CN117264014A - 咸味肽、杏鲍菇咸味相关肽的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种咸味肽，其氨基酸序列为VDPADGDK。本发明还公开了咸味增强肽，咸味增强肽为VDGSPYGWPK、DSGALGTIT、VDPADGDK、GSPYGWP、FVPISGW或VPISGWH。本发明公开了杏鲍菇咸味相关肽的制备方法，包括如下步骤：取杏鲍菇子实体制成杏鲍菇冻干粉；取杏鲍菇冻干粉放于水中，首先使用酸性蛋白酶进行酶解，得到杏鲍菇酶解液，将杏鲍菇酶解液冻干后，获得杏鲍菇酶解冻干粉；将杏鲍菇酶解冻干粉末进行分离纯化获取到杏鲍菇咸味相关肽。本发明的咸味肽和咸味增强肽在食用盐存在的情况下具有增强咸味的表现，降低了食用盐的使用，并且存在鲜味的协同增强作用。
Description
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及咸味肽、杏鲍菇咸味相关肽的制备方法及其用途。
背景技术
咸味作为六种基本滋味之一，主要是由溶液中Na+引起的，它的受体主要为味蕾细胞上Na+通道和G偶联蛋白构成。因此通过改变溶液中Na+和Ca2+的浓度可以改变其咸味滋味的强度，相应的食品加工过程中通过添加其他金属离子形成的氯化盐类代替NaCl使用，达到“减盐不减咸”的目的。在引入其他金属离子的过程中，导致食物发苦发涩，也破坏了食物本身所具有的独特滋味，因此金属离子氯化盐使用的比例不高。另外，在生产过程中通过改变加工方式(高温、高压等方式)，提高Na+的释放速率，从而改变咸味强度，也是一种处理方法，但由于成本、性价比等问题，这种方式并未广泛应用。就目前，代替咸味的方法还有一种：天然提取物。天然提取物指的是从动植物中提取出具有咸味或者增强咸味的物质，这些物质多为多肽和蛋白质等。相比于上述两种方法，这种方法更安全、更绿色。
NaCl在食品加工过程中具有调节咸味、延长保质期和赋予盐渍风味的特点。在利用食用菌开发咸鲜味天然调味品，食用菌所具有的多糖和多肽具有抗氧化、抗菌消炎的作用，可以提高食品的保质期。另外，食用菌具有的蘑菇肽、蘑菇醇可以赋予食品独特的蘑菇香气。杏鲍菇作为食用菌中可工厂化生产的栽培种之一，具有生产规模广、产量大的特点。针对蛋白含量而言，杏鲍菇中粗蛋白的含量可以达到28％，是作为食用菌中制备咸味肽的优良源材料。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种咸味肽、咸味增强肽及其应用。
本发明再有一个目的是提供杏鲍菇咸味相关肽的制备方法，增加食品中咸味强度和鲜味强度，提高食品中食用盐的作用和功效。
为此，本发明提供的技术方案为：
一种咸味肽，所述咸味肽的氨基酸序列为VDPADGDK。
咸味增强肽，所述咸味增强肽为VDGSPYGWPK(ValAspGlySerProTyrGlyTrpProLys)、DSGALGTIT(AspSerGlyAlaLeuGlyThrIleThr)、VDPADGDK(ValAspProAlaAspGlyAspLys)、GSPYGWP(GlySerProTyrGlyTrpPro)、FVPISGW(PheValProIleSerGlyTrp)或VPISGWH(ValProIleSerGlyTrpHis)。
本发明还公开了一种杏鲍菇(Pleurotus eryngii)咸味相关肽的制备方法，包括如下步骤：
1)取杏鲍菇子实体制成杏鲍菇冻干粉；
2)取杏鲍菇冻干粉放于水中，首先使用酸性蛋白酶进行酶解，得到杏鲍菇酶解液，将所述杏鲍菇酶解液冻干后，获得杏鲍菇酶解冻干粉；上述获得的杏鲍菇酶解冻干粉末，将作为杏鲍菇咸味调味品的主料之一。
3)将所述杏鲍菇酶解冻干粉末进行分离纯化获取到杏鲍菇咸味相关肽，所述的分离纯化方法依次包括：阴离子交换层析、膜分离和凝胶排阻层析分离。所述的鉴定方式为Nano-LC-Q-TOF-MS/MS。
优选的是，所述的杏鲍菇咸味相关肽的制备方法中，步骤2)中，酶解的方法包括：
