KR101734331B1 - 한국산 해삼에서 분리한 신규 항균활성 펩타이드 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국산 해삼(sea cucumber, Korean Apostichopus japonicus)에서 분리 및 화학적으로 합성한 신규 항균활성 펩타이드 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 신규 항균활성 물질로서 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 또는 그람양성균인 고초균(Bacillus substilus)에 대하여 항균활성을 나타내는 펩타이드 및 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 항균활성 펩타이드 및 폴리뉴클레오티드는 항균 성분으로 약학적 조성물, 화장료 조성물, 방부제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

한국산 해삼에서 분리한 신규 항균활성 펩타이드 및 그 용도 {Novel antimicrobial peptides from Korean sea cucumber}

본 발명은 항균활성 펩타이드에 관한 것으로서, 더 상세하게는 해삼에서 분리 및 화학적으로 합성한 신규 항균활성 펩타이드 및 그 용도에 관한 것이다.

지구에 살고 있는 대부분의 생명체들은 외부 미생물로부터의 침입을 막고, 이를 방지하기 위하여 항균 펩타이드들을 만들어 이를 분비하는 것으로 알려져 있다. 이는 고등생물에 있어서 병원균에 의한 면역반응이 일어나기 전에 일차적으로 여러 형태의 박테리아로부터의 침입을 막아주는 역할을 하는 것으로, 생명체들은 일차적으로 다양한 항균 펩타이드(antimicrobial peptide)들을 생산할 것으로 판단된다. 항균 펩타이드란 10∼50개 사이의 아미노산들로 구성되어진 분자량 2∼6KDa정도의 양전하를 띠는 염기성 펩타이드로, 박테리아와 식물 그리고 척추동물과 무척추동물을 포함한 자연계 거의 모든 생물체에 존재하는 중요한 생체방어 인자 (host defense factor)이다. 특히 동물의 선천성 면역체계(innate immune system)에 있어서는 매우 다양한 역할을 한다고 알려져 있다. 항균 펩타이드는 1962년에 개구리(Bombina variegate)의 표피 분비액에서 처음으로 그 존재성을 발견하였고, 이 후 24개의 아미노산으로 구성된 bombinin이란 항균 펩타이드가 최초로 분리되었다. 그 이후 1996년 한국산 두꺼비(Bufo bufo gargarizans)의 위(stomach)로부터 buforin이란 펩타이드가 정제되는 등 여러 생물들로부터 다양한 항균 펩타이드들의 존재가 밝혀졌고, 이후 특성 및 기능에 관한 많은 연구가 수행되고 있으며, 지금까지 약 1,500종류에 달하는 다양한 생물들에서 항균 펩타이드가 분리되었다. 그러나 이제까지 발견된 많은 항균 펩타이드들에 대한 연구들을 보았을 때 구조나 활성의 측면에서 일반적 경향성을 가지고 있기는 하지만, 아미노산의 서열상에서는 거의 유사성을 보이지 않고 있다. 이는 각각의 생물체가 자신이 살고 있는 환경에 적합하도록 자신의 펩타이드 구조 및 서열을 각기 다르게 진화시켜왔기 때문이라고 판단된다. 다양한 기작모델이 제시되었고 하나의 예로 α-helix 구조의 항균 펩타이드는 세균의 세포막에 작용하여 세포막을 파괴(disruption)함으로써 세포를 사멸하는 것으로 알려져 있다. 이러한 항균 펩타이드가 새로운 의약품 및 화장품 원료 등으로써 지나고 있는 우수한 점을 요약하면 다음과 같다.

1. 미생물 세포막을 물리적으로 파괴하는 작용기전을 갖고있어 내성균의 출현을 막을 수 있다.

2. 신속하고 효과적이며 광범위한 항균 스펙트럼(antimicrobial spectrum)을 가진다.

3. 선택적으로 병원균에만 작용하므로 인체에 유효하다.

4. 글리코실화(glycosylation) 등의 2차 변형이 없기 때문에, 유전공학의 공정을 이용한 대량생산이 가능하여 개발시 낮은 생산원가를 가진다.

