CN104450639A - 一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法，本发明以牛乳清为原料，采用双水相萃取技术，使牛乳清中的乳过氧化物酶全部富集到盐相，盐相溶液经超滤膜去除小的杂蛋白，进一步纯化乳过氧化物酶，通过透析袋脱盐处理，然后冷冻干燥，从而制备出高活性的可用于天然食品添加剂的乳过氧化物酶产品。采用本发明的方法可以直接制得具有天然抗菌活性的乳过氧化物酶，可以将其作为天然防腐剂直接加入到食品或牙膏等日常用品中。

Description

一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法

技术领域

本发明涉及一种提取乳过氧化物酶的方法，特别涉及一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法。本发明属于乳过氧化物酶的提取制备技术领域。

背景技术

乳过氧化物酶(LP)是存在于动物乳中的一种天然抗菌物质，在有过氧化氢存在的条件下，乳过氧化物酶能够催化硫氰酸盐形成抗菌介质，LP的生物学意义是参与自然宿主抵御对微生物的入侵，对动物哺乳期的乳腺和新生婴儿的肠道病原微生物起到保护作用，LP是由一个包含612个氨基酸的单一多肽链组成，分子量约为85kDa，等电点为8.0-8.5，在牛乳中的含量为10-30mg/mL，在文献中已经证明了LP是食品中存在的天然防腐剂并且是安全的。

乳过氧化物酶体系在食品行业中应用最广泛的是乳制品，在过去几十年里，国内外学者报道了从原料乳中提取LP的方法，有色谱技术、膜色谱等。色谱技术主要包括离子交换、分子筛、免疫亲和色谱等，膜色谱应用较多的是离子交换吸附膜。虽然传统这些色谱法提取LP纯度较高，但是仍有很多缺点，例如耗时较长，回收率较低及成本昂贵，并不适宜大量生产乳过氧化物酶。想要高效率的从牛乳清中提取LP并不是一个简单的任务，因为乳清中存在大量的杂蛋白，给分离带来了困难，因此迫切的需要一个效率高、成本低、开发潜力大的从乳清中分离LP的方法。

与一些传统的分离方法相比，双水相萃取技术所使用的分离设备简单、条件温和、操作简单，且其获得产品的回收率和纯度较高。目前，双水相萃取技术已广泛地应用于蛋白质、酶、核酸等生物产品的分离和纯化，以及药物有效成分的提取，并逐步向工业化生产迈进。双水相萃取体系是由两种聚合物或是一种聚合物和一种盐组成的，其原理是依据物质在两相间的选择性分配，当物质进入双水相体系后，由于生物分子量大小、电荷作用和各种力(如疏水键、氢键和离子键等)的存在和环境的影响作用，使其在上相和下相中的浓度不同。对于某一物质，只要选择合适的双水相体系，控制一定的条件，就可以得到合适的分配系数，从而达到分离纯化之目的。它为生物分子提供生物兼容的环境，具有连续操作空间，易于扩大生产的优点，并且对环境无害。国内研究报道了利用双水相法提取脂肪酶、糖化酶、淀粉酶等工艺方法，但是目前还没有应用双水相法提取乳过氧化物酶的报道。本发明利用双水相技术并结合超滤方法，建立了快速、高效率、低成本的乳过氧化物酶分离提取技术，能够满足工业化大规模生产的要求。

超滤膜分离技术具有能耗低、分离过程中物质不发生相变、分离效果好、操作简便、无副作用、无二次污染、分离产物易于回收等优点，已被广泛应用于工业生产中的产品分离、纯化等。将膜分离技术应用于乳过氧化物酶纯化处理，为充分开发利用乳过氧化物酶提供了一种行之有效的方法。因此本发明采用超滤膜分离技术，进一步纯化双水相萃取得到乳过氧化物酶，为工业化生产乳过氧化物酶提供了科学依据。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种可以用于工业化生产高回收率和高纯化倍数的，且可用于食品工业的乳过氧化物酶的提取方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

