CN113501861A - 一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)样本采集；(2)预处理；(3)酶解；(4)高效液相色谱分离：将酶解液采用纳升流速的高效液相色谱系统EasynLC进行分离；(5)质谱鉴定：酶解液经色谱分离后用Q‑Exactive质谱仪进行质谱鉴定；(6)特征片段筛选：质谱鉴定结果的原始文件用Mascot2.2软件检索UniProt蛋白数据库，筛选得到耗牛胶原蛋白的特征片段。本发明通过高效液相色谱‑串联质谱技术对酶解的牦牛胶原蛋白进行分离鉴定，数据经Mascot2.2软件与UniProt蛋白数据库对比分析，筛选出实际样品中能检测到的牦牛胶原蛋白特征片段。鉴定的特征片段可用于检测牦牛源胶原蛋白的真实性与可靠性，为牦牛胶原蛋白成分监管方面提供有效技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种牦牛胶原蛋白特征片段的筛选方法，具体涉及一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法。
背景技术
胶原蛋白是广泛分布于动物组织中的一类白色、不透明、无支链的纤维型三螺旋结构蛋白，其降解产物胶原蛋白肽具有促进组织生长、修复损伤、保湿锁水、减轻色素等多种功效，且没有过敏蛋白质,能够被机体完全吸收，以广泛应用在功能食品、保健饮料、化妆品和医药等各方面。
近年来对于牦牛牛皮、牛骨等副产物的精细加工逐渐兴起，而胶原蛋白的制备是其中主要加工模式，造成市场上出现了明目繁多的牦牛胶原蛋白肽和牦牛胶原骨肽产品，对于其中成分是否来源于商品名中所标识的牦牛源性,以及其中是否含有牦牛胶原蛋白方面还缺乏有效的监督监管,且目前国内无相关检测方法报道。基于高通量和高分辨率质谱技术，结合蛋白质数据库分析不同物种蛋白质的方法简单、准确、可靠，近年来已成为蛋白质鉴定的主要方法。由于不同物种胶原蛋白的氨基酸序列存在差异，通过序列差异鉴别胶原蛋白是一种潜在的追溯其物种来源的方法。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种高分辨质谱鉴定牦牛胶原蛋白特征片段的方法及其应用。本发明通过高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对酶解的牦牛胶原蛋白进行分离鉴定，数据经Mascot2.2软件与UniProt蛋白数据库对比分析，筛选出实际样品中能检测到的牦牛胶原蛋白特征片段。鉴定的特征片段可用于检测牦牛源胶原蛋白的真实性与可靠性，为牦牛胶原蛋白成分监管方面提供有效技术支撑。
本发明通过下述技术方案实现。
一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)样本采集
收集耗牛副产物作为样本，之后将其分割成小块，于低温保存，备用；
(2)预处理
将牦牛副产物进行脱脂和除杂处理，之后用纯水清洗干净，备用；
(3)酶解
将预处理后的耗牛副产物放置于80～90℃热水中保温预变性处理2～4h，之后冷却至45～50℃，调节pH 8～9，加入碱性蛋白酶与丝氨酸蛋白酶的复合酶液酶解4～6h，高温灭酶活后获得酶解液；
(4)高效液相色谱分离
将酶解液采用纳升流速的高效液相色谱系统EasynLC进行分离；
(5)质谱鉴定
酶解液经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱鉴定；
(6)特征片段筛选
质谱鉴定结果的原始文件用Mascot2.2软件检索UniProt蛋白数据库，筛选得到耗牛胶原蛋白的特征片段。
作为具体技术方案，所述步骤(4)高效液相色谱分离的参数为，流动相A液为0.1％甲酸水溶液，流动相B液为0.1％甲酸乙腈水溶液，乙腈为84％；色谱柱以95％的A液平衡，样品由自动进样器上样到上样柱，经过分析柱分离，流速为300nL/min。
作为具体技术方案，所述步骤(4)高效液相色谱分离的参数中，择液相梯度为0.5小时液相梯度：0.00～20.00min，B液线性梯度从5％到35％；20.00～22.00min，B液线性梯度从35％到100％；22.00～30.00min，B液维持在100％。
作为具体技术方案，上样柱为Thermo Scientific Acclaim PepMap100,100μm*2cm,nanoViper C18。
