CN110105440B - 一种专属性特征肽段及用其鉴别海参种类的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种专属性特征肽段及用其鉴别海参种类的方法。所述专属性特征肽段即多肽标志物包括海地瓜、仿刺参、加州拟刺参、梅花参、大西洋瓜参、黑海参、墨西哥参所独有的特征肽段；其序列如SEQ ID NO.1—13所示。本发明建立了从多肽水平对不同海参种类进行鉴别的技术，填补了国内外海参种类鉴别的空白。

Description

一种专属性特征肽段及用其鉴别海参种类的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种专属性特征肽段及用其鉴别海参种类的方法。
背景技术
海参富含酸性黏多糖，对人体有免疫调节剂、抗凝血、控制血糖和降血脂等功效。故此，海参享有“营养宝库”之美誉，现代人把海参誉为“海味八珍之首”。市场上海参种类繁多，不同海参因其营养价值、口感等不同而价格相差巨大，刺参是海参的一种，是中国20多种食用海参中质量最好的一种。在海参家族中，品质比较好的是山东半岛和辽东半岛的刺参。据《本草纲目拾遗》中记载，“辽东产之海参，体色黑褐，肉嫩多刺，称之辽参或海参，品质极佳，且药性甘温无毒，具有补肾阴，生脉血，治下痢及溃疡等功效”。因其药性温补，足敌人参，故名海参。刺参营养十分丰富，不仅含有较高的蛋白质，多种人体所必需的氨基酸、微量元素和多种维生素，而且还含有能治病、防癌的药用皂甙和海参多糖。
不同品种的海参相比较，有的粘多糖含量高，对心脑血管有好处；有的皂甙含量高，对抗癌有益。海参同人参一样，如果皂甙含量高，则药用价值高，但可能味道不好；而有的海参蛋白质含量高，如茄参和刺参，可以大量用在宾馆和家庭餐桌上，对蛋白质缺乏、营养不良的人群提供身体所需的营养物质。
由于目前缺乏特别有效的识别海参品种的方法，鉴别海参种类的方法还只是靠传统的外观观察，缺乏技术水平的支持，导致不少不良商人以次充好、以假充真欺骗消费者，因此需要一种高效准确的鉴定海参的方法。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种专属性特征肽段及用其鉴别海参种类的方法。本发明对海地瓜(Acaudina molpadioides)、仿刺参(Apostichopusjaponicus)、加州拟刺参(Parastichopus californicus)、梅花参(Thelenota ananas)、大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)、黑海参(Holothuria atra)、墨西哥参(HolothuriaMexicana)中的肽段进行了研究，建立了从多肽水平对不同海参种类进行鉴别的技术，填补了国内外海参种类鉴别的空白。
首先，本发明提供了一种多肽标志物，其包括如下组(1)—组(7)特征多肽的七组、任意六组、任意五组、任意四组、任意三组、任意二组或任意一组的特征多肽：
组(1)海地瓜(Acaudina molpadioides)的特征多肽，为SEQ ID NO.1和/或SEQ IDNO.2所示多肽；
组(2)仿刺参(Apostichopus japonicus)的特征多肽，为SEQ ID NO.3和/或SEQID NO.4所示多肽；
组(3)加州拟刺参(Parastichopus californicus)的特征多肽，为SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示多肽；
组(4)梅花参(Thelenota ananas)的特征多肽，为SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8和/或SEQ ID NO.9所示多肽；
组(5)大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)的特征多肽，为SEQ ID NO.10和/或SEQID NO.11所示多肽；
组(6)黑海参(Holothuria atra)的特征多肽，为SEQ ID NO.12所示多肽；
组(7)墨西哥参(Holothuria Mexicana)的特征多肽，为SEQ ID NO.13所示多肽。
所述多肽标志物中的所述组(1)—组(7)特征多肽分别为海地瓜、仿刺参、加州拟刺参、梅花参、大西洋瓜参、黑海参、墨西哥参所独有的。
在一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述组(1)—(7)特征多肽的全部七组。
在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述组(1)—(7)特征多肽中的任意六组，即，所述多肽标志物包括：所述组(1)—(6)，或(1)—(5)和(7)，或(1)—(4)和(6)—(7)，或(1)—(3)和(5)—(7)，或(1)—(2)和(4)—(7)，或(1)和(3)—(7)，或(2)—(7)的特征多肽；
在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述组(1)—(7)特征多肽中的任意五组，即，所述多肽标志物包括：所述组(1)—(5)、或(1)—(4)和(6)、或(1)—(4)和(7)、或(1)—(3)和(5)—(6)、或(1)—(3)和(6)—(7)、或(1)—(3)和(5)和(7)、或(1)—(2)和(4)—(6)、或(1)—(2)和(4)—(5)和(7)、或(1)—(2)和(4)和(6)—(7)、或(1)—(2)和(5)—(7)、或(1)和(3)—(6)、或(1)和(3)—(5)和(7)、或(1)和(3)—(4)和(6)—(7)、或(1)和(3)和(5)—(7)、或(1)和(4)—(7)、或(2)—(6)、或(2)—(5)和(7)、或(2)—(4)和(6)—(7)、或(2)—(3)和(5)—(7)、或(2)和(4)—(7)、或(3)—(7)的特征多肽；
