RU2570631C2 - Способ получения пероксидазы - Google Patents
Способ получения пероксидазы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2570631C2 RU2570631C2 RU2013144910/10A RU2013144910A RU2570631C2 RU 2570631 C2 RU2570631 C2 RU 2570631C2 RU 2013144910/10 A RU2013144910/10 A RU 2013144910/10A RU 2013144910 A RU2013144910 A RU 2013144910A RU 2570631 C2 RU2570631 C2 RU 2570631C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- eluate
- solution
- calcium chloride
- rate
- peroxidase
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения пероксидазы. Способ заключается в экстракции предварительно измельченных корнеплодов редьки черной 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5 ч при комнатной температуре с последующим центрифугированием и сепарированием. Полученный экстракт подвергают сорбции на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н+-форме со скоростью 240 мл/см2 ч с последующей промывкой 15 объемами дистиллированной воды. Осуществляют элюцию с использованием раствора аммиака рН 10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 160 мл/см2 ч для получения элюата. Доводят значения рН в элюате до 6, обессоливают элюат и лиофильно высушивают с получением указанного фермента. Способ позволяет сократить потери целевого продукта, увеличить выход фермента на 30%. 2 пр.
Description
Изобретение относится к производству ферментов, а именно к способу оксидаз (пероксидаз) и гидролитического фермента (лизоцима) из растительного сырья.
Известные способы получения ферментов из растительного сырья с использованием экстракционных, сорбционных и других методов выделения предусматривают получение отдельных ферментов или нескольких ферментов в комплексе, в основном для препаративных целей.
Из RU 2388819 C2 известен способ получения пероксидазы из корневищ хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией и осаждение белков сульфатом аммония, осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера, с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, затем продолжают очистку в 0,01-0,03 М растворе MOPS-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой при значениях рН и рК буферов 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно. Очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, затем лиофилизуют.
Из RU 2342431 C1 известен способ получения авидина и лизоцима из яичного белка посредством хроматографии яичного белка, проводимой на силохроме C-80 при нейтральном значении pH (7,0-7,5), балластные белки удаляют в 0,2 М глицин-NaOH буфере в присутствии 0,3 М NaCl при pH 9,39,5, целевые белки элюируют совместно карбонатным буфером с 0,5-0,8 М NaCl, при pH 10,8-11,0 с последующим разделением белков гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-75.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является описанный выше способ получения пероксидазы из корневищ хрена, раскрытый в RU 2388819. Недостатками указанного способа являются многостадийность процесса, использование агрессивного и экологически небезопасного высаливающего агента, использование для очистки от балластных белков двух гелевых сорбентов.
Задача настоящего изобретения заключалась в разработке нового сорбционного способа получения ферментов из растительного сырья, при котором процесс их получения упрощен с возможностью получения пероксидазы и лизоцима в одном цикле работы сорбционной колонны. Преимуществом такого способа также является повышение выхода и чистоты получаемой пероксидазы.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения ферментов из растительного сырья, выбранных из пероксидаз и лизоцима, при котором предварительно измельченное растительное сырье подвергают водно-солевой экстракции 5 % раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5-3 ч при комнатной температуре. Затем экстракт последовательно подвергают центрифугированию и сепарированию для удаления остатков сырья и балластных веществ, сорбции на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H+-форме со скоростью 50-240 мл/см2 ч с последующей промывкой колонны 3-15 объемами дистиллированной воды или цитратно-фосфатного буферного раствора с рН 4,0, элюции с использованием в качестве элюента раствора аммиака с рН 9,0-10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 25-160 мл/см2 ч для получения элюата, содержащего пероксидазу, и последующей возможной элюции с использованием в качестве элюента раствора аммиака с рН 11 с 1 н. раствором (NH4)2SO4 со скоростью 25-160 мл/см2 ч для получения элюата, содержащего лизоцим, и доводят значение рН в элюате(ах) до 6, обессоливания и лиофильной сушки с получением указанного(ых) фермента(ов).
Предпочтительно, изобретение относится к описанному выше способу, при котором в качестве растительного сырья используют корнеплоды редьки черной.