按照杏鲍菇冻干粉与水质量比为1:5～1:30添加水，将pH调节至2～5，以1000U/g～6000U/g的比例添加酸性蛋白酶，在40～50℃温度范围内，恒温水浴处理3～6h，然后取上清液，获得杏鲍菇酶解液。
优选的是，所述的杏鲍菇咸味相关肽的制备方法中，所述阴离子交换层析采用弱碱阴离子交换层析，将所述杏鲍菇酶解冻干粉依次采用弱碱阴离子交换层析，利用0.1MNaCl和0.3MNaCl进行分布洗脱，收集0.3M NaCl洗脱液NI2；
将洗脱液脱液NI2过0.22μm的中空纤维柱，透过液分别经过截断分子量为3kDa和150Da的超滤膜，收集获得分子量处于150Da～3kDa之间的组分，收集获得分子量处于150Da～3kDa之间的组分；
将所述分子量处于150Da～3kDa之间的组分收集浓缩后，采用凝胶体积排阻层析进行分离，获得多个组分，结合220nm条件下吸光度值大小和电子舌滋味验证，筛选出其中具有咸味的组分，所述具有咸味的组分包含所述杏鲍菇咸味相关肽。
优选的是，所述的杏鲍菇咸味相关肽的制备方法中，将所述具有咸味的组分采用Nano-LC-Q-TOF-MS/MS进行分离检测，检测到含有VDGSPYGWPK、DSGALGTIT、VDPADGDK、GSPYGWP、FVPISGW和VPISGWH。
咸味调味品，所述咸味调味品包括食用盐、所述的杏鲍菇冻干粉、所述的杏鲍菇酶解冻干粉和蔗糖，四者的质量比为21:20:15:5。
一种用于提高咸味的增加浓厚感肽，所述增加浓厚感肽的氨基酸序列为VDGSPYGWPK。
一种用于提高咸味的增鲜肽，所述增鲜肽的氨基酸序列为DSGALGTIT。
咸味调味品，所述咸味调味品包括所述的咸味肽或所述的咸味增强肽。
所述的咸味肽或所述的咸味增强肽或所述的咸味调味品在代盐调味品或代盐保健品中的用途。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明中所述的咸味肽和咸味增强肽来源于杏鲍菇，咸味肽除去本身具有咸味以外，和咸味增强肽一致，在食用盐存在的情况下具有增强咸味的表现，在一定程度上，降低了食用盐的使用，另外这五种肽在电子舌和感官评价中表现出咸味特征，并且本发明的咸味肽和咸味增强肽存在鲜味的协同增强作用。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1展示本发明实施例中不同蛋白酶酶解液的电子舌检测结果图。
图2展示本发明实施例中酸性蛋白酶酶解液的弱碱阴离子交换层析的色谱图。
图3展示本发明实施例中离子交换层析样品超滤与纳滤主要组分的电子舌指纹图谱。
图4展示本发明实施例中超滤纳滤后凝胶排阻层析的色谱图。
图5展示本发明实施例中凝胶排阻层析主要组分的电子舌指纹图谱。
图6展示本发明实施例中多肽Ⅰ和多肽Ⅳ的二级质谱图。
图7展示本发明实施例中多肽Ⅱ的二级质谱图。
图8展示本发明实施例中多肽Ⅲ的二级质谱图。
图9展示本发明实施例中多肽与杏鲍菇蛋白数据库对比图。
图10展示本发明实施例中多肽Ⅰ、多肽Ⅱ、多肽Ⅲ的电子舌指纹图谱，其中，VH-6代表的是首尾氨基酸单字母表示+肽链的长度，DT-9为DSGALGTIT。
图11展示本发明实施例中多肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的二元替代电子舌指纹图谱，其中，VK-10为VDGSPYGWPK，VK-8为VDPADGDK。
图12展示本发明实施例中多肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的咸味替代图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明提供了杏鲍菇咸味肽，包括多肽Ⅰ和/或多肽Ⅱ和/或多肽Ⅲ和/或多肽Ⅳ和/或多肽Ⅴ。