以牛乳清为原料，以双水相萃取技术为提取手段，确定双水相萃取技术中最佳盐相和聚合物的选择以及其各自最佳用量、体系pH的工艺条件，并用超滤技术进行进一步纯化，最后透析脱盐和冷冻干燥制得成品，即原料乳清→双水相提取乳过氧化酶→收集富集乳过氧化物酶的盐相溶液→盐相溶液使用超滤分离→离心后收集截留溶液→透析脱盐→冷冻干燥→乳过氧化物酶粗产品。

具体的，本发明的一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法，其特征包含以下步骤：

(1)双水相萃取乳过氧化物酶：

除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，直接向乳清中连续添加聚乙二醇(PEG)和盐并将其置于搅拌器上不断搅拌，直至聚乙二醇和盐完全溶解于乳清中，其中聚乙二醇的分子量为6000Da，盐为MgSO₄，聚乙二醇的终浓度为12-16％(w/w)和MgSO₄的终浓度为10％-14％(w/w)，使用NaOH调节体系pH至8.0-9.0，静止，待两相完全分离，收集体系的下相，即盐相部分；

(2)超滤：

将收集的盐相溶液，使用HCl调节pH至6.5-7.5，用超滤膜进行超滤分离，以除去杂蛋白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的；

(3)脱盐处理：

将步骤(2)收集的截留溶液装入透析袋内进行脱盐；

(4)干燥：

将脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。

在本发明中，优选的，步骤(1)中PEG 6000的终浓度为16％(w/w)。

在本发明中，优选的，步骤(1)中MgSO₄的终浓度为10％(w/w)。

在本发明中，优选的，步骤(1)中使用NaOH调节体系pH至8.5。

在本发明中，优选的，步骤(2)中使用分子量30-50kDa的超滤膜进行超滤分离，以除去部分分子量小于30-50kDa的杂蛋白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的。更优选的，步骤(2)中超滤所使用的超滤膜的分子量为30kDa。

在本发明中，优选的，步骤(3)中将步骤(2)收集的截留溶液装入分子量为2-14kDa的透析袋内进行脱盐，每隔1-2h更换一次去离子水，透析6-8h即可。

采用本发明方法提取得到的乳过氧化物酶粗产品为乳白色粉状物，乳过氧化物酶酶活回收率和纯化倍数分别达到130-150％和3.20-3.70倍。

通过上述提取方法可以直接获得回收率较高的乳过氧化物酶，可以直接制得天然的抗菌介质乳过氧化物酶制品，也可以将其制品作为天然防腐剂直接加入到食品和牙膏等日用品中。

附图说明

图1为SDS-PAGE电泳图谱分析；

注：泳道1为标准物质Marker图谱，泳道2为乳清，泳道3为双水相提取后的乳过氧化物酶，泳道4为经过50kDa分子量超滤后的乳过氧化物酶；图谱左侧的一列数字代表Marker的分子量(单位：kD)；

图2为PEG分子量对LP分离效果的影响；

注：同一曲线标注无相同字母者差异显著(p<0.05)；

图3为盐相对LP的酶活回收率和纯化倍数影响；

1硫酸镁，2硫酸铵，3磷酸钠，4磷酸钾，5柠檬酸钠，6柠檬酸铵；

注：同一曲线标注无相同字母者差异显著(p<0.05)；

图4为PEG6000含量对LP分离效果的影响；

注：同一曲线标注无相同字母者差异显著(p<0.05)；

图5为MgSO₄含量对LP分离效果的影响；

注：同一曲线标注无相同字母者差异显著(p<0.05)；

图6为pH对LP分离效果的影响。

注：同一曲线标注无相同字母者差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1乳过氧化物酶的提取

(1)双水相萃取乳过氧化物酶：

除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，向容器中加入适量的乳清，直接向乳清中连续添加PEG和盐并将其置于搅拌器上不断搅拌，直至PEG和盐完全溶解于乳清中，形成双水相体系。其中PEG分子量为6000Da，盐为MgSO₄，PEG的终浓度为16％(w/w)，MgSO₄的终浓度为10％(w/w)，使用1mol/LNaOH调节体系pH至8.5，静止约30min，待两相完全分离，收集体系的下相，即盐相部分。