作为具体技术方案，分析柱为Thermo scientific EASY column,10cm,ID75μm,3μm,C18-A2。
作为具体技术方案，所述步骤(5)质谱鉴定的参数为，分析时长为60min或120min或240min，检测方式为正离子，母离子扫描范围300～1800m/z，一级质谱分辨率为70000at200m/z，AGC target为3e6，一级Maximum IT为10ms，Number of scan ranges为1，Dynamicexclusion为40.0s；多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱，MS2 Activation Type为HCD，Isolation window为2m/z，二级质谱分辨率17500at 200m/z，Microscans为1，二级Maximum IT为60ms，Normalized Collision Energy为30eV，Underfill为0.1％。
作为具体技术方案，所述步骤(6)特征片段筛选具体为，质谱测试原始文件用Mascot2.2软件检索UniProt蛋白数据库，搜库的物种信息为牦牛，蛋白质组学工具3.1.6，并按得分≥20筛选序列；在搜库得到的一系列序列中，筛选出高丰度以及源于牦牛Ⅰ型牛胶原蛋白的肽段，最后将这些肽段在NCBI网站上进行blast分析，排除自身存在而未检测到的肽段或其他可能物种的肽段干扰，进一步确认其特异性，筛选出牦牛胶原蛋白特征片段。
作为具体技术方案，筛选出牦牛胶原蛋白特征片段为GADGAPGKDGVR、GEGGPQGPR、GEKGETGLR、GPAGERGAPGPAGPK，它们来源于牦牛胶原蛋白Ⅰ型的α1链和α2链，且目前均未见文献报道。
一种基于牦牛胶原蛋白特征片段快速鉴别耗牛胶原蛋白真伪的方法，其特征在于，采用上述筛选出的牦牛胶原蛋白特征片段GADGAPGKDGVR、GEGGPQGPR、GEKGETGLR、GPAGERGAPGPAGPK来鉴别耗牛胶原蛋白真伪。
作为具体技术方案，所述一种基于牦牛胶原蛋白特征片段快速鉴别耗牛胶原蛋白真伪的方法，其包括如下步骤：
(1)样品酶解
将待检测样品放置于80～90℃热水中保温预变性处理2～4h，之后冷却至45～50℃，调节pH 8～9，加入碱性蛋白酶与丝氨酸蛋白酶的复合酶液酶解4～6h，高温灭酶活后获得酶解液；
(2)质谱测定
采用质谱仪对步骤(1)获得的酶解液进行检测，获得其质谱数据；
(3)真伪判断
将步骤(2)测得的氨基酸序列的质谱数据与牦牛胶原蛋白特征片段GADGAPGKDGVR、GEGGPQGPR、GEKGETGLR、GPAGERGAPGPAGPK的质谱数据进行比对来鉴别耗牛胶原蛋白真伪。
本发明的有益效果：
本发明以牦牛牛皮为样本，制备的胶原蛋白酶解后通过高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定，经UniProt蛋白数据库对比分析及blast特异比对，筛选来源于Ⅰ型牛胶原蛋白的高丰度的GADGAPGKDGVR、GEGGPQGPR、GEKGETGLR、GPAGERGAPGPAGPK作为特征片段，4种特征片段未出现于鱼，羊，猪等胶原蛋白中，具有极强的特异性。本发明鉴定牦牛胶原蛋白肽的特征片段的方法简单、快速，且鉴定的特征片段可应用于牦牛源胶原蛋白产品来源的检测，为胶原蛋白的市场监督提供了高效、有力的技术支撑。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。
实施例1
牦牛胶原蛋白酶解样本的制备：
1、样本采集：取10g青海柴达木盆地新鲜牦牛皮为原料，剔除皮样品中的毛及肌肉组织后将其分割成小块，按料液质量比为1:3～7kg/kg加入质量浓度为3％～5％的纯碱浸泡6～8h，浸泡结束后清水洗净牦牛皮至中性，之后将牦牛皮按料液质量比为1:3～7kg/kg加入至质量浓度为3％～5％食盐中再次浸泡6～8h，浸泡结束后，清水洗净牦牛皮呈中性。
2、胶原蛋白的酶解：将前处理后的牦牛皮放置于80～90℃热水中保温预变性处理2～4h，之后冷却至45～50℃，调节pH 8～9，加入碱性蛋白酶与丝氨酸蛋白酶的复合酶液酶解4～6h，高温灭酶活后获得酶解液。
实施例2
高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定胶原蛋白酶解样品：