하지만, 많은 α-helix 항균 펩타이드는 염 농도, 특히 2가 양이온에 의해 항균 역가가 심각하게 영향을 받는 경우가 많으며, 용혈 역가(hemolytic activity)가 있으며, 단백질 및 펩타이드 분해효소에 의한 분해로 인한 안정성의 저하 등이 단점으로 지적되고 있다. 많은 연구자들이 위와 같은 단점을 극복하기 위해, 물리화학적 성질을 기초로 항균 펩타이드 라이브러리를 제조하고 이로부터 단점이 개선된 펩타이드를 탐색하려는 연구를 하거나, 자연계에서 신규 펩타이드를 탐색하여 개량하려는 연구가 수행되어 왔다. 특히 자연계 중에서 식물이나 육상 생물에 대한 항균 펩타이드 연구는 활발히 진행 중에 있고, 또한 지금까지 척추동물에서부터 무척추동물에 이르기까지 다양한 조직으로부터 정제되었다.

해삼은 말 그대로 ‘바다 인삼’이란 뜻으로 영어로는 ‘sea cucumber(바다 오이)’라고 하여 몸이 원통형으로 길쭉하고 우둘투둘한 돌기를 지녔다. 해삼은 불가사리나 성게와 함께 ‘살갗에 가시 난 동물’이란 뜻인 극피동물(棘皮動物·Echinoderm)로 해삼강(Holothuro idea)에 속하는 모든 것을 통칭한다. 해삼은 전 세계적으로 1250여 종이 있으며 식용이 가능한 종은 약 60여종으로 알려져 있는데, 더운 필리핀·인도네시아에서 생산되는 것은 하품, 호주·뉴질랜드 양식 해삼은 중품, 일본 관서지방이나 한국산은 최상품으로 여겨지고 있다. 특히 해삼은 아시아·태평양에 많고, 우리나라에는 가장 선호도가 높은 종인 돌기 해삼(Apostichopus japonicus)을 비롯하여 14종이 알려져 있다. 우리나라에 서식하는 해삼은 같은 종이라도 색깔에 따라 청(靑)해삼, 홍(紅)해삼, 흑(黑)해삼 이 3종으로 구별하고 있는데, 이들은 외관상 띄는 색뿐만 아니라 분포 및 서식장소, 몸의 신축성이나 변태 이후 어린 해삼 시기의 체색변화 패턴, 내부 및 외부기관의 구조 등에 많은 차이점이 나타난다. 살갗의 색은 그들이 좋아하는 먹이와 서식처에 따라 결정되는데, 홍해삼 같은 경우 김, 우뭇가사리 같은 홍조류를 먹어 체색이 붉다. 또한 청해삼과 흑해삼은 유전적으로 거의 똑같지만, 홍해삼은 청해삼과 흑해삼과는 유전적으로 완전히 다르다. 수온에 대한 적응력도 해삼의 종류에 따라 다른데, 청해삼은 홍해삼보다 수온에 대하여 적응 범위가 넓고 염분에 대한 저항성이 강해 홍해삼보다 넓은 지역에서 청해삼이 발견된다. 또 해삼은 여러 기관으로 이루어져 있으며 대표적으로 몸체, 내장, 체강, 촉수, 알 등으로 나누어진다. 해삼의 섭취 부분인 체벽은 주로 콜라겐과 점질성 다당류로 구성되어 있다. 이중에서 콜라겐은 다량의 물을 보유할 수 있다. 뿐만 아니라 해삼에서 추출된 일종의 다당류인 glycoaminoglycan들은 독특한 fucose-branched chondroitin sulfate로써 항응고 활성을 가진다. 그리고 해삼의 체벽을 MeOH로 추출한 추출물은 항진균 효과가 있다고 알려져 있으며, 특히 해삼에 있는 triterpene glycoside가 항균 및 항진균 효과를 가진다고 알려져 있다. 특히 해삼의 내장에는 다른 부위 보다 더욱 강한 항산화작용 물질들이 함유되어 있으며, 불가사리뿐만 아니라 해삼에서도 소화관과 생식소의 추출물에서 높은 항균 작용을 나타내는 물질이 함유되어 있다고 알려져 있으나, 해삼에서 항균 펩타이드가 분리되었다는 보고는 전무하다.