(2)超滤：将收集的盐相溶液体系使用1mol/L HCl调节pH至7左右，取适量盐相溶液置于分子量30kDa的超滤膜，进行超滤分离，除去部分分子量小于30kDa的杂蛋白，收集超滤膜所得的截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的；

(3)脱盐处理：将上述截留溶液装入分子量10kDa透析袋内进行脱盐，每隔1-2h更换一次去离子水，透析6-8h；

(4)干燥：将脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。

结果验证：

1、SDS-PAGE电泳图谱分析：

蛋白标准品、牛乳清和双水相提的乳过氧化物酶的SDS-PAGE图谱见图1，由图1可以看出牛乳清所在泳道处有很多条带，即含有多种蛋白质成分；乳清经过双水相萃取后电泳条带减少，同时双水相萃取结合超滤分离后的电泳条带也明显减少，所获得的条带接近报道的LP分子量为85kDa左右，这表明本发明的一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法是分离乳过氧化物酶的有效方法。

2、乳过氧化酶的酶活测定

取3mL浓度为1mmol/L的ABTS(溶于0.1mol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液)至反应试管中，然后加入0.1mL的浓度为3.2mmol/L的H₂O₂，再加入适当稀释的反应酶液0.1mL(用0.1mol/L pH 6.0的磷酸盐缓冲溶液稀释)，充分混合后，开始计时，反应2min后立即测定吸光度值，在波长为412nm处，以ABTS和适当稀释酶液的混合液为空白对照组(在室温条件下)。LP的酶活力单位是U/mL，公式为：

酶活力＝△A₄₁₂×V×S/ε×V1×D×2

式中△A₄₁₂为2min吸光度的变化，V为反应液的总体积，S为样品酶液的稀释倍数，V1是样品酶液的添加体积，D是光路径为1cm，2代表时间是2min，ε＝32.4mmol/L^-1.cm^-1。

结果表明采用本发明方法提取得到的乳过氧化物酶粗产品为乳白色粉状物，乳过氧化物酶的酶活回收率达到150％。

3、乳过氧化物酶的酶活性回收率和纯化倍数的计算

$\mathrm{AR}=\frac{\left(\mathrm{Ls}\right)\mathrm{Vs}}{\left(\mathrm{Li}\right)\mathrm{Vi}}\&times;100$

式中AR为LP的酶活回收率，Ls和Li分别代表盐相溶液和乳清中LP酶活，Vs和Vi分别代表盐相溶液体积和乳清体积。

$\mathrm{PF}=\frac{\left(\mathrm{Ls}\right)\mathrm{Pi}}{\left(\mathrm{Li}\right)\mathrm{Ps}}$

式中PF为纯化倍数，Ls和Li分别代表盐相溶液和乳清中LP酶活，Ps和Pi分别代表盐相溶液和乳清中蛋白浓度。

结果表明采用本发明方法提取得到的乳过氧化物酶粗产品为乳白色粉状物，乳过氧化物酶酶的纯化倍数达到3.60倍。

实施例2乳过氧化物酶的提取

(1)双水相萃取乳过氧化物酶：

除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，向容器中加入适量的乳清，直接向乳清中连续添加PEG和盐并将其置于磁力加热搅拌器上不断搅拌，直至PEG和盐完全溶解于乳清中，形成双水相体系。其中PEG的分子量为6000Da，盐为MgSO₄，PEG的终浓度为14％(w/w)，MgSO₄的终浓度为12％(w/w)，使用1mol/L NaOH调节体系pH至8.0，于分液漏斗内静止约30min待两相完全分离，收集体系的下相，即盐相部分。

(2)超滤：将收集的乳过氧化物酶的盐相溶液体系使用1mol/L HCl调节pH至7左右，取适量盐相溶液置于分子量50kDa的超滤膜，进行超滤分离，除去部分分子量小于50kDa的杂蛋白，收集超滤膜所得截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的；