在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述组(1)—(7)特征多肽中的任意四组，即，所述多肽标志物包括：所述组(1)—(4)、或(1)—(3)和(5)、或(1)—(3)和(6)、或(1)—(3)和(7)、或(1)—(2)和(4)—(5)、或(1)—(2)和(4)和(6)、或(1)—(2)和(4)和(7)、或(1)—(2)和(5)和(6)、或(1)—(2)和(5)和(7)、或(1)—(2)和(6)—(7)、或(1)和(3)—(5)、或(1)和(3)—(4)和(6)、或(1)和(3)—(4)和(7)、或(1)和(3)和(5)—(6)、或(1)和(3)和(5)和(7)、或(1)和(3)和(6)—(7)、或(1)和(4)—(6)、或(1)和(4)—(5)和(7)、或(1)和(4)和(6)—(7)、或(1)和(5)—(7)、或(2)—(5)、或(2)—(4)和(6)、或(2)—(4)和(7)、或(2)—(3)和(5)—(6)、或(2)—(3)和(5)和(7)、或(2)—(3)和(6)—(7)、或(2)和(4)—(6)、或(2)和(4)—(5)和(7)、或(2)和(4)和(6)—(7)、或(2)和(5)—(7)、或(3)—(6)、或(3)—(5)和(7)、或(3)—(4)和(6)—(7)、或(3)和(5)—(7)、或(4)—(7)的特征多肽；
在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述(1)—(7)特征多肽中的任意三组，即，所述多肽标志物包括：所述组(1)—(3)、或(1)—(2)和(4)、或(1)—(2)和(5)、或(1)—(2)和(6)、或(1)—(2)和(7)、或(1)和(3)—(4)、或(1)和(3)和(5)、或(1)和(3)和(6)、或(1)和(3)和(7)、或(1)和(4)—(5)、或(1)和(4)和(6)、或(1)和(4)和(7)、或(1)和(5)和(6)、或(1)和(5)和(7)、或(1)和(6)—(7)、或(2)—(4)、或(2)—(3)和(5)、或(2)—(3)和(6)、或(2)—(3)和(7)、或(2)和(4)—(5)、或(2)和(4)和(6)、或(2)和(4)和(7)、或(2)和(5)—(6)、或(2)和(5)和(7)、或(2)和(6)—(7)、或(3)—(5)、或(3)—(4)和(6)、或(3)—(4)和(7)、或(3)和(5)—(6)、或(3)和(5)和(7)、或(3)和(6)—(7)、或(4)—(6)、或(4)—(5)和(7)、或(4)和(6)和(7)、或(5)—(7)的特征多肽；
在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述(1)—(7)特征多肽中的任意两组，即，所述多肽标志物包括：所述组(1)—(2)、或(1)和(3)、或(1)和(4)、或(1)和(5)、或(1)和(6)、或(1)和(7)、或(2)和(3)、或(2)和(4)、或(2)和(5)、或(2)和(6)、或(2)和(7)、或(3)和(4)、或(3)和(5)、或(3)和(6)、或(3)和(7)、或(4)和(5)、或(4)和(6)、或(4)和(7)、或(5)和(6)、或(5)和(7)、或(6)和(7)的特征多肽；
在另一种实施方式中，所述多肽标志物包括所述(1)—(7)特征多肽中的任意一组，即，所述多肽标志物包括所述组(1)或(2)或(3)或(4)或(5)或(6)或(7)的特征多肽。
优选的，所述SEQ ID NO.1～13所示多肽的质荷比(m/z)分别为：
SEQ ID NO.1所示特征多肽的质荷比为408.7；
SEQ ID NO.2所示特征多肽的质荷比为522.3；
SEQ ID NO.3所示特征多肽的质荷比为482.7；
SEQ ID NO.4所示特征多肽的质荷比为587.9；
SEQ ID NO.5所示特征多肽的质荷比为742.4；
SEQ ID NO.6所示特征多肽的质荷比为470.2；
SEQ ID NO.7所示特征多肽的质荷比为572.3；
SEQ ID NO.8所示特征多肽的质荷比为455.3；
SEQ ID NO.9所示特征多肽的质荷比为657.9；
SEQ ID NO.10所示特征多肽的质荷比为616.8；
SEQ ID NO.11所示特征多肽的质荷比为629.8；
SEQ ID NO.12所示特征多肽的质荷比为564.3；
SEQ ID NO.13所示特征多肽的质荷比为504.2。
另一方面，本发明还提供了所述多肽标志物在检测海参种类中的应用。
另一方面，本发明还提供了所述多肽标志物在制备用于鉴别海参种类的试剂/试剂盒中的应用。
在上述应用中，优选地，所述海参种类选自海地瓜(Acaudina molpadioides)、仿刺参(Apostichopus japonicus)、加州拟刺参(Parastichopus californicus)、梅花参(Thelenota ananas)、大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)、黑海参(Holothuria atra)、墨西哥参(Holothuria Mexicana)中的一种或任意几种。
另一方面，本发明还提供用于鉴别海参种类的试剂或试剂盒，所述的试剂或试剂盒中包含以上任一所述的多肽标志物。
另一方面，本发明还提供一种检测海参种类的方法，所述方法包括如下步骤：S1、对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽；
S2、通过质谱法检验所述待测多肽中的多肽成分，分析待测样本的质谱结果对比所述多肽标志物的质谱图，当质谱结果中出现所述组(1)—(7)中任一所述特征多肽的质谱图时，即可判断该待测样本为该特征多肽相应种类的海参样本或含有相应种类海参蛋白。
