CN104593340A

CN104593340A - 一种从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法

Info

Publication number: CN104593340A
Application number: CN201510019875.0A
Authority: CN
Inventors: 贠军贤; 潘毛毛; 姚善泾; 林东强; 张颂红; 陈良; 代斌
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2015-01-15
Filing date: 2015-01-15
Publication date: 2015-05-06
Anticipated expiration: 2035-01-15
Also published as: CN104593340B

Abstract

一种从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，属于生物化工技术领域。所述方法是以牛乳清为原料液，以具有多级次孔隙的阳离子交换嵌合型复合晶胶为分离介质，通过晶胶层析，经床柱平衡、上样吸附、缓冲溶液冲洗、含盐洗脱液分步洗脱、后续脱盐和冷冻干燥等常规处理，分离获得纯度达98%的高纯度乳过氧化物酶，收率可达92%。所述阳离子交换嵌合型复合晶胶介质对乳清中常规层析难以分开的乳铁蛋白和乳过氧化物酶有很好的选择性。所述方法步骤少，操作简单，分离迅速，成本低，所得乳过氧化物酶纯度和收率高，在乳清高值化利用及活性蛋白质的分离方面具有广阔的应用前景。

Description

一种从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法。

背景技术

乳过氧化物酶是哺乳动物乳腺、唾液腺、泪腺等分泌的一种氧化还原酶，具有参与机体抗菌、降解胺类和酚类等有害物质以及保护细胞被过氧化等多种功能，在生物技术、乳品和肉类等食品的保鲜与冷藏、日用品如牙膏等领域有重要应用。乳清是乳品工业中的副产物，其高值化利用是多年来全球一直普遍关注的问题。牛乳清中乳过氧化物酶含量较高，是工业中获得乳过氧化物酶的重要来源。

然而，乳清中蛋白质种类繁多，现有的分离方法如亲和层析、疏水层析、阳离子交换膜分离或者通过超滤、浓缩、脱盐与离子交换树脂吸附等的分离方法，部分技术已得到了应用。但是，这些方法常常遇到诸如分离过程复杂、步骤多、成本高、或者所得乳过氧化物酶中含有乳铁蛋白杂质等问题。因此，需要研究从乳清中快速分离乳过氧化物酶的新方法。

近几年出现的晶胶层析生物分离方法，以具有超大孔隙的晶胶为分离介质，可以快速从复杂料液流体中分离生物活性大分子。文献（Billakanti J.M. 和Fee C.J., Biotechnol. Bioeng. 2009，103：1155–1163）曾用带羧基功能基团的聚丙烯酰胺基阳离子交换晶胶介质，通过层析方法从牛乳和乳清中分离乳铁蛋白，所得乳铁蛋白纯度90%，收率85%；但是，由于乳铁蛋白和乳过氧化物酶的等电点和分子量很接近，用现有带羧基的阳离子交换晶胶难以实现选择性分离。至目前，尚没有利用晶胶层析从乳清、脱脂乳、均脂乳等料液中对乳过氧化物酶进行分离的研究报道。因此，探索适于从牛乳或乳清中分离乳过氧化物酶的新方法，具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明目的是提供一种从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法。

所述的一种从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于以具有多级次孔隙的阳离子交换嵌合型晶胶为分离介质，通过晶胶层析实现分离从牛乳清中分离乳过氧化物酶。

所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于所述分离方法包括以下步骤：

1）以缓冲溶液对阳离子交换嵌合型晶胶床柱进行平衡；

2）以用缓冲溶液稀释后的乳清作为上样液，通过阳离子交换嵌合型晶胶床柱进行层析，使乳过氧化物酶吸附于晶胶骨架，而其它杂质和未吸附的杂蛋白顺利穿过晶胶床层；

3）用缓冲溶液进行冲洗，除去晶胶孔隙内未被吸附的杂质；

4）用含盐洗脱液进行分步洗脱，收集含乳过氧化物酶的洗脱峰，经脱盐和冷冻干燥处理后得到乳过氧化物酶。

所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于所用阳离子交换嵌合型晶胶为内嵌纤维素微球的聚甲基丙烯酸羟乙酯嵌合型晶胶分离介质，带有磺酸基阳离子交换功能基团。

