/min；110-120min流动相A为300nL/min；
质谱条件：LTQ-OrbitrapVelos Pro高分辨串联质谱，离子源为Nanospray Flex纳喷源，采用正离子模式进行分析，喷雾电压为2.1kv，离子传输毛细管温度为275℃，一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60000，m/z=400，采集范围为350-1650Th，二级质谱采用线性离子阱作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top20数据依赖模式进行母离子选择，采用CID模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为35%。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，皮类样品处理方法如下：称取皮类样品，利用丙酮进行脱脂处理，加入超纯水将其溶解，冷冻干燥后称取1.5mg加入去离子水配成蛋白样品，加入变性缓冲液，进行超滤置换为碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin 37℃温浴酶解，超滤管离心过滤收集滤液待测。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，变性缓冲液为0.5MTris-HCl，2.75 mMEDTA，0.5M Guanadine，pH8.0。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，胶类样品的处理方法如下：称取胶类样品溶于碳酸氢氨缓冲液，加入trypsin37℃温浴酶解；超滤管离心过滤收集滤液待测。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，利用三重四级杆液质联用质谱对GEGGPQGPR特征肽进行MRM监测，其监测参数为：一级离子m/z：427.76，二级子离子m/z：329.25、668.26，锥孔电压20V，裂解能量18eV。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，三重四级杆液质联用质谱的条件如下：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1%甲酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱：0～25分钟，A 95%→80%，B 5%→20%；25～40分钟，A 80%→50%，B 20%→50%，流速为0.3ml/min，电喷雾离子源：ESI+。
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