RU2570631C2 - Способ получения пероксидазы - Google Patents

Способ получения пероксидазы Download PDF

Info

Publication number
RU2570631C2
RU2570631C2 RU2013144910/10A RU2013144910A RU2570631C2 RU 2570631 C2 RU2570631 C2 RU 2570631C2 RU 2013144910/10 A RU2013144910/10 A RU 2013144910/10A RU 2013144910 A RU2013144910 A RU 2013144910A RU 2570631 C2 RU2570631 C2 RU 2570631C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
eluate
solution
calcium chloride
rate
peroxidase
Prior art date
Application number
RU2013144910/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013144910A (ru
Inventor
Владимир Николаевич Иванов
Наталья Владимировна Глазова
Анастасия Никитична Серкова
Светлана Александровна Сальникова
Original Assignee
Владимир Николаевич Иванов
Наталья Владимировна Глазова
Анастасия Никитична Серкова
Светлана Александровна Сальникова
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Владимир Николаевич Иванов, Наталья Владимировна Глазова, Анастасия Никитична Серкова, Светлана Александровна Сальникова filed Critical Владимир Николаевич Иванов
Priority to RU2013144910/10A priority Critical patent/RU2570631C2/ru
Publication of RU2013144910A publication Critical patent/RU2013144910A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2570631C2 publication Critical patent/RU2570631C2/ru

Links

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу получения пероксидазы. Способ заключается в экстракции предварительно измельченных корнеплодов редьки черной 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5 ч при комнатной температуре с последующим центрифугированием и сепарированием. Полученный экстракт подвергают сорбции на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н+-форме со скоростью 240 мл/см2 ч с последующей промывкой 15 объемами дистиллированной воды. Осуществляют элюцию с использованием раствора аммиака рН 10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 160 мл/см2 ч для получения элюата. Доводят значения рН в элюате до 6, обессоливают элюат и лиофильно высушивают с получением указанного фермента. Способ позволяет сократить потери целевого продукта, увеличить выход фермента на 30%. 2 пр.