具体地，所述特征多肽为SEQ ID NO.1—13所示特征多肽中的至少一个，
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为海地瓜(Acaudina molpadioides)或含有海地瓜(Acaudinamolpadioides)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为仿刺参(Apostichopus japonicus)或含有仿刺参(Apostichopus japonicus)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为加州拟刺参(Parastichopus californicus)或含有加州拟刺参(Parastichopus californicus)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8和/或SEQ ID NO.9所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为梅花参(Thelenota ananas)或含有梅花参(Thelenota ananas)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.10和/或SEQ ID NO.11所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)或含有大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.12所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为黑海参(Holothuria atra)或含有黑海参(Holothuria atra)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.13所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为墨西哥参(Holothuria Mexicana)或含有墨西哥参(Holothuria Mexicana)蛋白。
优选的，所述的质谱前处理包括如下步骤：
(1)称取均质成粉末状态的海参样品，加入蛋白提取液提取蛋白，高速低温离心，收集上清液；
(2)取DTT加入到所述上清液中，37℃反应1小时；
(3)取IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；
(4)采用10K滤膜超滤离心，使用碳酸氢铵反复冲洗滤膜并超滤离心，收集蛋白溶液；
(5)使用Trypsin酶溶液加入到所述蛋白溶液中37℃酶解16-18小时；
(6)在10K滤膜上层加入碳酸氢铵，超滤离心，收集下层的肽段滤液，待上机检测；
所述蛋白提取液配方为：8M尿素，50mM NH4HCO3。
优选的，所述的质谱法检测为：采用AB SCIEX
Figure BDA0002015799490000071
5600检测：
流动相A1：0.1％甲酸-乙腈，流动相B1：0.1％甲酸-水，
流速：0.25mL/min，
第一梯度洗脱：0～2min，5％A1；2～27min，5～30％A1；27～37min，30～45％A1；37～39min，45～80％A1；39～42.5min，80～5％A1；42.5～46min，5％A1，
TOF扫描范围：350-1500Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10；
采用AB SCIEX 5500三重四级杆检测：
流动相A2：0.1％甲酸-水，流动相B2：0.1％甲酸-乙腈，
流速：0.3mL/min，
第二梯度洗脱：0～0.2min，95％A2；0.2～8min，95～55％A2；8～9min，55～50％A2；9～10.1min，50～95％A2；10.1～13min，95％A2，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
附图说明
图1为海地瓜特异性多肽色谱图。
图2为仿刺参特异性多肽色谱图。
图3为加州拟刺参特异性多肽色谱图。
图4和图5为梅花参特异性多肽色谱图。
图6为大西洋瓜参特异性多肽色谱图。
图7为黑海参特异性多肽色谱图。
图8为墨西哥参特异性多肽色谱图。
图9为市购样本1的色谱图。
图10为市购样本2的色谱图。
图1—10中，纵坐标为Intensity(峰强度)，单位cps(每秒的计数)；横坐标为Retention Time(保留时间)，单位为min(分钟)。
具体实施方式
实施例1、7种不同海参参种的专属性特征肽段的获得
本申请利用液质分析平台(UHPLC-HRMS和UHPLC-MS/MS)，对来自7种不同参种的商品化干制海参进行蛋白/肽组学分析，结合生物信息学方法对产生的质谱数据进行挖掘分析，筛选出用于7种商品化海参鉴别的标志肽段(Identifying Signature Peptides，ISPs)13条。
1、基于DDA数据的蛋白/多肽鉴定分析
获取通过蛋白检索，共获得来自374个海参物种的蛋白信息34584条。其中，仿刺参(Apostichopus japonicus)是目前NCBI蛋白组数据库中“Holothuroidea”(海参纲)中信息最多的参种，多达30874条，而排名其次的大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)信息仅为367条，有将近100倍的差距。可见，目前海参蛋白组数据库存在较大的不完整性，现有技术对海参不同参种研究的偏重性不同，除仿刺参(Apostichopus japonicus)外，其他参种蛋白组数据库的蛋白信息尤其匮乏。
本申请涉及的7种海参样本用其所属参种为关键词，在NCBI蛋白组数据库中分别进行检索的结果如表1所示。