이에, 본 발명자들은 해삼에 존재하는 항균 펩타이드를 추출·분리·정제 하여 아미노산 서열을 분석하고 화학적으로 합성하여, 상기 펩타이드의 항균 활성이 뛰어남을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

(선행기술문헌) 대한민국 등록특허 제10-1280432호, 홍해삼 추출물을 이용한 항알러지제 조성물 및 항균제 조성물, 등록일자 2013년 06월 21일

본 발명의 목적은 한국산 해삼(sea cucumber, Korean Apostichopus japonicus)에서 분리하여 화학적으로 합성한 신규한 분리된 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물, 항균용 화장료 조성물 및 방부제 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 한국산 해삼(sea cucumber, Korean Apostichopus japonicus)에서 분리하여 화학적으로 합성한 신규한 분리된 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 함유하는 방부제 조성물을 제공한다.

상기와 같은 본 발명은, 한국산 해삼(sea cucumber, Korean Apostichopus japonicus)에서 분리 및 화학적으로 합성한 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 그람 양성균과 그람 음성균에 대한 우수한 항균 활성을 확인하였으며, 본 발명의 항균활성 펩타이드 및 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 항균용 약학적 조성물, 화장료 조성물, 방부제 조성물의 항균성분으로 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 해삼에서 분리 또는 화학적으로 합성한 항균활성 펩타이드를 트리신(Tricine) SDS-PAGE 전기영동 분석한 사진이다.
레인 M : 기본 분자량 마커
레인 1 : 해삼에서 분리하여 C₁₈ RP-HPLC 정제된 항균활성 펩타이드
레인 2 : 화학적으로 합성한 항균활성 펩타이드
도 2는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 해삼에서 분리한 항균활성 펩타이드를 C₁₈ RP-HPLC 수행한 그래프이다.
도 3는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따른 화학적으로 합성한 항균활성 펩타이드를 C₁₈ RP(Revers Phase)-HPLC 수행한 그래프이다.
도 4A는 본 발명 바람직한 일 실시예에 따른 화학적으로 합성한 항균활성 펩타이드를 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 대하여 항균 활성의 역가를 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4B는 본 발명 바람직한 일 실시예에 따른 화학적으로 합성한 항균활성 펩타이드를 그람양성균인 고초균(Bacillus substilus)에 대하여 항균 활성의 역가를 측정한 결과를 나타낸 사진이다.

본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

제1, 제2 등과 같이 서수를 포함하는 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소들은 이와 같은 용어들에 의해 한정되지는 않는다. 이 용어들은 하나의 구성요소들을 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.

이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략 할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.

따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 항균활성 펩타이드를 제공한다.

상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열은 다음과 같다.

Lys Pro Asp Val Ser Glu Val Tyr Ser Phe Asp Lys Thr Lys Leu Lys

1 5 10 15

Thr Ala Glu Thr Asn Glu Leu

20

상기 항균활성 펩타이드는 해삼(sea cucumber, Apostichopus japonicus)으로부터 분리 또는 화학적으로 합성한 것이 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명자들은 상기 항균활성 펩타이드를 분리하기 위하여, 해삼(Apostichopus japonicus)을 용매로하여 추출물을 수득하였다. 상기 추출물을 원심분리하여 추출물의 상층액 분획을 회수하고, 상층액 분획을 분리 및 정제하여 항균활성 펩타이드를 수득하였다.

이때, 분리 및 정제는 우선 상층액 분획을 초미세여과를 통해 30kDa 이하의 추출물을 분리하고, 상기 단계로부터 얻은 추출물을 C₁₈ 역 상고압 액체 크로마토그래피(Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 분리된 펩타이드를 수득하였다(도 2 참조). 상기 분리된 펩타이드는 Tricine-SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다 (도 1 참조).

본 발명자들은 상기 해삼에서 분리한 항균활성 펩타이드의 아미노산 서열 및 분자량을 확인하기 위하여, 아미노산 분석기 및 MALDI-TOF(Matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight) mass spectrometery를 이용하여 확인한 결과, 서열번호 1을 갖고 분자량은 펩타이드의 순도가 낮아서 정확한 값을 알 수 없었다.

본 발명자들은 상기 화학적으로 합성한 항균활성 펩타이드의 다양한 균에서 항균 활성을 확인하기 위하여, 한천평판배지법 또는 최저생육저해농도결정법 등을 이용하여 그람음성균 및 그람양성균에 대한 항균활성을 측정하였다. 한천평판배지법으로 생육저지환의 직경을 측정한 결과, 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 또는 그람양성균인 고초균(Bacillus substilus)에서 생육저지환이 관찰되었다(도 4 참조).