1、液相色谱条件：用纳升流速的HPLC液相系统EasynLC进行分离酶解样品；流动相：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)；分析柱：Thermoscientific EASY column,10cm,ID75μm,3μm,C18-A2；流速：300nL/min；进样体积：10μL；柱温：40℃。梯度洗脱条件：0.00-20.00min，B液线性梯度从5％到35％；20.00-22.00min，B液线性梯度从35％到100％；22.00-30.00min，B液维持在100％。
2、质谱条件：酶解样品经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。检测方式为正离子，母离子扫描范围300–1800m/z，一级质谱分辨率为70,000at 200m/z，AGCtarget为3e6，一级Maximum IT为10ms，Number of scan ranges为1，Dynamic exclusion为40.0s。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱(MS2 scan)，MS2 Activation Type为HCD，Isolation window为2m/z，二级质谱分辨率17,500at 200m/z，Microscans为1，二级Maximum IT为60ms，NormalizedCollision Energy为30eV，Underfill为0.1％。
实施例3
牦牛胶原蛋白特征片段的筛选及质谱数据测定：
1、筛选方法：质谱测试原始文件(raw file)用Mascot2.2软件检索UniProt蛋白数据库进行数据分析，得到鉴定的特征片段结果之后在美国国立生物技术信息中心(NCBI)网站上进行blast分析，进一步确认其特异性。
2、筛选结果：筛选的特征片段在鉴定结果中，为丰度高，可信度强的胶原蛋白酶解片段，且具有未出现在如鱼、羊、猪和鸡等其它常见物种胶原蛋白中的特异性，最终本发明确定GADGAPGKDGVR、GEGGPQGPR、GEKGETGLR、GPAGERGAPGPAGPK作为牦牛胶原蛋白的特征片段，可用于检测牦牛源胶原蛋白产品来源的真实性与可靠性。
3、采用LC-MS/MS质谱仪测定实施例1获得的酶解液，通过plable软件提取已鉴定的牦牛特征肽段GADGAPGKDGVR、GEGGPQGPR、GEKGETGLR、GPAGERGAPGPAGPK的二级质谱特征峰保留时间，质荷比以及电荷，结果见表1；
表1牦牛皮胶原蛋白的特征肽段的质谱数据
实施例4
基于牦牛胶原蛋白特征片段快速鉴别耗牛胶原蛋白真伪的方法，其包括如下步骤：
(1)样品酶解
将待鉴定的样品放置于80～90℃热水中保温预变性处理2～4h，之后冷却至45～50℃，调节pH 8～9，加入碱性蛋白酶与丝氨酸蛋白酶的复合酶液酶解4～6h，高温灭酶活后获得酶解液；
(2)质谱测序
采用LC-MS/MS质谱仪对步骤(1)获得的酶解液进行检测，获得其质谱数据；
(3)真伪判断
将步骤(2)测得的氨基酸序列的质谱数据与牦牛胶原蛋白特征片段GADGAPGKDGVR、GEGGPQGPR、GEKGETGLR、GPAGERGAPGPAGPK的质谱数据(即实施例3中表1的质谱数据)进行比对，若步骤(2)测得的质谱数据结果中：质荷比为m/z 427.71、m/z 316.16、m/z 367.18、m/z 440.23的二级质谱特征峰全部出现，则表示该样品为耗牛胶原蛋白；反之则表示该样品不是真正的耗牛胶原蛋白，即该样品不是来源于耗牛。
Claims (10)
1.一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)样本采集
收集耗牛副产物作为样本，之后将其分割成小块，于低温保存，备用；
(2)预处理
将牦牛副产物进行脱脂和除杂处理，之后用纯水清洗干净，备用；
(3)酶解
将预处理后的耗牛副产物放置于80～90℃热水中保温预变性处理2～4h，之后冷却至45～50℃，调节pH 8～9，加入碱性蛋白酶与丝氨酸蛋白酶的复合酶液酶解4～6h，高温灭酶活后获得酶解液；
(4)高效液相色谱分离
将酶解液采用纳升流速的高效液相色谱系统EasynLC进行分离；
(5)质谱鉴定
酶解液经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱鉴定；
(6)特征片段筛选
质谱鉴定结果的原始文件用Mascot2.2软件检索UniProt蛋白数据库，筛选得到耗牛胶原蛋白的特征片段。