本发明所述的多肽Ⅰ为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述多肽Ⅱ为如SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列；所述多肽Ⅲ为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；所述的多肽Ⅳ为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述的多肽Ⅴ为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
本发明还提供了上述杏鲍菇咸味肽的制备方法，包括以下步骤：
1).选择个体完整购买于市场的杏鲍菇子实体，将杏鲍菇浸没于水中5～10min，除去表面浮层和杂质。将清洗后的杏鲍菇子实体沥干水份，并将其切成小方块，放置于冷冻干燥机置物槽内。冷冻干燥处理后，用打碎机打碎处理并过60目筛网，获得杏鲍菇冻干粉。
2).杏鲍菇冻干粉的预处理：取一定量步骤1)获得的杏鲍菇冻干粉，加入质量比为1:5～1:15的蒸馏水，50℃恒温提取杏鲍菇蛋白0.5～2h。(具体的提取时间根据杏鲍菇子实体冻干粉的持水率和吸水率有关)。
3).杏鲍菇酶解粉末的制备：称取一定量步骤2)中预处理后的杏鲍菇冻干粉，按照步骤2)中制备时称取杏鲍菇冻干粉的质量以质量比为1:5～1:30添加蒸馏水，混匀后，使用盐酸将pH调节至2～5，以1000U/g～6000U/g的比例添加酸性蛋白酶，在40～50℃温度范围内，恒温水浴处理3～6h，8000rpm低温离心处理，取上清液，获得杏鲍菇酶解液，冷冻干燥后，获得酶解冻干粉。
4).将步骤3)中获得的杏鲍菇酶解冻干粉末进行分离纯化和鉴定。
所述的分离纯化的步骤包括阴离子交换层析、膜分离和凝胶排阻层析分离。
阴离子交换层析分离方式为使用弱碱性阴离子交换大孔树脂D315，有效吸附溶液中阴离子并收集洗脱液。
膜分离方式为大型超滤设备，设备使用的为分子量为3kDa和200Da滤膜以及150Da反渗透膜。3kDa的滤膜主要是为了收集分子量>3kDa的组分，200Da主要是为了除去制备溶液中呈味离子(Na+、Cl-等)，150Da反渗透膜目的是截断超滤液中的水，浓缩透过液；
所述的鉴定方式为Nano-LC-Q-TOF-MS/MS：使用组学分析系统，利用qFind软件将倒序、打碎处理的杏鲍菇蛋白数据库与由四极杆飞行时间质谱获得的离子片段进行比较，筛选出杏鲍菇透过液中离子碎片可拼接的符合杏鲍菇蛋白组信息的多肽序列。
本发明还提供了一种由步骤2)、步骤1)的杏鲍菇粉末获得的咸味调味品。
所述的咸味调味品中材料依次为食用盐、步骤1)粉末、步骤2)粉末和蔗糖，以质量计算，四者的比例为21～30:20～30:10～15:1～5。
本发明提供了杏鲍菇咸味肽及咸味增强肽，包括：多肽Ⅰ为如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；多肽Ⅱ为如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；多肽Ⅲ为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；多肽Ⅳ为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；多肽Ⅴ为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；多肽Ⅵ为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。本发明中所述的咸味肽和咸味增强肽来源于杏鲍菇，咸味肽除去本身具有咸味以外，和咸味增强肽一致，在食用盐存在的情况下具有增强咸味的表现，在一定程度上，降低了食用盐的使用，另外这五种肽在电子舌和感官评价中表现出咸味特征。
为使本领域技术人员更好地更好地理解本发明的技术方案，现提供如下的实施例进行进一步说明：
实施例1
1).杏鲍菇冻干粉的获得：称取于市场购买的杏鲍菇子实体0.5kg，将杏鲍菇浸没于水中5min，除去表面浮层和杂质。将清洗后的杏鲍菇子实体沥干水分，并将其切成小方块，放置于冷冻干燥机置物槽内。冷冻处理后，用打碎机打碎处理并过60目筛网；