(3)脱盐处理：将上述截留溶液装入分子量5kDa透析袋内进行脱盐，每隔1-2h更换一次去离子水；

(4)干燥：将脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。

结果验证：

酶活回收率和纯化倍数的的具体计算公式如实施例1所述。

结果表明采用本发明方法提取得到的乳过氧化物酶粗产品为乳白色粉状物，乳过氧化物酶酶活回收率和纯化倍数分别达到140％和3.50倍。

试验例1不同聚乙二醇(PEG)分子量形成双水相体系对LP分离效果的影响

双水相中盐相选用浓度为16％(w/w)的磷酸钾，在PEG-磷酸钾体系中，研究不同PEG分子量对LP的酶活回收率和纯化倍数的影响，其余步骤同实施例1，酶活回收率和纯化倍数的具体计算公式如实施例1所述。

PEG分子量对LP分离效果的影响如图2所示。从图2试验结果可知，LP主要聚集在盐相中，随着PEG分子量的增加，LP酶活回收率和纯化倍数增加，当PEG分子量超过6000时，LP酶活回收率呈显著降低(P<0.05)，当PEG分子量为6000Da时，LP酶活回收率和纯化倍数达到最大，分别是97.61％和1.142。当PEG分子量增加时，会降低上相的体积，使杂蛋白都分布到下相中，结果导致LP的纯度降低。基于以上结果，本发明使用PEG 6000作为聚合物，形成双水相体系。

试验例2不同盐相形成双水相体系对LP分离效果的影响

为筛选出最适合分离LP的双水相体系，盐相选择硫酸镁、硫酸铵、磷酸钠、磷酸钾、柠檬酸钠，以及柠檬酸铵构成不同双水相体系，研究不同盐相种类对LP酶活回收率和纯化倍数的影响，PEG 6000和盐用量均为总体质量16％。其余步骤同实施例1，酶活回收率和纯化倍数的具体计算公式如实施例1所述。

盐相对LP的酶活回收率和纯化倍数影响如图3所示。从图3试验结果可知，磷酸钠对LP的纯化倍数最低，仅有0.9倍，柠檬酸钠对LP酶活回收率最低，仅是43.53％，这两种盐对LP的分离效果均较差，和其余盐相相比，选择硫酸镁时，LP酶活回收率和纯化倍数最高，分别128.3％和1.46倍，和其他盐差异显著(P<0.05)，基于上述结果，双水相选择硫酸镁作为盐相。酶活回收率高于100％的原因可能是在纯化的过程中消除了影响乳过氧化物酶活性的蛋白质而增强了LP酶活回收率，类似的结果在一些酶的提取和纯化研究中也出现过。

试验例3PEG6000含量对LP分离效果的影响

在盐相使用16％(w/w)的硫酸镁，与10％～20％(w/w)质量浓度的PEG 6000构成双水相条件下，研究不同质量浓度PEG 6000对LP酶活回收率和纯化倍数的影响，其余步骤同实施例1，酶活回收率和纯化倍数的具体计算公式如实施例1所述。

PEG 6000含量对LP分离效果的影响如图4所示。由图4试验结果可知，随着PEG 6000含量的增加，直到PEG 6000含量为16％(w/w)时LP酶活回收率和纯化倍数都显著增加(P<0.05)，PEG 6000含量为16％(w/w)时，构成双水相体系使LP酶活回收率和纯化倍数达到最大，分别为117.6％和1.51倍，当PEG 6000含量超过16％(w/w)时，LP酶活回收率和纯化倍数均有所下降。因此，优选16％(w/w)含量的PEG 6000组成双水相体系。

试验例4MgSO₄含量对LP分离效果的影响

在16％(w/w)的PEG 6000与10％～20％(w/w)的硫酸镁构成双水相体系中，研究不同含量的MgSO₄对LP酶活回收率和纯化倍数的影响，其余步骤同实施例1，酶活回收率和纯化倍数的具体计算公式如实施例1所述。