表1、7种海参样本所属参种NCBI蛋白数据检索结果
Figure BDA0002015799490000091
表1显示本研究7种海参样本所属参种目前的NCBI全蛋白组数据库信息，除仿刺参(Apostichopus japonicus)、大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)和黑海参(Holothuriaatra)之外，其余4个参种NCBI的全蛋白组数据库中收录的蛋白组信息都不足50条，其中海地瓜(Acaudina molpadioides)仅仅有4条结果。这种蛋白组学数据库的不完善和不均衡，很大程度上影响了在当前通过蛋白组学方法发现物种特异性蛋白的机率；需要在数据库范围进行分类等级上溯，才能保证产生足够的数据量来进行分析。
选择合适的分析策略和分析方法，有助于标志肽段的有效发现：相同蛋白在不同物种间因氨基酸序列差异而产生物种特异性肽段(Species-specific peptides,SSPs)，这是用做物种鉴定的最佳ISPs；蛋白多肽序列中因氨基酸变异和氨基酸异构体(亮氨酸，L和异亮氨酸，I)的存在，可以产生满足本申请目的的ISPs。
表2所示7种海参样本进行蛋白/多肽的鉴定分析，112564条质谱谱图数据在95％的置信水平上共鉴定多肽条目数10265条，蛋白条目数585条。将7种海参样本以相同蛋白组数据库分别独立进行蛋白/多肽鉴定，然后通过蛋白鉴定的韦恩分析结果，得出各参种样本的独有蛋白数目，结果见表2。
表2、7种海参样本单独搜库蛋白/多肽鉴定结果(95％置信水平)
序号 种类 蛋白条目数 多肽条目数 鉴定的独有蛋白数目
1 海地瓜 134 2507 33
2 仿刺参 237 4143 81
3 加州拟刺参 295 4002 80
4 梅花参 144 2565 35
5 大西洋瓜参 212 2246 73
6 黑海参 136 2054 32
7 墨西哥参 81 1227 11
2、ISPs的特异性筛选分析
对表2所示的独有蛋白进行ISPs检测特异性筛选，物种特异性肽段(SSPs)是天然的鉴别标志肽段(ISPs)，但是由于本申请相关物种的蛋白组数据库信息极端匮乏，导致发现这种最适合作为ISPs的SPPs数量不多。为扩大鉴别特异性肽段的发现几率，本申请在蛋白鉴定的过程中允许出现氨基酸变异，目的就是为了发现蛋白组数据库中尚未收录的具有鉴别特异性的肽段作为相应的ISPs。由于目前仿刺参蛋白组数据库信息最为丰富，而其他参种数据库中蛋白组信息相比仿刺参的蛋白组信息量有很大差距，在蛋白鉴定结果中出现各参种独有蛋白信息多为或全部为仿刺参蛋白的情况，除仿刺参外，归属这些蛋白的鉴定肽从理论上不应作为ISPs，但由于质谱多肽序列鉴定中无论是谱库比对或是手动从头denovo解析都无法区分组成蛋白质氨基酸中的唯一的一对同分异构体(亮氨酸，L和异亮氨酸，I)，因此存在含这些氨基酸的肽段有可能因为同分异构体的存在而具备鉴别特异性，那么这些肽段有作为ISPs的潜在可能性，如果可以最终通过MRM检测特异性的筛选，则可用作7种参种样本鉴别分析的ISPs。
对分属7种参种样本的345条独有蛋白逐一进行ISPs的特异性筛选，共计筛选出26条备选ISPs肽段。
在实际检测时，筛选出的26条备选ISPs肽段并不能全部作为ISPs进行使用，实际操作时，发现部分备选ISPs肽段不具备鉴定特异性，或者在低分辨质谱中，存在小肽的交叉串扰(Crosstalk)现象；或者在在样本基质中含有与肽的前体离子相同质荷比的肽，这些基质中的肽可以产生部分相同的传输离子对而导致选定的肽失去鉴别特异性。
经过检测、优化得出可用于7种参种样本鉴别分析的ISPs肽段共计13条，除2条含有变异氨基酸的肽段外(见下述)，其他11条ISPs序列鉴定可信度均在98％以上。ISPs的肽链长度范围为7～13氨基酸残基，分子量范围为815.3885Da～1482.8082Da，肽段测定质量精度均在50mDa范围内。13条ISPs详细信息如下：
1)海地瓜(Acaudina molpadioides)特异性多肽
经过质谱分析，所述海地瓜独有的多肽SEQ ID NO.1～2在海地瓜中确实存在，且峰形好，强度高，在仿刺参、加州拟刺参、梅花参、大西洋瓜参、黑海参、墨西哥参中均不存在。经过序列比对，SEQ ID NO.1：GNLGDQGR来自于仿刺参(Apostichopus japonicus)中的蛋白putative fibrillin-1 isoform X5(GenBank：PIK57901.1)，SEQ ID NO.2：LTEYHGAPR来源于仿刺参(Apostichopus japonicus)中的蛋白putative conserved oligomericGolgi complex subunit 7，其第14位的苯丙氨酸(F)被酪氨酸替代(Y)。
图1是海地瓜特异性多肽在海地瓜中的色谱图，SEQ ID NO.1～2的质荷比(m/z)分别为408.7，522.3。
2)仿刺参(Apostichopus japonicus)特异性多肽
经过质谱分析，所述仿刺参独有的多肽SEQ ID NO.3～4在仿刺参中确实存在，且峰形好，强度高，在海地瓜、加州拟刺参、梅花参、大西洋瓜参、黑海参、墨西哥参中均不存在。经过序列比对，SEQ ID NO.3：SISDLSSQK来自于仿刺参(Apostichopus japonicus)中的蛋白putative myosin heavy chain,striated muscle isoform X8(GenBank：PIK53254.1)，SEQ ID NO.4：GYQGPAGPQGSR来自于仿刺参(Apostichopus japonicus)中的蛋白hypothetical protein BSL78_02384(GenBank：PIK60692.1)。
图2是仿刺参特异性多肽在仿刺参中的色谱图，SEQ ID NO.3～4的质荷比(m/z)分别为482.7，587.9。