2).杏鲍菇冻干粉的预处理：取一定量步骤1)获得的杏鲍菇冻干粉，加入质量比为1:5的蒸馏水，50℃恒温提取杏鲍菇蛋白0.5h；
3).杏鲍菇酶解粉末的制备：称取一定量步骤2)中预处理后的杏鲍菇冻干粉，按照步骤2)中制备时称取杏鲍菇冻干粉的质量以质量比为1:15添加蒸馏水，混匀后，使用盐酸将pH调节至3，以3000U/g的比例添加酸性蛋白酶，在45℃水浴锅中，恒温处理3h后，以8000rpm条件低温离心处理10min，取上清液，获得杏鲍菇酶解液，冷冻干燥后，获得酶解冻干粉；
4).将步骤3)中获得的杏鲍菇酶解冻干粉末进行分离纯化和鉴定；
分离纯化的步骤包括：
筛选条件后，最优解为弱碱阴离子交换层析，使用D315大孔弱碱阴离子交换树脂(6.53cm×20.0cm)，分步洗脱(0.1MNaCl和0.3MNaCl)，流速为0.86mL/min，每次上样量为柱材料体积的20％，检测波长为电脑紫外检测器检测波长为260nm，根据时间每2s检测一次，绘制洗脱图，共收集流穿液、洗脱组分Ⅰ和洗脱组分Ⅱ。
超滤设备的膜分离：筛选条件后，最优解为，将上述获得的洗脱组分Ⅰ进行收集，过0.22μm的中空纤维柱，透过液分别经过截断分子量为3000Da和150Da的超滤膜，收集获得分子量处于150～3000Da之间的组分。
凝胶体积排阻层析的分离：筛选条件后，最优解为，将上述获得的分子量处于150～3000Da之间的组分，收集浓缩后，配制成浓度为6mg/mL的溶液，使用透明玻璃柱(2*100cm，材料装填量为300mL)，洗脱液为蒸馏水，流速为0.65～0.73mL/min，
咸味调味品的制备：咸味调味品中材料依次为食用盐、步骤1)粉末、步骤2)粉末和蔗糖，以质量计算，四者的比例为21:20:10:1，依次添加。
实施例2
1).杏鲍菇冻干粉的获得：称取于市场购买的杏鲍菇子实体1kg，将杏鲍菇浸没于水中5min，除去表面浮层和杂质。将清洗后的杏鲍菇子实体沥干水分，并将其切成小方块，放置于冷冻干燥机置物槽内。冷冻干燥处理后，用打碎机打碎处理并过60目筛网；
2).杏鲍菇冻干粉的预处理：取一定量步骤1)获得的杏鲍菇冻干粉，加入质量比为1:10的蒸馏水，50℃恒温提取杏鲍菇蛋白1h；
3).杏鲍菇酶解粉末的制备：称取一定量步骤2)中预处理后的杏鲍菇冻干粉，按照步骤2)中制备时称取杏鲍菇冻干粉的质量以质量比为1:15添加蒸馏水，混匀后，使用盐酸将pH调节至3.5，以4000U/g的比例添加酸性蛋白酶，在50℃水浴锅中，恒温处理3h后，以7000rpm条件低温离心处理10min，取上清液，获得杏鲍菇酶解液，冷冻干燥后，获得酶解冻干粉；
4).将步骤3)中获得的杏鲍菇酶解冻干粉末进行分离纯化和鉴定；
咸味调味品的制备：咸味调味品中材料依次为食用盐、步骤1)粉末、步骤2)粉末和蔗糖，以质量计算，四者的比例为30:30:15:5，依次添加。
实施例3
1).杏鲍菇冻干粉的获得：称取于市场购买的杏鲍菇子实体10kg，将杏鲍菇浸没于水中10min，除去表面浮层和杂质。将清洗后的杏鲍菇子实体沥干水分，并将其切成小方块，放置于冷冻干燥机置物槽内。冷冻处理后，用打碎机打碎处理并过60目筛网；
2).杏鲍菇冻干粉的预处理：取步骤1)获得的杏鲍菇冻干粉，加入质量比为1:20的蒸馏水，50℃恒温提取杏鲍菇蛋白1h；
3).杏鲍菇酶解粉末的制备：称取一定量步骤2)中预处理后的杏鲍菇冻干粉，按照步骤2)中制备时称取杏鲍菇冻干粉的质量以质量比为1:20添加蒸馏水，混匀后，使用盐酸将pH调节至3.5，以3800U/g的比例添加酸性蛋白酶，在50℃水浴锅中，恒温处理3h后，以7000rpm条件低温离心处理10min，取上清液，获得杏鲍菇酶解液，冷冻干燥后，获得酶解冻干粉；
4).将步骤3)中获得的杏鲍菇酶解冻干粉末进行分离纯化和鉴定；
咸味调味品的制备：咸味调味品中材料依次为食用盐、步骤1粉末、步骤2粉末和蔗糖，以质量计算，四者的比例为22:24:13:1，依次添加。