所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于内嵌纤维素微球的聚甲基丙烯酸羟乙酯嵌合型晶胶分离介质具有适于乳清料液在较高流速下穿过床层及乳过氧化物酶迅速吸附层析的多级次孔隙，孔隙孔径为0.1～300μm。

所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，其pH为5.8～9，浓度为10～50mM。

所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于乳清上样液的稀释倍数2～5倍，优选为3倍。

所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于吸附层析的较高流速为0.5～10 cm/min，优选为1 cm/min。

所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于步骤4）中所述含盐洗脱液为含0.05～2M NaCl的缓冲溶液。

所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于所述缓冲溶液为10mM的磷酸盐缓冲溶液，其pH为 5.8。

所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于步骤4）中所述分步洗脱分为四步洗脱，四步洗脱所用含盐洗脱液依次为含0.075 M、0.15 M、1 M和2M NaCl的磷酸盐缓冲溶液，NaCl的磷酸盐缓冲溶液的pH为5.8。

通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1）本发明的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其步骤少、操作简单、成本低，所用洗脱液及缓冲溶液都是很容易配置的常规液，且分离过程迅速，可以实现快速分离，规模化分离容易实现，具有广阔的应用前景；

2）本发明采用了生物安全性优良的嵌合型晶胶分离介质，在分离环境下很稳定，可重复利用，使得分离所得的乳过氧化物酶产品具有很好的安全性；

3）本发明采用的嵌合型晶胶中内嵌有多孔纤维素微球，与周围晶胶骨架形成了同时具备扩散传质吸附小孔和对流传质超大孔的多级次孔隙网络，与现有其它离子交换或亲和晶胶介质不同，为乳清顺利通过床层和乳过氧化物酶的高效吸附和层析创造了很好的条件；

4）本发明提供的嵌合型晶胶介质的磺酸基阳离子交换基团，对用常规阳离子交换介质或晶胶介质难以分开的乳铁蛋白和乳过氧化物酶可以进行很好的区分，在本发明提供的优选条件下对乳过氧化物酶有很好的选择性，所得乳过氧化物酶的纯度高达98%，分离收率可达92%以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

取直径10 mm、高40 mm、内嵌纤维素晶胶微球(平均粒径约900 μm，占晶胶基质骨架的质量比为25%)、带磺酸基功能基团的聚甲基丙烯酸羟乙酯阳离子交换嵌合型晶胶介质床柱（有效孔隙率84%，最大孔隙率95%，孔径约0.1～300 μm，对溶菌酶模型蛋白的吸附容量1.1 mg/mL），以20 mM pH 5.8的磷酸盐（Na₂HPO₄/NaH₂PO₄）溶液为缓冲溶液，用30 mL缓冲溶液对阳离子交换嵌合型晶胶床柱进行平衡；取8 mL 乳清，用缓冲溶液稀释2倍，以10 cm/min流速上样，然后用缓冲溶液冲洗除去未吸附的杂质，分别用0.05、0.5、2 M的NaCl洗脱液（缓冲溶液配置）进行分步洗脱，收集目标洗脱峰，经脱盐和冷冻干燥，得到乳过氧化物酶。经SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳检测纯度约98%，回收率40%。

实施例2

取直径10 mm、高38 mm、内嵌纤维素晶胶微球(平均粒径约900 μm，占晶胶基质骨架的质量比为25%)、带磺酸基功能基团的聚甲基丙烯酸羟乙酯阳离子交换嵌合型晶胶介质床柱（有效孔隙率83%，最大孔隙率94%，孔径约0.1～300μm，对溶菌酶模型蛋白的饱和吸附容量5 mg/mL），以10 mM pH 6 的磷酸盐（Na₂HPO₄/NaH₂PO₄）溶液为缓冲溶液，用45 mL缓冲溶液对该阳离子交换嵌合型晶胶床柱进行平衡；取4 mL 乳清，用缓冲溶液稀释4倍，以0.5 cm/min流速上样，然后用缓冲溶液冲洗除去未吸附的杂质，分别用0.05、0.5、2 M的NaCl洗脱液（缓冲溶液配置）进行分步洗脱，收集目标洗脱峰，经脱盐和冷冻干燥，得到乳过氧化物酶。经SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳检测纯度约97 %，回收率 92 %。

