CN111474281B

CN111474281B - 一种利用特征标识肽段鉴别三文鱼种类的方法

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Publication number: CN111474281B
Application number: CN202010460121.XA
Authority: CN
Inventors: 陈颖; 张九凯; 马聪聪; 韩建勋; 邢冉冉
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2040-05-27
Also published as: CN111474281A

Abstract

本发明公开了一种利用特征标识肽段鉴别三文鱼种类的方法。所述特征标识肽段即多肽标志物包括大西洋鲑、大马哈鱼和虹鳟所独有的特征肽段，其中大西洋鲑的特征肽氨基酸序列为AADTFNFK、YIIESVGNIR、AAVPSGASTGIHEALELR和NGLMIAEIEELR，大马哈鱼特征肽的氨基酸序列为LLATLYPAAPPEDK，虹鳟特征肽序列为AADSFNFK和ISALDLSGDQAALMEMLK。本发明通过高效液相色谱‑质谱联用技术检测，找到的专属性特征多肽，实现了对常见三文鱼种类的鉴别，为准确区分大西洋鲑及其近源物种大马哈鱼和虹鳟提供了一定的理论依据和技术支持。

Description

一种利用特征标识肽段鉴别三文鱼种类的方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，特别是涉及一种用于检测三文鱼种类（大西洋鲑、大马哈鱼和虹鳟）的特征肽组合及方法。

背景技术

三文鱼（Salmon）是鲑科鱼类的统称，属于大中型冷水域洄游鱼类，主要分布在太平洋北部及大西洋和北冰洋交界水域，共包括3个亚科、7个属，约67种鱼。市场上常见的红肉三文鱼有大西洋鲑（Salmo salar）、大马哈鱼（Oncorhynchus keta）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）等，其中大西洋鲑肌肉组织细腻，肉质鲜美且含有丰富的蛋白质和脂肪酸，近年来逐渐被称作生食料理店的上等原料。与大西洋鲑相比，太平洋鲑属的淡水虹鳟和大马哈鱼肉质略微粗糙，多用于加工成罐头等产品，其市场价值也比大西洋鲑低。但由于上述3个物种肌肉均为橙白相间，凭借肉眼很难进行准确区分。因此一些商家用低值的虹鳟和大马哈鱼冒充高值海产品大西洋鲑进行销售。这种行为严重扰乱了水产市场的秩序，侵犯了消费者的合法权益，因此急需建立准确有效的区分不同三文鱼物种的方法。

传统的肉类鉴别方法为核酸检测技术和光谱等智能无损检测技术。随着质谱技术的发展，基于质谱技术的蛋白质组学技术由于其高选择性、高分辨能力、高通量等优点，在鉴伪方面发挥越来越重要的作用。该技术通过对物种蛋白质或者肽段的分离和鉴定，找到表明物种身份的特征标志物，来确保物种的真实属性等。因此越来越多的学者从蛋白质角度出发，寻找鉴别物种的新方法。物种特异性肽段标志物的找寻是在对样品全蛋白进行质谱分析后的基础上对质谱数据进行转化和进一步筛选，找到每个物种的特征肽段，以此为该物种的身份标志物进行物种鉴定的方法。从蛋白角度入手，寻找能表征各个物种身份的稳定特征肽段，可以实现物种的精准鉴别。

目前国内外尚无利用质谱技术对三文鱼不同物种进行准确区分的方法。

发明内容

本发明旨在于提供一种专属性特征肽段及用其鉴别常见三文鱼种类的方法，建立了从多肽水平对不同三文鱼种类进行鉴别的技术，填补了国内外常见三文鱼种类鉴别的空白。

本发明提供了一种用于检测三文鱼种类的特征多肽组合，包括大西洋鲑（Salmo salar）、大马哈鱼（Oncorhynchus keta）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的特征多肽，其中：

（1）大西洋鲑的特征多肽氨基酸序列为：AADTFNFK（SEQ ID NO.1），YIIESVGNIR（SEQ ID NO.2），AAVPSGASTGIHEALELR（SEQ ID NO.3），NGLMIAEIEELR（SEQ ID NO.4）；