实施例4
1).杏鲍菇冻干粉的获得：称取于市场购买的杏鲍菇子实体5kg，将杏鲍菇浸没于水中10min，除去表面浮层和杂质。将清洗后的杏鲍菇子实体沥干水分，并将其切成小方块，放置于冷冻干燥机置物槽内。冷冻处理后，用打碎机打碎处理并过60目筛网；
2).杏鲍菇冻干粉的预处理：取步骤1)获得的杏鲍菇冻干粉，加入质量比为1:25的蒸馏水，50℃恒温提取杏鲍菇蛋白1h；
3).杏鲍菇酶解粉末的制备：称取一定量步骤2)中预处理后的杏鲍菇冻干粉，按照步骤2)中制备时称取杏鲍菇冻干粉的质量以质量比为1:20添加蒸馏水，混匀后，使用盐酸将pH调节至3.5，以3000U/g的比例添加酸性蛋白酶，在50℃水浴锅中，恒温处理3h后，以7000rpm条件低温离心处理10min，取上清液，获得杏鲍菇酶解液，冷冻干燥后，获得酶解冻干粉；
4).将步骤3)中获得的杏鲍菇酶解冻干粉末进行分离纯化和鉴定；
咸味调味品的制备：咸味调味品中材料依次为食用盐、步骤1)粉末、步骤2)粉末和蔗糖，以质量计算，四者的比例为24:25:15:3，依次添加。
实施例5
1).杏鲍菇冻干粉的获得：称取于市场购买的杏鲍菇子实体1kg，将杏鲍菇浸没于水中8min，除去表面浮层和杂质。将清洗后的杏鲍菇子实体沥干水分，并将其切成小方块，放置于冷冻干燥机置物槽内。冷冻处理后，用打碎机打碎处理并过60目筛网；
2).杏鲍菇冻干粉的预处理：取步骤1获得的杏鲍菇冻干粉，加入质量比为1:20的蒸馏水，50℃恒温提取杏鲍菇蛋白1h；
3).杏鲍菇酶解粉末的制备：称取一定量步骤2)中预处理后的杏鲍菇冻干粉，按照步骤2)中制备时称取杏鲍菇冻干粉的质量以质量比为1:20添加蒸馏水，混匀后，使用盐酸将pH调节至3.5，以3800U/g的比例添加酸性蛋白酶，在50℃水浴锅中，恒温处理3h后，以7000rpm条件低温离心处理10min，取上清液，获得杏鲍菇酶解液，冷冻干燥后，获得酶解冻干粉；
4).将步骤3)中获得的杏鲍菇酶解冻干粉末进行分离纯化和鉴定；
咸味调味品的制备：咸味调味品中材料依次为食用盐、步骤1粉末、步骤2粉末和蔗糖，以质量计算，四者的比例为24:25:16:1，依次添加。
试验例1
为了明确杏鲍菇作为咸味调味品的价值潜力和开发前景，对杏鲍菇具有咸味可能性的氨基酸和咸味滋味进行测定和感官评价，设计以下试验。
采用感官评价的方式针对对于不同提取方式从杏鲍菇提取液的获得咸味物质的效果，选择等量的溶液采用感官评价针对20mMNaCl和待测液体进行评价，结果见表1。
表1不同处理方式和不同蛋白酶处理杏鲍菇的感官评价
酸性蛋白酶的处理方式：取1g杏鲍菇冻干粉以1:20的比例添加蒸馏水，利用盐酸将溶液的pH调节至3.5后，向其中加入3000U活性单位的酸性蛋白酶，在50℃的条件恒温酶解3h。
碱性蛋白酶酶解冻干粉的处理方式：取1g杏鲍菇冻干粉以1:20的比例添加蒸馏水，利用氢氧化钠将溶液的pH调节至10后，向其中加入3000U活性单位的碱性蛋白酶，在50℃的条件恒温酶解3h。
中性蛋白酶酶解冻干粉的处理方式：取1g杏鲍菇冻干粉以1:20的比例添加蒸馏水，利用盐酸将溶液的pH调节至6后，向其中加入3000U活性单位的中性蛋白酶，在50℃的条件恒温酶解3h。
风味蛋白酶酶解冻干粉的处理方式：取1g杏鲍菇冻干粉以1:20的比例添加蒸馏水，利用盐酸将溶液的pH调节至6.5后，向其中加入3000U活性单位的酸性蛋白酶，在50℃的条件恒温酶解3h。
统一酶解处理后的酶解液经过冷冻干燥机冷冻干燥并贮存在-80℃超低温冰箱中。
由表1可知，针对可市场化生产的杏鲍菇进行咸味滋味检测，分析可知，杏鲍菇中含有可提供咸味的氨基酸(赖氨酸、天冬氨酸、丝氨酸等)，具有开发咸味多肽的潜力。针对不同的处理方式，处理方式A(水提硫酸铵沉淀)、B(50℃恒温提取)、C(水提醇沉)、D(碱提酸沉)的滋味表现弱于酶解处理后的溶液，选择使用酶解处理杏鲍菇子实体进行制备咸味多肽。