3)加州拟刺参(Parastichopus californicus)特异性多肽
经过质谱分析，所述加州拟刺参独有的多肽SEQ ID NO.5～6在加州拟刺参中确实存在，且峰形好，强度高，在仿刺参、海地瓜、梅花参、大西洋瓜参、黑海参、墨西哥参中均不存在。经过序列比对，SEQ ID NO.5：SGDLLVWDPQIIK来自于刺瓜参(Cucumaria echinata)中的蛋白hemolytic lectin-LS1,partial(GenBank：BAK19476.1)，SEQ ID NO.6：EGFGFLNR来自于仿刺参(Apostichopus japonicus)中的蛋白Fibrinogen-like protein A,partial(GenBank：PIK38719.1)。
图3是加州拟刺参特异性多肽在加州拟刺参中的色谱图，SEQ ID NO.5～6的质荷比(m/z)分别为742.4，470.2。
4)梅花参(Thelenota ananas)特异性多肽
经过质谱分析，所述梅花参独有的多肽SEQ ID NO.7～9在梅花参中确实存在，且峰形好，强度高，在仿刺参、加州拟刺参、海地瓜、大西洋瓜参、黑海参、墨西哥参中均不存在。经过序列比对，SEQ ID NO.7：GWTGPSGVTGPK来自于仿刺参(Apostichopus japonicus)中的putative collagen alpha-1(XXVII)chain蛋白，其第842位的酪氨酸(Y)被色氨酸(W)替代，SEQ ID NO.8：FFLLDVR来自于仿刺参(Apostichopus japonicus)中的蛋白putativecytochrome coxidase subunit 6C-2(GenBank：PIK36077.1)，SEQ ID NO.9：LDLSKKAMPLAK来自于仿刺参(Apostichopus japonicus)中的蛋白hypothetical protein BSL78_15828(GenBank：PIK47300.1)。
图4和图5是梅花参特异性多肽在梅花参中的色谱图，SEQ ID NO.7～9的质荷比(m/z)分别为572.3，455.3，657.9。
5)大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)特异性多肽
经过质谱分析，所述大西洋瓜参独有的多肽SEQ ID NO.10～11在大西洋瓜参中确实存在，且峰形好，强度高，在仿刺参、加州拟刺参、梅花参、海地瓜、黑海参、墨西哥参中均不存在。经过序列比对，SEQ ID NO.10：EIFDPVIDER来自于仿刺参(Apostichopusjaponicus)中的蛋白creatine kinase,mitochondrial(GenBank：PIK34842.1)，SEQ IDNO.11：LEQELDNLER来自于仿刺参(Apostichopus japonicus)中的蛋白hypotheticalprotein BSL78_03547,partial(GenBank：PIK59561.1)。
图6是大西洋瓜参特异性多肽在大西洋瓜参中的色谱图，SEQ ID NO.10～11的质荷比(m/z)分别为616.8，629.8。
6)黑海参(Holothuria atra)特异性多肽
经过质谱分析，所述黑海参独有的多肽SEQ ID NO.12在黑海参中确实存在，且峰形好，强度高，在仿刺参、加州拟刺参、梅花参、大西洋瓜参、海地瓜、墨西哥参中均不存在。经过序列比对，SEQ ID NO.12：SDPQLLLDAR来自于黑海参(Holothuria atra)中蛋白alpha-2-macroglobulin(GenBank：AMW91899.1)。
图7是黑海参特异性多肽在黑海参中的色谱图，SEQ ID NO.12的质荷比(m/z)为564.3。
7)墨西哥参(Holothuria Mexicana)特异性多肽
经过质谱分析，所述墨西哥参独有的多肽SEQ ID NO.13在墨西哥参中确实存在，且峰形好，强度高，在仿刺参、加州拟刺参、梅花参、大西洋瓜参、黑海参、海地瓜中均不存在。经过序列比对，SEQ ID NO.13：NVDDLFER来自于仿刺参(Apostichopus japonicus)中的蛋白putative glycogenin-1 isoform X4(GenBank：PIK46666.1)。
图8是墨西哥参特异性多肽在墨西哥参中的色谱图，SEQ ID NO.13的质荷比(m/z)为504.2。
在上述筛选出的13条ISPs中，物种特异性肽段(SSPs)3条(SEQ ID NO.3\4\12)；含有变异氨基酸的ISPs 2条(SEQ ID NO.2\7)；通过特异性筛选且含有I/L的ISPs 8条(SEQID NO.1\5\6\8\9\10\11\13)。
肽段SEQ ID NO.3：SISDLSSQK和SEQ ID NO.4：GYQGPAGPQGSR在NCBI网站进行全蛋白组Blastp检索，序列全匹配的蛋白分别为仿刺参蛋白putative myosin heavy chain,striated muscle isoform X8(PIK53254.1)和hypothetical protein BSL78_02384(PIK60692.1)，故2条ISPs均为仿刺参样本的SSPs；肽段SEQ ID NO.12：SDPQLLLDAR在NCBI网站进行全蛋白组Blastp检索，也仅有一个黑海参蛋白(α-2-巨球蛋白，alpha-2-macroglobulin[Holothuria atra]，AMW91889.1)含有全匹配的肽段序列(位于该蛋白氨基酸序列组成中的1298位-1307位)。但该蛋白在仿刺参中有相应的推定蛋白存在(putativealpha-2-macroglobulin)，编号分别为PIK42555.1、PIK41550、PIK42741、PIK45221.1。使用欧洲生物信息研究所(EMBL-EBI)网站(https://www.ebi.ac.uk/)Multiple SequenceAlignment工具Clustal Omega对比黑海参α-2-巨球蛋白和仿刺参推定α-2-巨球蛋白的相应位置氨基酸序列，结果来自黑海参α-2-巨球蛋白的氨基酸序列在1298位-1307位与仿刺参推定α-2-巨球蛋白相应位置有两个氨基酸的差异，分别为位于黑海参α-2-巨球蛋白1298位的丝氨酸(S)和1302位的亮氨酸(L)，因此，肽段SEQ ID NO.12：SDPQLLLDAR为黑海参样本的物种特异性肽段(SSPs)。