（2）大马哈鱼的特征多肽氨基酸序列为：LLATLYPAAPPEDK（SEQ ID NO.5）；

（3）虹鳟的特征多肽氨基酸序列为：AADSFNFK（SEQ ID NO.6），ISALDLSGDQAALMEMLK（SEQ ID NO.7）。

在一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述组(1)—(3)特征多肽的全部三组。

在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述组(1)—(3)特征多肽中的任意二组，即，所述多肽标志物包括：所述组(1)和组(2)，或组(1)和组(3)，或组(2)和组(3)的特征多肽；

在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述组(1)—(3)特征多肽中的任意一组，即，所述多肽标志物包括：所述组(1)或(2)或(3)的特征多肽。

优选的，所述SEQ ID NO .1～7所示多肽的质荷比(m/z)分别为：

SEQ ID NO .1所示特征多肽的质荷比为457.2；

SEQ ID NO .2所示特征多肽的质荷比为582.3；

SEQ ID NO .3所示特征多肽的质荷比为593.6；

SEQ ID NO .4所示特征多肽的质荷比为694.3；

SEQ ID NO .5所示特征多肽的质荷比为749.9；

SEQ ID NO .6所示特征多肽的质荷比为450.2；

SEQ ID NO .7所示特征多肽的质荷比为953.4；

具体地，所述特征多肽为SEQ ID NO .1—7所示特征多肽中的至少一个。

当所述质谱结果出现与SEQ ID NO .1和/或SEQ ID NO .2和/或SEQ ID NO .3和/或SEQ ID NO .4所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为自大西洋鲑（Salmo salar）或含有自大西洋鲑（Salmo salar）蛋白；

当所述质谱结果出现与SEQ ID NO .5所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为大马哈鱼（Oncorhynchus keta）或含有大马哈鱼（Oncorhynchus keta）蛋白；

当所述质谱结果出现与SEQ ID NO .6和/或SEQ ID NO .7所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为虹鳟（Oncorhynchus mykiss）或含有虹鳟（Oncorhynchus mykiss）蛋白。

优选的，所述的样品前处理包括如下步骤：

（1）称取研磨成肉糜状态的三文鱼样品，加入蛋白提取液（7M尿素，2M硫脲）提取蛋白，高速低温离心，收集上清液；

（2）取DTT加入到所述上清液中，37℃反应1小时；

（3）取IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应15min；

（4）采用10K滤膜超滤离心，使用碳酸氢铵反复冲洗滤膜并超滤离心，收集蛋白溶液；

（5）使用Trypsin酶溶液加入到所述蛋白溶液中37℃酶解6小时；

（6）在10K滤膜上层加入碳酸氢铵，超滤离心，收集下层的肽段滤液，待上机检测。

优选的，所述的质谱法检测为：采用AB SCIEX Triple TOF®6600检测：流动相A1：0 .1％甲酸-乙腈，流动相B1：0 .1％甲酸-水；流速：0 .25mL/min；第一梯度洗脱：0～0.01min，2％B1；0.01～0.5min，2～8％B1；0.5～25min，8～22％B1；25～31min，22～35％B1；31～33min，35～80％B1；33～39min，80％B1；39～39.5min，80～2％B1；39.5～44min，2％B1。

TOF扫描范围：350-1500Da，正离子反应模式，GS1：50，GS2：50，Curtain Gas：35，ISVF：5500V，TEM：550℃，DP：80，CE：10。

采用AB SCIEX 5500三重四级杆检测：流动相 A2：0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流动相B2：0.1%甲酸和2%水的乙腈溶液，流速：0 .6mL/min；第二梯度洗脱：0～0.1 min，2 %B2；0.1～0.5 min，2 %B～8 %B2；0.5～25 min，8～22 %B2；25～31 min，22～35 %B2；31～33 min，35～80 %B2；33～36 min，80 %B2；36～36.5 min，80～2 %B2；36.5～39.9 min，2 %B2。

电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子源温度为600℃，离子源气体1:60psi；离子源气体2:50psi；DP:100v，预定窗口80s，循环时间2s。