MgSO₄含量对LP分离效果的影响结果如图5所示。由图5试验结果可知，随着硫酸镁含量的增加，LP酶活回收率和纯化倍数呈下降趋势，当硫酸镁含量在10～14％(w/w)之间，LP酶活回收率和纯化倍数呈缓慢下降趋势，当硫酸镁浓度超过16％(w/w)，LP酶活回收率和纯化倍数均显著下降(P<0.05)。含量为10％(w/w)的硫酸镁时，LP酶活回收率和纯化倍数最大，硫酸镁含量为10％和12％(w/w)时，乳过氧化物酶的纯化倍数差异不显著(P>0.05)，所以构成双水相体系中硫酸镁最佳含量在10％～14％(w/w)，从节省盐用量角度考虑，本发明优选10％(w/w)含量的硫酸镁，作为双水相体系中的盐相。

试验例5pH对LP分离效果的影响

在16％(w/w)的PEG 6000和10％(w/w)的硫酸镁的双水相体系中，使用1mol/L氢氧化钠，调节双水相体系中的pH值从5变化到9，研究双水相体系不同pH对LP酶活回收率和纯化倍数的影响，其余步骤同实施例1，酶活回收率和纯化倍数的具体计算公式如实施例1所述。

试验结果见图6所示。由图6试验结果可知，随着pH的增加，LP酶活回收率和纯化倍数呈上升趋势，当pH为8-8.5时，LP酶活回收率和纯化倍数呈现显著上升趋势，但当pH超过8.5，LP酶活回收率和纯化倍数均显著下降(P<0.05)。当pH等于8.5时，LP酶活回收率和纯化倍数最大，所以双水相体系的pH最佳范围在8.0-9.0，更优选的，双水相体系的pH为8.5。

试验例6超滤法对LP酶活回收率和纯化倍数的影响

使用超滤膜对双水相提取出的LP进一步纯化处理，研究超滤法对LP酶活回收率和纯化倍数的影响，其余步骤同实施例1，酶活回收率和纯化倍数的具体计算公式如实施例1所述。试验结果如下表1所示：

表1 超滤法对LP酶活回收率和纯化倍数的影响

注：表中同行字母相同代表差异不显著(P>0.05)，不相同代表差异显著(P<0.05)。

为了进一步纯化富集在盐相中的LP而使用超滤法，分别选用了分子量30kDa和50kDa的超滤膜，使LP的纯化倍数由1.99分别增加到3.579和3.701，两种分子量的超滤膜分离，对LP纯化倍数的差异并不显著，使用分子量50kDa的超滤膜，LP酶活回收率低于分子量30kDa的(P<0.05)。如表1所示，结果表明超滤膜确实除去了一部分杂蛋白，对双水相中的LP起到了提纯作用，而且选择分子量为30kDa的超滤膜的更加适合。

Claims (9)

1.一种采用超滤法辅助双水相萃取技术提取乳过氧化物酶的方法，其特征包含以下步骤：

(1)双水相萃取乳过氧化物酶：

除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，直接向乳清中连续添加聚乙二醇(PEG)和盐并将其置于搅拌器上不断搅拌，直至聚乙二醇和盐完全溶解于乳清中，其中聚乙二醇的分子量为6000Da，盐为MgSO₄，聚乙二醇的终浓度为12-16％(w/w)，MgSO₄的终浓度为10％-14％(w/w)，使用NaOH调节体系pH至8.0-9.0，静止，待两相完全分离，收集体系的下相，即盐相部分；

(2)超滤：

将收集的盐相溶液，使用HCl调节pH至6.5-7.5，用超滤膜进行超滤分离，以除去杂蛋白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的；

(3)脱盐处理：

将步骤(2)收集的截留溶液装入透析袋内进行脱盐；

(4)干燥：

将脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中PEG 6000的终浓度为16％(w/w)。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中MgSO₄的终浓度为10％(w/w)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中使用NaOH调节体系pH至8.5。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中使用分子量30-50kDa的超滤膜进行超滤分离，以除去部分分子量小于30-50kDa的杂蛋白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(2)中超滤所使用的超滤膜的分子量为30kDa。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中将步骤(2)收集的截留溶液装入分子量为2-14kDa的透析袋内进行脱盐，每隔1-2h更换一次去离子水，透析6-8h即可。

8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于步骤(2)中浓缩纯化乳过氧化物酶产品，其回收率为130-150％。

9.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于步骤(2)中浓缩纯化乳过氧化物酶产品，其纯化倍数为3.20-3.70。