肽段SEQ ID NO.2：LTEYHGAPR和SEQ ID NO.7：GWTGPSGVTGPK(斜体代表变异氨基酸)分别作为海地瓜样本和梅花参样本的ISPs，在蛋白鉴定中归属为仿刺参蛋白(分别为putative conserved oligomeric Golgi complex subunit 7和putative collagenalpha-1(XXVII)chain)的变异肽段，前者为14位的苯丙氨酸(F)变异为酪氨酸(Y)，后者为842位的酪氨酸(Y)变异为色氨酸(W)。值得提出的是，未变异肽段LTEFHGAPR在SWATH数据分析结果中有相应的XIC图，其各碎片离子色谱保留时间不一致且在选定的保留时间位置肽段碎片的响应较低，因此该肽段不符合我们设置的特异性筛选规则被舍弃。相比之下，变异肽段SEQ ID NO.2：LTEYHGAPR的SWATH采集XIC图在响应强度、色谱峰形和碎片离子保留时间一致性等方面均满足设定的筛选规则要求，并通过MRM的最终筛选而成为海地瓜样本鉴别分析的ISP。
与变异肽段SEQ ID NO.7：GWTGPSGVTGPK相对应的未变异肽段GYTGPSGVTGPK因不满足SWATH数据处理设置的参数规则未能进入MRM筛选，而变异肽段SEQ ID NO.7：GWTGPSGVTGPK则经MRM筛选为梅花参鉴别分析的ISP。
本申请通过MRM筛选的13条ISPs在峰形、响应和碎片离子一致性等方面都为MRM筛选分析提供了适宜液质分析的检测特性。其中值得提出的是，肽段LDLSKKAMPLAK为梅花参样本的ISP，该肽段存在一个胰蛋白酶的漏切位点(位于从该肽段N-端起第5、6位赖氨酸之间)，一般情况下，具有酶漏切位点的肽段因其可能存在的不重现性，不宜作为鉴别分析用肽段，但该肽段在本研究多次生物学重复和技术性重复试验中均保持较好的稳定性和重现性，故此保留该肽段作为ISP用做鉴别分析用。
本申请筛选出的13条ISPs对各参种样本均具有明显的鉴别特异性，在相关的保留时间窗口内各ISPs均可特异性指征相关参种样本，且相关ISPs的MRM离子传输离子对在色谱峰强度、峰形、基质干扰、碎片离子数目等方面也满足进行日常常规分析的要求。
另外，对每个参种8个生物学重复的样本进行了重复测定，计算出本申请筛选出的13条ISPs中各ISPs的离子比率波动范围，结果显示：各ISPs在不同样本个体中离子比率的波动范围很小，为0.2％～2.1％(美国FDA规定，多肽的离子比率范围在30％以内都是合格的)，表明了各ISPs在方法前处理及离子化过程中的稳定性，满足常规分析对方法耐用性的要求。
实施例2、市场购买海参样本处理及检测步骤
对待测海参样本进行分析的步骤包括：
(一)样本前处理步骤：
(1)称取1g海参样品均质成粉末状态，加入10mL蛋白提取液(8M尿素，50mMNH4HCO3)震荡提取蛋白，高速低温离心(20000r/min)，取上清液200μL转移到1ml EP管中，获得蛋白溶液；
(2)取2μL 1mol/L DTT加入到100μL上述蛋白溶液中37℃反应1小时；
(3)取10μL现配的1mol/L的IAA(配置过程需避光)加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；
(4)采用10K滤膜20000g超滤30分钟，使用200μL 50mmol/L碳酸氢铵溶液反复冲洗滤膜上层蛋白，转移至新的EP管中；
(5)再加入200μL碳酸氢铵溶液重复此步骤，合并溶液完成膜下蛋白提取；
(6)取5μL Trypsin酶溶液(1μg/μL的Trypsin酶溶液)加入到上述蛋白溶液中37℃酶解16-18小时；
(7)采用10K滤膜14000g超滤20分钟，收集下层的肽段滤液，待上机检测。
(二)上机检测，
采用AB SCIEX
Figure BDA0002015799490000161
5600检测：
流动相A1：0.1％甲酸-乙腈，流动相B1：0.1％甲酸-水，
流速：0.25mL/min，
第一梯度洗脱如表3所示：
表3
时间(min) 流动相A1(0.1％甲酸-乙腈％) 流动相B1(0.1％甲酸-水％)
0 5 95
2 5 95
27 30 70
37 45 55
39 80 20
42.5 5 95
46 5 95
TOF扫描范围：350-1500Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10；
采用AB SCIEX三重四级杆检测：
流动相A2：0.1％甲酸-水，流动相B2：0.1％甲酸-乙腈，
流速：0.3mL/min，
第二梯度洗脱如表4所示：
表4
时间(min) 流动相A2(0.1％甲酸-水％) 流动相B2(0.1％甲酸-乙腈％)
0 95 5
0.2 95 5
8 55 45
9 50 50
10.1 95 5
13 95 5
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
检测结果对比实施例1中的各条特异性多肽的色谱图，出现实施例1中任一所述色谱图时，即可判断该组织样本为相应海参样本。
对市场上购买的样本1和样本2，进行上述前处理及检测和结果分析，结果如图9和图10所示，经过对比，样品1的三组子离子，均具有多肽SEQ ID NO.3～4的特征峰，没有其它多肽的特征峰，故判断样品1为仿刺参样品；样品2的三组子离子，均具有多肽SEQ ID NO.3～4的特征峰，没有其它多肽的特征峰，故判断样品2为仿刺参样品。