附图说明

图1-A为大西洋鲑特异性多肽质谱图，即SEQ ID NO .1～4。

图1-B为大马哈鱼特异性多肽质谱图，即SEQ ID NO .5。

图1-C为虹鳟特异性多肽质谱图，即SEQ ID NO .6～7。

图1中，纵坐标均为Intensity (峰强度)，单位cps (每秒的计数) ；横坐标均为Retention Time(保留时间)，单位为min(分钟)。

具体实施方式

实施例1：3种不同三文鱼品种的专属性特征肽段的获得

本申请利用液质分析平台(UHPLC-HRMS和UHPLC-MS/MS)，对来自大西洋鲑、大马哈鱼和虹鳟3种不同品种的三文鱼进行蛋白/肽组学分析，结合生物信息学方法对产生的质谱数据进行挖掘分析，筛选出用于3种市场常售三文鱼种类鉴别的标志肽段(IdentifyingSignature Peptides，ISPs)7条。

1、基于IDA数据的蛋白/多肽鉴定分析：

获取通过蛋白检索，共获得来自大西洋鲑、大马哈鱼和虹鳟3个物种的蛋白信息140295条。其中，大西洋鲑（Salmo salar）是目前Uniprot蛋白组数据库中“Salmo”(鲑属)中信息最多的物种，多达89081条，而大马哈鱼（Oncorhynchus keta）信息仅为360条，有超过200倍的差距；虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的蛋白条目数为50854条。可见，现有技术对不同三文鱼物种研究的偏重性不同，除大西洋鲑（Salmo salar）外，其他三文鱼物种蛋白组数据库的蛋白信息较为匮乏。

本申请涉及的3种三文鱼样本用其所属物种为关键词，在Uniprot蛋白组数据库中分别进行检索的结果如表1所示。

表1、3种三文鱼样本所属物种Uniprot蛋白数据检索结果

选择合适的分析策略和分析方法，有助于标志肽段的有效发现：相同蛋白在不同物种间因氨基酸序列差异而产生物种特异性肽段(Species-specific peptides, SSPs)，这是用做物种鉴定的最佳ISPs。

表2所示3种三文鱼样本进行蛋白/多肽的鉴定分析，最终从质谱谱图数据中鉴定到在95％的置信水平上的多肽条目数16246条，蛋白条目数968条。将3种三文鱼样本以相同蛋白组数据库分别独立进行蛋白/多肽鉴定，然后通过蛋白鉴定的韦恩分析结果，得出各物种样本的独有肽段数目，结果见表2。

表2、3种三文鱼样本单独搜库蛋白/多肽鉴定结果(95％置信水平)

序号	种类	蛋白条目数	多肽条目数	独有肽段条目数
					1	大西洋鲑	271	4300	752
2	大马哈	435	6676	290
					3	虹鳟	262	5270	423

2、ISPs的特异性筛选分析

对表2所示的独有肽段进行ISPs检测特异性筛选，物种特异性肽段(SSPs)是天然的鉴别标志肽段(ISPs)，比较3个物种肌肉中鉴定的蛋白质和肽段列表，找到只在大西洋鲑、大马哈或虹鳟样品中的特征肽段，进一步筛选出响应高、得分>20、氨基酸个数6~20、可信度>95%的肽段作为预选特征肽段，这些特征肽段可作为大西洋鲑、大马哈或虹鳟的特异标志物。另外，肽段的稳定性也会对定性结果造成影响。因此，在选取特征肽段时，优先选择不含漏切位点、不含甲硫氨酸、不含NXS/T的糖基化基序、不成环、无氧化、没有任何蛋白质修饰的肽段，从而确保特征肽段的稳定性。同时，为了进一步确认肽段的特异性，将筛选到的ISPs进行BLAST分析，即这些特异性肽段的氨基酸序列不能与其他物种的氨基酸序列100%匹配。

对分属3种三文鱼样本的1465条独有蛋白逐一进行ISPs的特异性筛选，共计筛选出26条备选ISPs肽段。

在实际检测时，筛选出的26条备选ISPs肽段并不能全部作为ISPs进行使用，实际操作时，发现部分备选ISPs肽段不具备鉴定特异性，或者在低分辨质谱中，存在小肽的交叉串扰(Crosstalk)现象；或者在在样本基质中含有与肽的前体离子相同质荷比的肽，这些基质中的肽可以产生部分相同的传输离子对而导致选定的肽失去鉴别特异性。本申请采用超高效液相色谱四极杆/线性离子阱串联质谱建立了MRM-IDA-EPI检测方法，在众多的离子对中，选择各肽段响应最高的5至6对母离子和子离子，作为MRM的特异性验证离子。然后根据同一肽的MRM离子对具有相同的保留时间，进一步判断潜在特征肽段的特异性。多离子对及保留时间的确认有效消除了假阳性的MRM峰，增加了检测结果的准确性。另外，由于生长环境和饲养方式的差异，相同物种之间的蛋白也会出现差异，因此本研究选取多个不同产地的大西洋鲑、大马哈鱼和虹鳟样品，对筛选出来的3个物种的特征肽段进行了验证。