处理方式A：水提取硫酸铵沉淀处理的方法如下：利用水提取的方式，取1g杏鲍菇冻干粉，向其中加入20倍的蒸馏水后搅拌提取0.5h，使用低温高速离心机将上清液分离后，向其中加入25％的硫酸铵溶液(加入硫酸铵使溶液中的硫酸铵浓度达到25％)，再次高速低温离心处理，取沉淀后，冻干加水溶解，并测定滋味。
处理方式B：50℃恒温提取处理的方法如下：利用水提取的方式，取1g杏鲍菇冻干粉，向其中加入20倍的蒸馏水后在50℃恒温水浴下搅拌提取0.5h，使用低温高速离心机将上清液分离后，冷冻干燥后加水溶解，并测定滋味感受。
处理方式C：水提醇沉的方法具体如下：利用水提取的方式，取1g杏鲍菇冻干粉，向其中加入20倍的蒸馏水后搅拌提取0.5h，使用低温高速离心机将上清液分离后，向其中加入54％的乙醇溶液(加入乙醇使溶液中的乙醇浓度达到54％)，再次高速低温离心处理，取沉淀后，冻干加水溶解，并测定滋味。
处理方式D：碱提酸沉处理的方法如下：利用水提取的方式，取1g杏鲍菇冻干粉，向其中加入20倍的蒸馏水后搅拌提取0.5h，再向其中加入氢氧化钠溶液，将溶液的pH调节至11左右，提取1h后，离心处理后的上清液。向上清液中加入盐酸溶液，将溶液的pH调节至3.5后提取1h，利用低温高速离心机将沉淀分离，冷冻干燥后加入蒸馏水，并测定滋味感受。
试验例2
为了明确酶解处理杏鲍菇获得咸味多肽条件，使用不同的蛋白酶对杏鲍菇冻干粉进行单酶解，其中，酸性蛋白酶处理条件为pH3.5，碱性蛋白酶为pH10，中性蛋白酶处理条件为pH6.5，风味蛋白酶处理条件为pH6，其他条件中温度都为45℃，处理时间3h，添加量为3000U/g。将酶解液进行电子舌味觉检测系统检测，结果如图1所示。
由图1可知，不同酶处理后的杏鲍菇酶解液的滋味指纹图谱呈现不同。中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶酶解获得的酶解液，在电子舌的检测下，酸性蛋白酶酶解液鲜味程度低于中性蛋白酶74.01％，低于碱性蛋白酶80.71％和低于风味蛋白酶76.64％，同时还发现碱性蛋白酶酶解液和风味蛋白酶酶解液不具有咸味强度，酸性和中性蛋白酶制备的检测液存在咸味特征，两者相较，酸性蛋白酶酶解检测液中咸味强度高于中性蛋白酶酶检测液65.91％，所以酸性蛋白酶酶解液适于后续制备杏鲍菇咸味多肽，碱性蛋白酶适用于制备杏鲍菇鲜味多肽。
试验例3
为了明确制备的酶解冻干粉(采用实施例1制备得到的杏鲍菇酶解冻干粉)中在离子交换层析中咸味多肽所处的组分，色谱图如图2所示。将离子交换层析后的组分进行钠成分检测并进行透析处理，对透析液进行感官评价检测。为了明确钠离子与咸味多肽的相互作用，感官评价中加入的食用盐进行评价，其结果如表2所示。
表2离子交换层析各组分的含钠值和咸味强度
由图2可知，使用离子交换层析处理酶解处理后的溶液，获得流穿溶液NI1，0.3MNaCl洗脱液NI2和0.5MNaCl洗脱液NI3。由表2可知，透析处理后的溶液中含有较低的钠元素，透析后三个组分的咸味强度为0左右，加入食用盐后组分NI2表现出较强的咸味滋味，因此将其作为主要分离对象。
试验例4
为了去除离子交换层析液中钠元素，采用超滤和纳滤的方式将溶液由NU>100kDa、100kDa<NU1<10kDa、3kDa<NU2<10kDa和150Da<NU3<3kDa的滤膜分为4个组分，对四个组分进行多肽含量测定、咸味强度感官评价和电子舌咸味滋味检测，结果如表3和图3所示。
表3超滤组分多肽含量、糖含量和感官评价
由表3可知，随着超滤膜孔径的逐渐缩小，透过液中总糖含量出现由大到小的变化，NU3组分(大于150Da小于3kDa)质量可以占总质量的87.8％，而且其咸味强度高于NU、NU1、NU2。由图3可知，NU3具有的咸味强度高于其他三个组分，可作为后续凝胶排阻层析的材料。
试验例5
为了明确超滤处理后溶液中咸味多肽所处分段，对NU3组分进行凝胶排阻层析，凝胶排阻层析结果和其主要组分NP3和NP5的电子舌味觉分析结果如图4～5所示。