Description

Изобретение относится к производству ферментов, а именно к способу оксидаз (пероксидаз) и гидролитического фермента (лизоцима) из растительного сырья.
Известные способы получения ферментов из растительного сырья с использованием экстракционных, сорбционных и других методов выделения предусматривают получение отдельных ферментов или нескольких ферментов в комплексе, в основном для препаративных целей.
Из RU 2388819 C2 известен способ получения пероксидазы из корневищ хрена, включающий гомогенизацию корней хрена, экстракцию фермента, концентрирование ультрафильтрацией и осаждение белков сульфатом аммония, осадок белков диализуют против воды и 0,01-0,03 М раствора TEA-HCl буфера, с последующей очисткой пероксидазы от балластных белков на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой в том же буфере, затем продолжают очистку в 0,01-0,03 М растворе MOPS-NaOH буфера на колонке с КМ-целлюлозой при значениях рН и рК буферов 7,1-7,4 и 7,5-7,6 соответственно. Очищенный целевой продукт диализуют против воды и 0,01-0,03 М NaCl, затем лиофилизуют.
Из RU 2342431 C1 известен способ получения авидина и лизоцима из яичного белка посредством хроматографии яичного белка, проводимой на силохроме C-80 при нейтральном значении pH (7,0-7,5), балластные белки удаляют в 0,2 М глицин-NaOH буфере в присутствии 0,3 М NaCl при pH 9,39,5, целевые белки элюируют совместно карбонатным буфером с 0,5-0,8 М NaCl, при pH 10,8-11,0 с последующим разделением белков гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-75.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является описанный выше способ получения пероксидазы из корневищ хрена, раскрытый в RU 2388819. Недостатками указанного способа являются многостадийность процесса, использование агрессивного и экологически небезопасного высаливающего агента, использование для очистки от балластных белков двух гелевых сорбентов.
Задача настоящего изобретения заключалась в разработке нового сорбционного способа получения ферментов из растительного сырья, при котором процесс их получения упрощен с возможностью получения пероксидазы и лизоцима в одном цикле работы сорбционной колонны. Преимуществом такого способа также является повышение выхода и чистоты получаемой пероксидазы.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения ферментов из растительного сырья, выбранных из пероксидаз и лизоцима, при котором предварительно измельченное растительное сырье подвергают водно-солевой экстракции 5 % раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5-3 ч при комнатной температуре. Затем экстракт последовательно подвергают центрифугированию и сепарированию для удаления остатков сырья и балластных веществ, сорбции на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H+-форме со скоростью 50-240 мл/см2 ч с последующей промывкой колонны 3-15 объемами дистиллированной воды или цитратно-фосфатного буферного раствора с рН 4,0, элюции с использованием в качестве элюента раствора аммиака с рН 9,0-10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 25-160 мл/см2 ч для получения элюата, содержащего пероксидазу, и последующей возможной элюции с использованием в качестве элюента раствора аммиака с рН 11 с 1 н. раствором (NH4)2SO4 со скоростью 25-160 мл/см2 ч для получения элюата, содержащего лизоцим, и доводят значение рН в элюате(ах) до 6, обессоливания и лиофильной сушки с получением указанного(ых) фермента(ов).
Предпочтительно, изобретение относится к описанному выше способу, при котором в качестве растительного сырья используют корнеплоды редьки черной.
Предпочтительно, изобретение относится к описанному выше способу, при котором в качестве растительного сырья используют корневища хрена.
Отличие предложенного способа от прототипа заключается в осуществлении процесса по гибкой технологии с использованием одного и того же сорбционного оборудования независимо от свойств целевого продукта с последующей очисткой индивидуально для каждого фермента.
Положительный эффект от предложенного технического решения состоит в следующем:
- возможность выделения и очистки белков различной структуры на одних и тех же производственных мощностях в зависимости от потребности;
- сокращаются потери целевых продуктов и увеличивается съем ферментов с единицы сырья в среднем на 30%;
- улучшается качество готовых препаратов и условия труда.
Способ иллюстрируется следующими примерами
ПРИМЕР 1
Измельченные, обезжиренные и высушенные корнеплоды редьки черной подвергают экстракции 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 (25 кг сырья : 250 л экстрагента) при комнатной температуре в течение 30 минут при постоянном перемешивании. После окончания экстракции растительное сырье отделяют на шнековой центрифуге, экстракт сепарируют. Затем прозрачный экстракт подают на ионообменную колонну, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H+-форме в количестве 20 кг. Скорость сорбции 240 мл/см2 ч. Объем пропущенного экстракта 105 л, pH 5,0. После сорбции сорбент промывают дистиллированной водой в количестве пятнадцати объемов свободного пространства колонки и проводят десорбцию пероксидазы раствором аммиака с 5% раствором кальция хлорида, чтобы избежать существенного удаления ионов кальция и, как следствие, инактивации фермента, подавая элюент сверху вниз со скоростью 160 мл/см2 ч при комнатной температуре, pH элюента 10,7. На выходе из колонны собирают фракции объемом 5 л, в которых определяют количество белка по методу Лоури и активность пероксидазы по пирогаллоу. Фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют, доводят рН элюата до 6,0, производят обессоливание и лиофильную сушку фермента пероксидазы.
ПРИМЕР 2
Измельченные, обезжиренные и высушенные корневища хрена подвергают экстракции 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 (25 кг сырья : 250 л экстрагента) при комнатной температуре в течение 30 минут при постоянном перемешивании. После окончания экстракции растительное сырье отделяют на шнековой центрифуге, экстракт сепарируют. Затем прозрачный экстракт подают на ионообменную колонну, заполненную макропористым сульфокатионитом КУ-23 в H+-форме в количестве 20 кг. Скорость сорбции 240 мл/см2 ч. Объем пропущенного экстракта 105 л, pH 5,0. После сорбции сорбент промывают дистиллированной водой в количестве пятнадцати объемов свободного пространства колонки и проводят десорбцию пероксидазы раствором аммиака с 5% раствором кальция хлорида, чтобы избежать существенного удаления ионов кальция и, как следствие, инактивации фермента, подавая элюент сверху вниз со скоростью 160 мл/см2 ч при комнатной температуре, рН элюента 10,7. На выходе из колонны собирают пробы по 5 л и определяют в них содержание белка по методу Лоури и активность пероксидазы по пирогаллоу; фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют. После десорбции пероксидазы колонну промывают 3 объемами цитратно-фосфатного буферного раствора с pH 4,0, после чего ведут десорбцию лизоцима раствором аммиака с рН 11,0-12,0 с 1 н. раствором (NH4)2SO4 со скоростью 160 мл/см2 ч. На выходе из колонны собирают пробы по 5 л определяют в них содержание белка по методу Лоури и активность лизоцима; фракции, содержащие более 10 мг/мл белка, объединяют. В полученных элюатах перокисдазы и лизоцима сдвигают рН до 6,0, после чего их подвергают обессоливанию и лиофилизации.