经过检测、优化得出可用于3种三文鱼样本鉴别分析的ISPs肽段共计7条，ISPs序列鉴定可信度均在99％以上。ISPs的肽链长度范围为8～18氨基酸残基。7条ISPs详细信息如下：

（1）大西洋鲑（Salmo salar）特异性多肽

经过质谱分析，所述大西洋鲑独有的多肽SEQ ID NO .1～4在大西洋鲑中确实存在，且峰形好，强度高，在大马哈、虹鳟中均不存在。经过序列比对，SEQ ID NO .1：AADTFNFK来自于大西洋鲑（Salmo salar）中的蛋白Parvalbumin beta-1 (UniProtKB - E0WD98)，SEQ ID NO .2：YIIESVGNIR来源于大西洋鲑（Salmo salar）中的蛋白myosin-bindingprotein C, fast-type-like（UniProtKB - A0A1S3NGD5），SEQ ID NO .3：AAVPSGASTGIHEALELR来源于大西洋鲑（Salmo salar）中的蛋白enolase 3-1（UniProtKB -A0A1S2X522），SEQ ID NO .4：NGLMIAEIEELR来源于大西洋鲑（Salmo salar）中的蛋白A0A1S3M1A4（UniProtKB - A0A1S3M1A4）。

图1-A是大西洋鲑特异性多肽在大西洋鲑中的色谱图，SEQ ID NO .1～4的质荷比(m/z)分别为457.2，582.3，593.6，694.3。

（2）大马哈鱼（Oncorhynchus keta）特异性多肽

经过质谱分析，所述大马哈鱼独有的多肽SEQ ID NO .5在大马哈鱼中确实存在，且峰形好，强度高，在大西洋鲑、虹鳟中均不存在。经过序列比对，SEQ ID NO .5：LLATLYPAAPPEDK来自于大马哈鱼（Oncorhynchus keta）中的蛋白Myosin heavy chain(UniProtKB - Q8JIP5)。

图1-B是大马哈鱼特异性多肽在大马哈鱼中的色谱图，SEQ ID NO .5的质荷比(m/ z)为749.9。

（3）虹鳟（Oncorhynchus mykiss）特异性多肽

经过质谱分析，所述虹鳟独有的多肽SEQ ID NO .6～7在虹鳟中确实存在，且峰形好，强度高，在大西洋鲑、大马哈中均不存在。经过序列比对，SEQ ID NO .6：AADSFNFK来自于虹鳟（Oncorhynchus mykiss）中的蛋白Parvalbumin beta-1 (UniProtKB - E0WDA4)。SEQ ID NO .7：ISALDLSGDQAALMEMLK来自于虹鳟（Oncorhynchus mykiss）中的蛋白Troponin I (UniProtKB - B2DBF2)。

图1-C是虹鳟特异性多肽在虹鳟中的色谱图，SEQ ID NO . 6～7的质荷比(m/z)分别为450.2，953.4。

本申请通过MRM筛选的7条ISPs在峰形、响应和碎片离子一致性等方面都为MRM筛选分析提供了适宜液质分析的检测特性。其质谱参数见表3.