Предпочтительно, изобретение относится к описанному выше способу, при котором в качестве растительного сырья используют корневища хрена.
Отличие предложенного способа от прототипа заключается в осуществлении процесса по гибкой технологии с использованием одного и того же сорбционного оборудования независимо от свойств целевого продукта с последующей очисткой индивидуально для каждого фермента.
Положительный эффект от предложенного технического решения состоит в следующем:
- возможность выделения и очистки белков различной структуры на одних и тех же производственных мощностях в зависимости от потребности;
- сокращаются потери целевых продуктов и увеличивается съем ферментов с единицы сырья в среднем на 30%;
- улучшается качество готовых препаратов и условия труда.
Способ иллюстрируется следующими примерами
ПРИМЕР 1
Измельченные, обезжиренные и высушенные корнеплоды редьки черной подвергают экстракции 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 (25 кг сырья : 250 л экстрагента) при комнатной температуре в течение 30 минут при постоянном перемешивании. После окончания экстракции растительное сырье отделяют на шнековой центрифуге, экстракт сепарируют. Затем прозрачный экстракт подают на ионообменную колонну, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H+-форме в количестве 20 кг. Скорость сорбции 240 мл/см2 ч. Объем пропущенного экстракта 105 л, pH 5,0. После сорбции сорбент промывают дистиллированной водой в количестве пятнадцати объемов свободного пространства колонки и проводят десорбцию пероксидазы раствором аммиака с 5% раствором кальция хлорида, чтобы избежать существенного удаления ионов кальция и, как следствие, инактивации фермента, подавая элюент сверху вниз со скоростью 160 мл/см2 ч при комнатной температуре, pH элюента 10,7. На выходе из колонны собирают фракции объемом 5 л, в которых определяют количество белка по методу Лоури и активность пероксидазы по пирогаллоу. Фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют, доводят рН элюата до 6,0, производят обессоливание и лиофильную сушку фермента пероксидазы.
ПРИМЕР 2
Измельченные, обезжиренные и высушенные корневища хрена подвергают экстракции 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 (25 кг сырья : 250 л экстрагента) при комнатной температуре в течение 30 минут при постоянном перемешивании. После окончания экстракции растительное сырье отделяют на шнековой центрифуге, экстракт сепарируют. Затем прозрачный экстракт подают на ионообменную колонну, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H+-форме в количестве 20 кг. Скорость сорбции 240 мл/см2 ч. Объем пропущенного экстракта 105 л, pH 5,0. После сорбции сорбент промывают дистиллированной водой в количестве пятнадцати объемов свободного пространства колонки и проводят десорбцию пероксидазы раствором аммиака с 5% раствором кальция хлорида, чтобы избежать существенного удаления ионов кальция и, как следствие, инактивации фермента, подавая элюент сверху вниз со скоростью 160 мл/см2 ч при комнатной температуре, рН элюента 10,7. На выходе из колонны собирают пробы по 5 л и определяют в них содержание белка по методу Лоури и активность пероксидазы по пирогаллоу; фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют. После десорбции пероксидазы колонну промывают 3 объемами цитратно-фосфатного буферного раствора с pH 4,0, после чего ведут десорбцию лизоцима раствором аммиака с рН 11,0-12,0 с 1 н. раствором (NH4)2SO4 со скоростью 160 мл/см2 ч. На выходе из колонны собирают пробы по 5 л определяют в них содержание белка по методу Лоури и активность лизоцима; фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют. В полученных элюатах перокисдазы и лизоцима сдвигают рН до 6,0, после чего их подвергают обессоливанию и лиофилизации.