经核实，上述鉴定结果与送样样本的种属一致。
经进一步鉴定，本发明所述的特异性多肽为海地瓜、仿刺参、加州拟刺参、梅花参、大西洋瓜参、黑海参、墨西哥参各自的专有肽段，在上述范围内相对的其他种类海参品种中未见表达，并且，采用实施例2相同的方法对海参品种进行检测，鉴定结果与送样样本的种属一致。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种专属性特征肽段及用其鉴别海参种类的方法
<130> JH-CNP190335
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 海地瓜(Acaudina molpadioides)
<400> 1
Gly Asn Leu Gly Asp Gln Gly Arg
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 海地瓜(Acaudina molpadioides)
<400> 2
Leu Thr Glu Tyr His Gly Ala Pro Arg
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 仿刺参(Apostichopus japonicus)
<400> 3
Ser Ile Ser Asp Leu Ser Ser Gln Lys
1 5
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 仿刺参(Apostichopus japonicus)
<400> 4
Gly Tyr Gln Gly Pro Ala Gly Pro Gln Gly Ser Arg
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 加州拟刺参(Parastichopus californicus)
<400> 5
Ser Gly Asp Leu Leu Val Trp Asp Pro Gln Ile Ile Lys
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 加州拟刺参(Parastichopus californicus)
<400> 6
Glu Gly Phe Gly Phe Leu Asn Arg
1 5
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 梅花参(Thelenota ananas)
<400> 7
Gly Trp Thr Gly Pro Ser Gly Val Thr Gly Pro Lys
1 5 10
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 梅花参(Thelenota ananas)
<400> 8
Phe Phe Leu Leu Asp Val Arg
1 5
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 梅花参(Thelenota ananas)
<400> 9
Leu Asp Leu Ser Lys Lys Ala Met Pro Leu Ala Lys
1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> 大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)
<400> 10
Glu Ile Phe Asp Pro Val Ile Asp Glu Arg
1 5 10
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)
<400> 11
Leu Glu Gln Glu Leu Asp Asn Leu Glu Arg
1 5 10
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 黑海参（Holothuria atra）
<400> 12
Ser Asp Pro Gln Leu Leu Leu Asp Ala Arg
1 5 10
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 墨西哥参（Holothuria Mexicana）
<400> 13
Asn Val Asp Asp Leu Phe Glu Arg
1 5

Claims (5)

1.一种多肽标志物在鉴别海参种类中的应用，其特征在于，
当所述多肽标志物为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2时，则用于判断待测样本是否为海地瓜(Acaudina molpadioides)；
当所述多肽标志物为SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4时，则用于判断待测样本是否为仿刺参(Apostichopus japonicus)；
当所述多肽标志物为SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6时，则用于判断待测样本是否为加州拟刺参(Parastichopus californicus)；
当所述多肽标志物为SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8和/或SEQ ID NO.9时，则用于判断待测样本是否为梅花参(Thelenota ananas)；
当所述多肽标志物为SEQ ID NO.10和/或SEQ ID NO.11时，则用于判断待测样本是否为大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)；