본 발명의 펩타이드는 하기의 분리 방법에 의해 분리되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

1) 해삼(Apostichopus japonicus)을 동결건조한 후 추출용매를 가하여 분쇄하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 원심분리한 후 상층액 분획을 회수하는 단계;

3) 단계 2)의 상층액 분획을 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 해삼은 재배된 것 시판되는 것 제한 없이 사용할 수 있으며, 돌기 해삼(Apostichopus japonicus)을 비롯하여 청(靑)해삼, 홍(紅)해삼, 흑(黑)해삼과 같이 해삼류로서 당업계에 알려진 모든 해삼을 사용할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 동결건조는 초저온냉동고(deep freezer)를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 추출용매는 물이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 3)의 정제는 초미세여과기를 사용하여 30kDa 크기 이하의 물질을 정제하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 3)의 추출물의 상층액 분획에서 활성분획을 분리하는 방법으로 C₁₈-RP-HPLC를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 펩타이드는 항균 활성을 가지며, 구체적으로 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 그람양성균인 고초균(Bacillus substilus)에 대해 항균 활성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

따라서, 본 발명의 해삼에서 분리 및 화학적으로 합성한 신규 펩타이드는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 고초균(Bacillus substilus)에 대하여 우수한 항균활성을 나타내므로, 항균 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공함으로서, 펩타이드를 대량 생산할 수 있다. 예컨대 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 넣어 배양함으로써, 펩타이드를 대량 생산 할 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균활성 펩타이드 및 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 항균성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

상기 항균용 약학적 조성물은 구체적으로 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 그람양성균인 고초균(Bacillus substilus)에 대해 항균 활성을 가지는 것이 바람직 하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항균활성 펩타이드는 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제재의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 항균활성 펩타이드는 실제의 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 항균활성 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 황산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 신규한 펩타이드의 총 유효량은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규한 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균활성 펩타이드 및 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 항균성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 항균용 화장료 조성물은 구체적으로 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 그람양성균인 고초균(Bacillus substilus)에 대해 항균 활성을 가지는 것이 바람직 하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 항균활성 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예켠대 황산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 펩타이드는 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸타, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로 플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 항균활성 펩타이드 및 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 항균성분으로 포함하는 방부제 조성물을 제공한다.

상기 항균용 방부제 조성물은 구체적으로 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 그람양성균인 고초균(Bacillus substilus)에 대해 항균 활성을 가지는 것이 바람직 하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방부 조성물에는 식품의 방부제, 화장품 보존제 또는 의약품 보존제 등이 있다. 상기 식품의 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 식품이나 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 방부 조성물의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 일실시예를 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 한국산 해삼(Korean Apostichopus japonicus ) 추출물의 제조

초저온냉동고(deep freezer)를 통해 동결건조된 해삼(Apostichopus japonicus)에 10mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)와 3차 증류수를 넣고 1시간 동안 잘 혼합하였다. 그런 다음, 20분간 균질기(ULTRA-TURRAX® T 18 basic, IKA, USA)로 speed 5 (20000rpm)에서 조직을 잘게 분쇄한 후, 4℃에서 20분 동안 12,000 rpm(17,418 x g)으로 원심분리를 하여, 상층액 480ml을 회수하였다. 이 상층액을 진공 펌프 여과 장치를 사용해 여과(Whatman filter paper No 2, GE Healthcare, USA)을 한 뒤, MWNL(Nominal Molecular Weight Limit) 30kDa size의 초미세여과(Centricon® Plus-70, Millipore, USA)를 통해 30kDa 이하의 추출물만을 분리하였다. 분리한 30kDa 이하의 상등액을 -80℃ Deep Freezer에서 6시간 이상 얼렸다. 얼려진 30K 이하의 상등액을 48시간 이상 동결 건조 시킨 후 -80℃ Deep Freezer에 보관하였다.