由图4可知，体积排阻层析图谱中显示出7个主要的峰，通过软件Origin 2021Pro对已获得的曲线进行拟合，将重叠的峰合并收集，获得编号为NP1、NP2、NP3、NP4、NP5、NP6和NP7。结合220nm条件下，吸光度值大小，选择NP3和NP5进行电子舌滋味验证。由图5可知，NP5具有咸味而NP3不具有咸味滋味。
试验例6
为了明确NP5组分中咸味物质的多肽序列结构，对凝胶分离组分NP5进行Nano-LC-Q-TOF-MS/MS分离检测，色谱柱为C18(75μm×100mm)。
(1)样品的制备：取适量的NP5冻干样品溶解于双蒸水中，配置成蛋白浓度至少为1mg/mL的样品溶液，取透过0.22μm的水系聚醚砜滤膜溶液于离心管内，冷冻干燥处理，并将其溶解至进口LC-MS级水(下文简称为水)并使用甲酸将pH值调至3以下。
(2)样品的脱盐：使用纯乙腈活化脱盐柱2次，加入0.1％的甲酸溶液平衡2次，加入样品后，使用0.1％的甲酸洗涤样品中的盐分2次，加入0.1％甲酸/50％的乙腈溶液洗脱肽段，收集流出液2次，将收集到的流出液合并并于真空离心浓缩仪浓缩，彻底干燥后用于质谱分析。
(3)Eksigent Nano-LC-Ultra纳升液相系统的分离检测：色谱柱C18(75μm×10cmΦ＝1.9μm)
流动相A为2％乙腈，98％水(含0.2％甲酸)
流动相B为98％乙腈，2％水(含0.2％甲酸)
梯度分离60min，流动相B由5％线性增加至40％
(4)SCIEX TripleTOF 5600质谱系统在正离子模式下进行信息依赖扫描(IDA)采集数据。
(5)数据分析：质谱采集的WIFF文件采用pFind软件进行数据库比对。参数设置如下：设置固定修饰为Carbamidomethyl(C)，可变修饰为Oxidation(M)、Acetyl(Protein N-term)；设置漏切设置为24，设置酶为非特异性酶；一级质谱误差范围设置为±20ppm，二级质谱误差范围为±0.05Da；设置FDR(False Discovery Rate，错误发现率)为1％。用于搜索的蛋白质序列库为Uniprot(www.uniprot.org)网站下载的Pleurotus eryngii种属数据库(共含有379条蛋白序列)，使用以上数据库分别对样品NP5进行蛋白数据库比对，共比对出5条多肽，结果如表4和图6～8所示。
表4五条多肽的相对分子质量与编号
| SEQ ID NO: | 多肽序列 | 相对分子质量 | |
| 多肽Ⅰ | 1 | VDGSPYGWPK | 1105.19 |
| 多肽Ⅱ | 2 | DSGALGTIT | 833.88 |
| 多肽Ⅲ | 3 | VDPADGDK | 815.82 |
| 多肽Ⅳ | 4 | GSPYGWP | 762.8 |
| 多肽Ⅴ | 5 | FVPISGW | 657.75 |
| 多肽Ⅵ | 6 | VPISGWH | 794.89 |
根据表4和图6～8可以看出，NP3组分中经qFind比对后获得高质量的多肽序列的分子质量分别为1105.19Da、833.88Da、815.82Da、762.80Da和657.75Da，序列依次为VDGSPYGWPK(多肽Ⅰ)、DSGALGTIT(多肽Ⅱ)、VDPADGDK(多肽Ⅲ)以及与杏鲍菇蛋白质数据库匹配的GSPYGWP(多肽Ⅳ)、FVPISGW(多肽Ⅴ)和VPISGWH(多肽Ⅵ)，匹配结果如图9所示。
试验例7
将上述中多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ委托上海吉尔多肽有限公司进行固相合成。将合成的冻干粉末配置成0.5mg/mL的溶液，进行电子舌滋味检测和感官评价，结果如表5和图10所示，二元试验验证结果如图11所示，咸味替代结果如图12所示。其中，咸味替代结果的检测方法为：将不含有食用盐的多肽溶液进行电子舌滋味检测并作为处理组使用；将40mM的食用盐溶液的电子舌结果图作为对照组使用：将40mM食用盐的多肽溶液的电子声结果作为处理组结果，绘制结果如图12展现出，可知原本的多肽溶液和盐溶液在混合后两者咸味滋味呈现的结果为叠加和增强的效果。
表5三条多肽合成溶液的感官评价及咸味表现