当所述多肽标志物为SEQ ID NO.12时，则用于判断待测样本是否为黑海参（Holothuria atra）；
当所述多肽标志物为SEQ ID NO.13时，则用于判断待测样本是否为墨西哥参（Holothuria Mexicana）。
2.权利要求1所述的多肽标志物在制备用于鉴别海参种类的试剂/试剂盒中的应用，其特征在于，用于鉴别海参种类的试剂/试剂盒包含所述多肽标志物，所述海参种类选自海地瓜 (Acaudina molpadioides)、仿刺参(Apostichopus japonicus)、加州拟刺参(Parastichopus californicus)、梅花参(Thelenota ananas)、大西洋瓜参(Cucumaria frondosa) 、黑海参（Holothuria atra）、墨西哥参（Holothuria Mexicana）中的一种或任意几种。
3.一种检测海参种类的方法，所述方法包括如下步骤：
S1、对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽；
S2、通过质谱法检验所述待测多肽滤液中的多肽成分，分析待测样本的质谱结果对比权利要求1所述多肽标志物的质谱图；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为海地瓜(Acaudina molpadioides)或含有海地瓜(Acaudina molpadioides)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为仿刺参(Apostichopus japonicus)或含有仿刺参(Apostichopus japonicus)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为加州拟刺参(Parastichopus californicus)或含有加州拟刺参(Parastichopus californicus)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.7和/或SEQ ID NO.8和/或SEQ ID NO.9所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为梅花参(Thelenota ananas)或含有梅花参(Thelenota ananas)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.10和/或SEQ ID NO.11所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)或含有大西洋瓜参(Cucumaria frondosa)蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.12所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为黑海参（Holothuria atra）或含有黑海参（Holothuria atra）蛋白；
当所述质谱结果出现与SEQ ID NO.13所示特征多肽的质谱图相同的谱图时，则判断待测样本为墨西哥参（Holothuria Mexicana）或含有墨西哥参（Holothuria Mexicana）蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的质谱前处理包括如下步骤：
（1）称取均质成粉末状态的海参样品，加入蛋白提取液提取蛋白，高速低温离心，收集上清液；
（2）取DTT加入到所述上清液中，37 ℃反应1小时；
（3）取IAA加入到已经冷却至室温的上述反应液中，室温避光反应1小时；
（4）采用10 K滤膜超滤离心，使用碳酸氢铵反复冲洗滤膜并超滤离心，收集蛋白溶液；
（5）使用Trypsin酶溶液加入到所述蛋白溶液中37 ℃酶解16-18小时；
（6）在10 K滤膜上层加入碳酸氢铵，超滤离心，收集下层的肽段滤液，待上机检测；
所述蛋白提取液配方为：8M尿素，50mM NH4HCO3。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的质谱法检测为：采用AB SCIEXTripleTOF® 5600检测：
流动相A1：0.1%甲酸-乙腈，流动相B1：0.1%甲酸-水，
流速：0.25mL/min，
第一梯度洗脱：0~2min，5% A1；2~27 min，5~30% A1；27~37 min，30~45% A1；37~39min，45~80% A1；39~42.5 min，80~5% A1；42.5~46 min，5% A1，
TOF扫描范围：350-1500Da，
正离子反应模式，GS1：35，GS2：45，Curtain Gas：35，ISVF：5500，TEM：500，DP：100，CE：10；
采用AB SCIEX 5500 三重四级杆检测：
流动相A2：0.1% 甲酸-水，流动相B2：0.1%甲酸-乙腈，
流速：0.3 mL/min，
第二梯度洗脱：0~0.2 min，95% A2；0.2~8 min，95~55% A2；8~9 min，55~50% A2；9~10.1 min，50~95% A2；10.1~13 min，95% A2，
电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式：MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温度：475℃；鞘气压力：40；辅助气压力：6。
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