< 실시예 2> 한국산 해삼(Korean Apostichopus japonicus ) 유래의 항균활성 펩타이드 분리

상기 <실시예 1>로부터 얻은 해삼 추출물로부터 펩타이드를 정제하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 분리한 동결 건조된 추출물을 C₁₈ 역 상고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 이때, 완충용액으로 0.1% TFA가 포함된 아세토나이트릴(CH3CN, pH 2.2), 분리 조건은 기울기 0% (10min) 0∼50%, (10∼60 min), 유속은 0.5 ml/min, 온도; 25℃에 의해 용출하였다. 정제에 사용한 흡수파장은 214nm, 220nm 및 254nm이었으며, 상기 용출된 용출액은 SDS-PAGE를 수행하여 확인하였다.

그 결과, 도 2 및 도 1에서 나타난 바와 같이, C₁₈ 역 상고압 액체 크로마토그래피를 통해 해삼 추출물을 정제하여 분리된 피크(peak)를 확인하였으며(도 2), SDS-PAGE를 통해 펩타이드 정제물을 확인하였다(도 1). 상기 분리된 펩타이드는 Peak A(38.9min)로 명명하였다.

< 실시예 3> 해삼 유래의 항균활성 펩타이드의 아미노산 서열 확인

상기 <실시예 1>로부터 얻은 해삼 추출물에서 정제한 항균활성 펩타이드의 아미노산 서열을 확인하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.

구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 정제된 펩타이드 Peak A(38.9min)를 MALDI-TOF mass spectrometery (ultraflex III instrument system, BRUKER, Germany)를 수행하여 펩타이드의 분자량을 질량분석기를 이용하여 측정하였으며, 아미노산 서열 결정은 N-terminal amino acid sequence Edman 분해법으로 ABI 491 procise protein Sequencer (Applied Biosystems, USA)기기를 사용하여 분석하였다.

그 결과, 도 1 및 도 3에서 나타난 바와 같이, 펩타이드 Peak A(38.9min)는 분자량은 순도가 낮아 정확한 값을 알 수 없었으나, 서열번호 1로 기재되는 23개의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드인 것을 확인하였다.

< 실시예 4> 해삼 유래 펩타이드의 항균 활성 확인

상기 서열번호 1로 화학적으로 합성한 펩타이드의 항균활성을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

구체적으로, 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 그람양성균인 고초균(Bacillus substilus)에 대한 성장 억제를 관찰하였고 활성 측정법은 하기와 같다. LB(luria bertani) 고체 배지에서 배양한 균을 LB 액체 배지에 접종한 후, 37℃ 진탕 배양기에서 10시간 배양한다. 균이 배양된 액체 배지의 50ul를 5ml LB 액체 배지에 넣고 다시 3시간동안 37℃ 진탕 배양기에서 배양하였다. 흡광도 600nm 기준 OD (optical density) 2.0 (mid- logarithmic phase)까지 배양된 균을 LB 액체 배지를 10배 희석한 후, 200ul를 LB 고체 배지에 도말하였다. 균이 도말된 배지에 양성 대조군인 msi-78(1ug/ul) 3ug과 서열번호 1로 합성한 신규 펩타이드 50ug(10ug/ul)을 주입한 후, 37℃에서 8시간 배양한 후, 생육저지환의 크기로 항균 활성을 측정하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, 상기 펩타이드가 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 그람양성균인 고초균(Bacillus substilus)에 대하여 50ug에서 항균 활성을 나타냄을 확인하였다(도 4).

<110> Hoseo University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel antimicrobial peptides from Korean sea cucumber <130> P150273HS <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Antimicrobial Peptide <400> 1 Lys Pro Asp Val Ser Glu Val Tyr Ser Phe Asp Lys Thr Lys Leu Lys 1 5 10 15 Thr Ala Glu Thr Asn Glu Leu 20

Claims (9)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 분리된 펩타이드.
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 항균 효과가 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
3. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 그람음성균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 그람양성균인 고초균(Bacillus substilus)에 대해 항균 효과가 있는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
4. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 한국산 해삼(sea cucumber, Korean Apostichopus japonicus)으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
   
5. 제 1항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
   
6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 제 5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항균 조성물.
   
7. 제 6항의 항균 조성물을 항균 성분으로 포함하는 세균으로 인한 감염성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제 6항의 항균 조성물을 항균 성분으로 포함하는 화장료 조성물.
   
9. 제 6항의 항균 조성물을 함유하는 방부제 조성물.
   

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