表3、7条ISPs质谱参数

本申请筛选出的7条ISPs对3种三文鱼样本均具有明显的鉴别特异性，在相关的保留时间窗口内各ISPs均可特异性指征相关三文鱼样本，且相关ISPs的MRM离子传输离子对在色谱峰强度、峰形、基质干扰、碎片离子数目等方面也满足进行日常常规分析的要求。

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 一种利用特征标识肽段鉴别三文鱼种类的方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 三文鱼(Salmo salar)

<400> 2

Ala Ala Asp Thr Phe Asn Phe Lys

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 三文鱼(Salmo salar)

<400> 2

Tyr Ile Ile Glu Ser Val Gly Asn Ile Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 18

<212> PRT

<213> 三文鱼(Salmo salar)

<400> 3

Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile His Glu Ala Leu Glu

1 5 10 15

Leu Arg

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 三文鱼(Salmo salar)

<400> 4

Asn Gly Leu Met Ile Ala Glu Ile Glu Glu Leu Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 14

<212> PRT

<213> 大马哈鱼(Oncorhynchus keta)

<400> 5

Leu Leu Ala Thr Leu Tyr Pro Ala Ala Pro Pro Glu Asp Lys

1 5 10

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 虹鳟(Oncorhynchus mykiss)

<400> 6

Ala Ala Asp Ser Phe Asn Phe Lys

1 5

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 虹鳟(Oncorhynchus mykiss)

<400> 7

Ile Ser Ala Leu Asp Leu Ser Gly Asp Gln Ala Ala Leu Met Glu Met

1 5 10 15

Leu Lys

Claims

1.一种用于检测三文鱼种类的特征多肽组合物，其特征在于，包括大西洋鲑（Salmosalar）、大马哈鱼（Oncorhynchus keta）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的特征多肽，其中：

（1）大西洋鲑区分于大马哈鱼和虹鳟的特征多肽氨基酸序列为：SEQ ID NO.1：AADTFNFK，SEQ ID NO.2：YIIESVGNIR，SEQ ID NO.3：AAVPSGASTGIHEALELR，SEQ ID NO.4：NGLMIAEIEELR；

（2）大马哈鱼的特征多肽氨基酸序列为：SEQ ID NO.5：LLATLYPAAPPEDK；

（3）虹鳟的特征多肽氨基酸序列为：SEQ ID NO.6：AADSFNFK，SEQ ID NO.7：ISALDLSGDQAALMEMLK。

2.根据权利要求1所述的特征多肽组合物，其特征在于：

SEQ ID NO .1所示特征多肽的质荷比（m/z）为457.2；

SEQ ID NO .2所示特征多肽的质荷比（m/z）为582.3；

SEQ ID NO .3所示特征多肽的质荷比（m/z）为593.6；

SEQ ID NO .4所示特征多肽的质荷比（m/z）为694.3；

SEQ ID NO .5所示特征多肽的质荷比（m/z）为749.9；

SEQ ID NO .6所示特征多肽的质荷比（m/z）为450.2；

SEQ ID NO .7所示特征多肽的质荷比（m/z）为953.4。

3.一种检测三文鱼种类的方法，其特征在于：

（1）当质谱结果出现与SEQ ID NO .2和/或SEQ ID NO .4所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为大西洋鲑（Salmo salar）或含有大西洋鲑（Salmo salar）蛋白；

（2）当质谱结果出现与SEQ ID NO .5所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为大马哈鱼（Oncorhynchus keta）或含有大马哈鱼（Oncorhynchus keta）蛋白；

（3）当质谱结果出现与SEQ ID NO .7所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为虹鳟（Oncorhynchus mykiss）或含有虹鳟（Oncorhynchus mykiss）蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，样品前处理包括如下步骤：

（1）称取研磨成肉糜状态的三文鱼样品，加入7M尿素和2M硫脲的蛋白提取液提取蛋白，高速低温离心，收集上清液；

（2）取DTT加入到上清液中，37℃反应1小时；

（5）使用Trypsin酶溶液加入到蛋白溶液中37℃酶解6小时；

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，高效液相色谱条件为：色谱柱：XbridgePeptide BEH C18色谱柱，2.1mm×150mm，3.5μm，300Å；流动相A：0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流动相B：0.1%甲酸和2%水的乙腈溶液；进样量：10μL；流速：0.6mL/min；洗脱程序：0-0.1min，2%B；0.1-0.5min，2%B→8%B；0.5-25min，8%B→22%B；25-31min，22%B→35%B；31-33min，35%B→80%B；33-36min，80%B；36-36.5min，80%B→2%B；36.5-39.9min，2%B。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，质谱条件为：电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子源温度为600℃，离子源气体1:60psi；离子源气体2:50psi；DP:100v，预定窗口80s，循环时间2s。