Claims (1)
- Способ получения пероксидазы из корнеплодов редьки черной, заключающийся в экстракции предварительно измельченного сырья 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5 ч при комнатной температуре с последующим центрифугированием и сепарированием, сорбции полученного экстракта на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н+-форме со скоростью 240 мл/см2 ч с последующей промывкой 15 объемами дистиллированной воды, элюции с использованием раствора аммиака рН 10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 160 мл/см2 ч для получения элюата, доведения значения рН в элюате до 6, обессоливания и лиофильной сушки с получением указанного фермента.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013144910/10A RU2570631C2 (ru) | 2013-10-07 | 2013-10-07 | Способ получения пероксидазы |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2013144910/10A RU2570631C2 (ru) | 2013-10-07 | 2013-10-07 | Способ получения пероксидазы |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013144910A RU2013144910A (ru) | 2015-04-20 |
RU2570631C2 true RU2570631C2 (ru) | 2015-12-10 |
Family
ID=53282584
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013144910/10A RU2570631C2 (ru) | 2013-10-07 | 2013-10-07 | Способ получения пероксидазы |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2570631C2 (ru) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2021372C1 (ru) * | 1991-04-30 | 1994-10-15 | Глазова Наталья Владимировна | Способ получения гидролитических ферментов |
RU2126044C1 (ru) * | 1995-02-23 | 1999-02-10 | Наталия Владимировна Глазова | Способ получения гиалуронидазы |
RU2005130682A (ru) * | 2005-10-04 | 2007-04-10 | Наталь Владимировна Глазова (RU) | Способ выделения и очистки цитохрома c |
RU2388819C2 (ru) * | 2008-06-25 | 2010-05-10 | Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) | Способ получения пероксидазы хрена |
-
2013
- 2013-10-07 RU RU2013144910/10A patent/RU2570631C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2021372C1 (ru) * | 1991-04-30 | 1994-10-15 | Глазова Наталья Владимировна | Способ получения гидролитических ферментов |
RU2126044C1 (ru) * | 1995-02-23 | 1999-02-10 | Наталия Владимировна Глазова | Способ получения гиалуронидазы |
RU2005130682A (ru) * | 2005-10-04 | 2007-04-10 | Наталь Владимировна Глазова (RU) | Способ выделения и очистки цитохрома c |
RU2388819C2 (ru) * | 2008-06-25 | 2010-05-10 | Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) | Способ получения пероксидазы хрена |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ГЛАЗОВА Н. В. И ДР. Оптимизация процесса сорбции ДНК-азы и Цитохрома С из их смеси // Сорбционные и хроматографические процессы, 2011, т. 11, вып. 6, с. 820-827. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2013144910A (ru) | 2015-04-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111164090A (zh) | 用于从微生物发酵纯化中性母乳寡糖(hmo)的方法 | |
US20230217981A1 (en) | High Purity Protein Preparation from Plant Material and Products Thereof | |
Luding et al. | Isolation of lysozyme from chicken egg white using polyacrylamide-based cation-exchange cryogel | |
CN111944866B (zh) | 连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法 | |
CN104130319B (zh) | 一种藻红蛋白的提取方法 | |
CN112708702A (zh) | 一种生产植物源d-塔格糖的方法 | |
CN112979756A (zh) | 达托霉素的提纯方法 | |
CN102295700A (zh) | 绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法及在鱼糜制品生产中的应用 | |
CN109385414B (zh) | 菠萝蛋白酶的纯化方法 | |
RU2570631C2 (ru) | Способ получения пероксидазы | |
RU2390253C1 (ru) | Способ получения лактоферрина из молочного сырья | |
Sanogo et al. | Purification of αs1-casein by fast protein liquid chromatography | |
CN105399816A (zh) | 一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法 | |
RU2225441C1 (ru) | Способ получения препарата коллагеназы | |
KR101928953B1 (ko) | 토마토 유래 폴리갈락투로나아제 전구체의 분리 및 정제 방법 | |
JPS6160050B2 (ru) | ||
PL85201B1 (ru) | ||
SU654612A1 (ru) | Способ выделени цитохрома | |
US4072667A (en) | Process for recovering microbial cellular proteins | |
RU2186848C1 (ru) | Способ выделения супероксиддисмутазы | |
CN104593340B (zh) | 一种从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法 | |
Camperi et al. | Study of variables involved in fungal pectic enzyme fractionation by immobilized metal ion affinity chromatography | |
CN102875607B (zh) | 一种棉籽糖的分离纯化方法 | |
RU2658605C2 (ru) | Способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота | |
CN106699837A (zh) | 啤酒废酵母制备多肽的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20151008 |