实施例3

取直径10 mm、高52 mm、内嵌纤维素晶胶微球(平均粒径约900 μm，占晶胶基质骨架的质量比为30%)、带磺酸基功能基团的聚甲基丙烯酸羟乙酯阳离子交换嵌合型晶胶介质床柱（有效孔隙率80%，最大孔隙率94%，孔径约0.1～300μm，对溶菌酶模型蛋白的吸附容量3.4 mg/mL），以10 mM pH 9的甘氨酸-氢氧化钠溶液为缓冲溶液，用20 mL缓冲溶液对阳离子交换嵌合型晶胶床柱进行平衡；取5.1 mL 乳清，用缓冲溶液稀释3倍，以1 cm/min流速上样，然后用缓冲溶液冲洗除去未吸附的杂质，分别用0.075、0.15、1、2 M的NaCl洗脱液（缓冲溶液配置）进行分步洗脱，收集目标洗脱峰，经脱盐和冷冻干燥，得到乳过氧化物酶。经SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳检测纯度约98%，回收率49%。

实施例4

取实施例3所用阳离子交换嵌合型晶胶，用50 mL磷酸盐（Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，10 mM pH=5.8）溶液为缓冲溶液，对阳离子交换嵌合型晶胶床柱进行平衡；取5.2 mL 乳清，用缓冲溶液稀释3倍，以1 cm/min流速上样，然后用缓冲溶液冲洗除去未吸附的杂质，分别用0.075、0.15、1和2 M的NaCl洗脱液（缓冲溶液配置）进行分步洗脱，收集目标洗脱峰，经脱盐和冷冻干燥，得到乳过氧化物酶。经SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳检测纯度约98%，回收率92%。

实施例5

取实施例3所用阳离子交换嵌合型晶胶，用30 mL磷酸盐（Na₂HPO₄/NaH₂PO₄，10 mM pH=6.7）溶液为缓冲溶液，对阳离子交换嵌合型晶胶床柱进行平衡；取5.2 mL 乳清，用缓冲溶液稀释3.2倍，以1 cm/min流速上样，然后用缓冲溶液冲洗除去未吸附的杂质，分别用0.2、0.98和2 M的NaCl洗脱液（缓冲溶液配置）进行分步洗脱，收集目标洗脱峰，经脱盐和冷冻干燥，得到乳过氧化物酶。经SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳检测纯度约97%，回收率79%。

Claims

1.一种从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于以具有多级次孔隙的阳离子交换嵌合型晶胶为分离介质，通过晶胶层析实现分离从牛乳清中分离乳过氧化物酶。

2.如权利要求1所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于所述分离方法包括以下步骤：

1）以缓冲溶液对阳离子交换嵌合型晶胶床柱进行平衡；

3）用缓冲溶液进行冲洗，除去晶胶孔隙内未被吸附的杂质；

3.如权利要求1或2所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于所用阳离子交换嵌合型晶胶为内嵌纤维素微球的聚甲基丙烯酸羟乙酯嵌合型晶胶分离介质，带有磺酸基阳离子交换功能基团。

4.如权利要求3所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于内嵌纤维素微球的聚甲基丙烯酸羟乙酯嵌合型晶胶分离介质具有适于乳清料液在较高流速下穿过床层及乳过氧化物酶迅速吸附层析的多级次孔隙，孔隙孔径为0.1～300μm。

5.如权利要求2所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，其pH为5.8～9，浓度为10～50mM。

6.如权利要求2所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于乳清上样液的稀释倍数2～5倍，优选为3倍。

7.如权利要求4所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于吸附层析的较高流速为0.5～10 cm/min，优选为1 cm/min。

8.如权利要求2所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于步骤4）中所述含盐洗脱液为含0.05～2M NaCl的缓冲溶液。

9.如权利要求2所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于所述缓冲溶液为10mM的磷酸盐缓冲溶液，其pH为 5.8。

10.如权利要求8所述的从牛乳清中分离乳过氧化物酶的方法，其特征在于步骤4）中所述分步洗脱分为四步洗脱，四步洗脱所用含盐洗脱液依次为含0.075 M、0.15 M、1 M和2M NaCl的磷酸盐缓冲溶液，NaCl的磷酸盐缓冲溶液的pH为5.8。