Claims (1)

  1. Способ получения пероксидазы из корнеплодов редьки черной, заключающийся в экстракции предварительно измельченного сырья 5% раствором кальция хлорида в соотношении 1:10 в течение 0,5 ч при комнатной температуре с последующим центрифугированием и сепарированием, сорбции полученного экстракта на ионообменной колонне с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н+-форме со скоростью 240 мл/см2 ч с последующей промывкой 15 объемами дистиллированной воды, элюции с использованием раствора аммиака рН 10,7 с 5% раствором кальция хлорида со скоростью 160 мл/см2 ч для получения элюата, доведения значения рН в элюате до 6, обессоливания и лиофильной сушки с получением указанного фермента.
RU2013144910/10A 2013-10-07 2013-10-07 Способ получения пероксидазы RU2570631C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013144910/10A RU2570631C2 (ru) 2013-10-07 2013-10-07 Способ получения пероксидазы

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013144910/10A RU2570631C2 (ru) 2013-10-07 2013-10-07 Способ получения пероксидазы

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013144910A RU2013144910A (ru) 2015-04-20
RU2570631C2 true RU2570631C2 (ru) 2015-12-10

Family

ID=53282584

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013144910/10A RU2570631C2 (ru) 2013-10-07 2013-10-07 Способ получения пероксидазы

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2570631C2 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2021372C1 (ru) * 1991-04-30 1994-10-15 Глазова Наталья Владимировна Способ получения гидролитических ферментов
RU2126044C1 (ru) * 1995-02-23 1999-02-10 Наталия Владимировна Глазова Способ получения гиалуронидазы
RU2005130682A (ru) * 2005-10-04 2007-04-10 Наталь Владимировна Глазова (RU) Способ выделения и очистки цитохрома c
RU2388819C2 (ru) * 2008-06-25 2010-05-10 Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) Способ получения пероксидазы хрена

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2021372C1 (ru) * 1991-04-30 1994-10-15 Глазова Наталья Владимировна Способ получения гидролитических ферментов
RU2126044C1 (ru) * 1995-02-23 1999-02-10 Наталия Владимировна Глазова Способ получения гиалуронидазы
RU2005130682A (ru) * 2005-10-04 2007-04-10 Наталь Владимировна Глазова (RU) Способ выделения и очистки цитохрома c
RU2388819C2 (ru) * 2008-06-25 2010-05-10 Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФГУН ГНЦ ПМБ) Способ получения пероксидазы хрена

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ГЛАЗОВА Н. В. И ДР. Оптимизация процесса сорбции ДНК-азы и Цитохрома С из их смеси // Сорбционные и хроматографические процессы, 2011, т. 11, вып. 6, с. 820-827. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2013144910A (ru) 2015-04-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111164090A (zh) 用于从微生物发酵纯化中性母乳寡糖(hmo)的方法
US20230217981A1 (en) High Purity Protein Preparation from Plant Material and Products Thereof
Luding et al. Isolation of lysozyme from chicken egg white using polyacrylamide-based cation-exchange cryogel
CN111944866B (zh) 连续旋蒸脱溶双酶解制备牦牛皮小分子胶原蛋白肽的方法
CN104130319B (zh) 一种藻红蛋白的提取方法
CN112708702A (zh) 一种生产植物源d-塔格糖的方法
CN112979756A (zh) 达托霉素的提纯方法
CN102295700A (zh) 绿豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法及在鱼糜制品生产中的应用
CN109385414B (zh) 菠萝蛋白酶的纯化方法
RU2570631C2 (ru) Способ получения пероксидазы
RU2390253C1 (ru) Способ получения лактоферрина из молочного сырья
Sanogo et al. Purification of αs1-casein by fast protein liquid chromatography
CN105399816A (zh) 一种从转基因山羊乳汁中分离人乳铁蛋白的方法
RU2225441C1 (ru) Способ получения препарата коллагеназы
KR101928953B1 (ko) 토마토 유래 폴리갈락투로나아제 전구체의 분리 및 정제 방법
JPS6160050B2 (ru)
PL85201B1 (ru)
SU654612A1 (ru) Способ выделени цитохрома
US4072667A (en) Process for recovering microbial cellular proteins
RU2186848C1 (ru) Способ выделения супероксиддисмутазы
CN104593340B (zh) 一种从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法
Camperi et al. Study of variables involved in fungal pectic enzyme fractionation by immobilized metal ion affinity chromatography
CN102875607B (zh) 一种棉籽糖的分离纯化方法
RU2658605C2 (ru) Способ получения гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота
CN106699837A (zh) 啤酒废酵母制备多肽的方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20151008