由表5可知，多肽Ⅰ与多肽Ⅳ具有相同的多肽结构，在合成时主要针对多肽Ⅰ进行了咸味滋味检测和电子舌测定。感官评价结果中显示，多肽Ⅲ具有较弱的咸味滋味，多肽Ⅰ和多肽Ⅱ分别侧重于浓厚感和鲜味滋味。这三种多肽都表现出较弱的酸味和涩味，它们的滋味具有特征性。由图10可知，三种合成肽中只有多肽Ⅲ表现出咸味滋味，其他两种未表现出咸味滋味。由图11可知，三种多肽在添加食用盐后表现出代替食盐和增强咸味的特点。由图12可知，多肽Ⅰ可以替代18.7％食用盐，多肽Ⅱ可以替代21.2％食用盐，多肽Ⅲ可以替代30％食用盐。若联合处理，多肽Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ可以增强50％的食用盐效果。
尽管本发明实施例的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明实施例的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明实施例并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (10)
1.一种咸味肽，其特征在于，所述咸味肽的氨基酸序列为VDPADGDK。
2.咸味增强肽，其特征在于，所述咸味增强肽为VDGSPYGWPK、DSGALGTIT、VDPADGDK、GSPYGWP、FVPISGW或VPISGWH。
3.一种杏鲍菇咸味相关肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)取杏鲍菇子实体制成杏鲍菇冻干粉；
2)取杏鲍菇冻干粉放于水中，首先使用酸性蛋白酶进行酶解，得到杏鲍菇酶解液，将所述杏鲍菇酶解液冻干后，获得杏鲍菇酶解冻干粉；
3)将所述杏鲍菇酶解冻干粉末进行分离纯化获取到杏鲍菇咸味相关肽，所述的分离纯化方法依次包括：阴离子交换层析、膜分离和凝胶排阻层析分离。
4.如权利要求3所述的杏鲍菇咸味相关肽的制备方法，其特征在于，步骤2)中，酶解的方法包括：
按照杏鲍菇冻干粉与水质量比为1:5～1:30添加水，将pH调节至2～5，以1000U/g～6000U/g的比例添加酸性蛋白酶，在40～50℃温度范围内，恒温水浴处理3～6h，然后取上清液，获得杏鲍菇酶解液。
5.如权利要求3所述的杏鲍菇咸味相关肽的制备方法，其特征在于，所述阴离子交换层析采用弱碱阴离子交换层析，将所述杏鲍菇酶解冻干粉依次采用弱碱阴离子交换层析，利用0.1MNaCl和0.3MNaCl进行分布洗脱，收集0.3M NaCl洗脱液NI2；
将洗脱液脱液NI2过0.22μm的中空纤维柱，透过液分别经过截断分子量为3kDa和150Da的超滤膜，收集获得分子量处于150Da～3kDa之间的组分，收集获得分子量处于150Da～3kDa之间的组分；
将所述分子量处于150Da～3kDa之间的组分收集浓缩后，采用凝胶体积排阻层析进行分离，获得多个组分，结合220nm条件下吸光度值大小和电子舌滋味验证，筛选出其中具有咸味的组分，所述具有咸味的组分包含所述杏鲍菇咸味相关肽。
6.如权利要求5所述的杏鲍菇咸味相关肽的制备方法，其特征在于，将所述具有咸味的组分采用Nano-LC-Q-TOF-MS/MS进行分离检测，检测到含有VDGSPYGWPK、DSGALGTIT、VDPADGDK、GSPYGWP、FVPISGW和VPISGWH。
7.咸味调味品，其特征在于，所述咸味调味品包括食用盐、如权利要求3所述的杏鲍菇冻干粉、如权利要求3所述的杏鲍菇酶解冻干粉和蔗糖。
8.一种用于提高咸味的增加浓厚感肽，其特征在于，所述增加浓厚感肽的氨基酸序列为VDGSPYGWPK。
9.一种用于提高咸味的增鲜肽，其特征在于，所述增鲜肽的氨基酸序列为DSGALGTIT。
10.如权利要求1所述的咸味肽或如权利要求2所述的咸味增强肽或如权利要求7所述的咸味调味品在代盐调味品或代盐保健品中的用途。
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