2.如权利要求1所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于所述步骤(4)高效液相色谱分离的参数为，流动相A液为0.1％甲酸水溶液，流动相B液为0.1％甲酸乙腈水溶液，乙腈为84％；色谱柱以95％的A液平衡，样品由自动进样器上样到上样柱，经过分析柱分离，流速为300nL/min。
3.如权利要求1所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于所述步骤(4)高效液相色谱分离的参数中，择液相梯度为0.5小时液相梯度：0.00～20.00min，B液线性梯度从5％到35％；20.00～22.00min，B液线性梯度从35％到100％；22.00～30.00min，B液维持在100％。
4.如权利要求2所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于，上样柱为Thermo Scientific Acclaim PepMap100,100μm*2cm,nanoViper C18。
5.如权利要求2所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于，分析柱为Thermo scientific EASY column,10cm,ID75μm,3μm,C18-A2。
6.如权利要求1所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于所述步骤(5)质谱鉴定的参数为，分析时长为60min或120min或240min，检测方式为正离子，母离子扫描范围300～1800m/z，一级质谱分辨率为70000at 200m/z，AGC target为3e6，一级Maximum IT为10ms，Number of scan ranges为1，Dynamic exclusion为40.0s；多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集20个碎片图谱，MS2Activation Type为HCD，Isolation window为2m/z，二级质谱分辨率17500at 200m/z，Microscans为1，二级Maximum IT为60ms，Normalized Collision Energy为30eV，Underfill为0.1％。
7.如权利要求1所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于所述步骤(6)特征片段筛选具体为，质谱测试原始文件用Mascot2.2软件检索UniProt蛋白数据库，搜库的物种信息为牦牛，蛋白质组学工具3.1.6，并按得分≥20筛选序列；在搜库得到的一系列序列中，筛选出高丰度以及源于牦牛Ⅰ型牛胶原蛋白的肽段，最后将这些肽段在NCBI网站上进行blast分析，排除自身存在而未检测到的肽段或其他可能物种的肽段干扰，进一步确认其特异性，筛选出牦牛胶原蛋白特征片段。
8.如权利要求1所述的一种高分辨质谱筛选牦牛胶原蛋白特征片段的方法，其特征在于，筛选出牦牛胶原蛋白特征片段为GADGAPGKDGVR、GEGGPQGPR、GEKGETGLR、EGLRGPR。
9.一种基于牦牛胶原蛋白特征片段快速鉴别耗牛胶原蛋白真伪的方法，其特征在于，采用权利要求8筛选出的牦牛胶原蛋白特征片段GADGAPGKDGVR、GEGGPQGPR、GEKGETGLR、EGLRGPR来鉴别耗牛胶原蛋白真伪。
10.如权利要求9所述的一种基于牦牛胶原蛋白特征片段快速鉴别耗牛胶原蛋白真伪的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品酶解
将待检测样品放置于80～90℃热水中保温预变性处理2～4h，之后冷却至45～50℃，调节pH 8～9，加入碱性蛋白酶与丝氨酸蛋白酶的复合酶液酶解4～6h，高温灭酶活后获得酶解液；
(2)质谱测定
采用质谱仪对步骤(1)获得的酶解液进行检测，获得其质谱数据；
(3)真伪判断
将步骤(2)测得的氨基酸序列的质谱数据与牦牛胶原蛋白特征片段GADGAPGKDGVR、GEGGPQGPR、GEKGETGLR、EGLRGPR的质谱数据进行比对来鉴别耗牛胶原蛋白真伪。
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