CN103710417A - 一种从d-核糖发酵废料中提取多肽类物质的方法 - Google Patents

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徐勤华
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Abstract

本发明涉及多肽提取技术领域，具体涉及一种从D-核糖发酵废料中提取多肽类物质的方法。所述方法用超滤膜与生物酶法联用处理D-核糖发酵液中的杂蛋白并生产活性多肽。其方法步骤如下：发酵液微滤除菌，超滤收集蛋白，板框过滤得到滤饼。通过向板框过滤后的滤饼中加入溶解液的方法溶解盐蛋白和多肽类，混合物再用1000-1500u/g的木瓜蛋白酶处理，双水相体系萃取酶解液，萃取液用截留分子量5000-10000Da的超滤膜除去处理不到位的杂蛋白。滤液经脱盐，浓缩，喷雾干燥得到成品。本发明利用双水相萃取与酶解技术相结合处理发酵液中蛋白废渣，在获得主产物核糖的同时，可以获得有抗菌性的活性多肽。

Description

一种从D-核糖发酵废料中提取多肽类物质的方法
技术领域
本发明涉及多肽提取技术领域，具体涉及一种从D-核糖发酵废料中提取多肽类物质的方法。
背景技术
研究表明利用芽孢杆菌尤其是枯草芽孢杆菌进行生物防治或生产微生物杀菌剂以替代剧毒化学药品是一种可行的策略，枯草芽孢杆菌可以分泌高分子量的抗菌蛋白、低分子量的抗菌素和挥发性活性物质等三大类抗菌物质。其中非核糖体途径合成的脂肽类抗生素在多数菌株中被合成，是拮抗活性作用的主要成分。抗菌素是在芽孢杆菌对数生长末期尚未形成芽孢时产生的，在稳定前期活性最高，分子量通常比一般的蛋白小，大都含有一些稀有氨基酸，分子结构一般为环肽。枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质大多为低分子抗菌肽，分子量在1000-5000Da。
    由于D-核糖发酵采用枯草芽孢杆菌，在获得产物D-核糖的同时，很多副产物在预处理阶段被当作废物除去，其中包括大分子蛋白、多肽类物质和细菌素等。不仅造成环境污染，还是一种资源浪费。迄今为止工业上还没有一种工艺简单合理、适宜于大规模生产的从D-核糖发酵液中提取多肽物质的方法。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种易于生产操作，操作过程有害添加物少，附加值高的发酵废料利用方法。
为了实现本发明的目的，本发明一种从D-核糖发酵废料中提取多肽类物质的方法包括以下步骤：将废料经微滤除菌得到的发酵液，通过超滤得到蛋白和多肽物质的浓缩液，向浓缩液中按750-800mg/L加入聚氯化铝对蛋白和多肽絮凝，板框过滤得到蛋白滤渣；向蛋白废渣中加入8-10倍体积的溶解液溶解盐蛋白和多肽类得到蛋白混合液；调节蛋白混合液PH为中性，用1000-1500u/g的木瓜蛋白酶对蛋白混合物酶解2h；酶解液通过聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)双水相体系进行萃取；萃取液通过超滤除去处理不到位的杂蛋白，得到超滤液；超滤液用Sephadex G-25柱凝胶过滤层析或1%的离子交换树脂在60℃下搅拌30min脱盐，料液温度控制在30-40℃，采用反渗透进行浓缩；通过喷雾干燥得到成品多肽。
所述的溶解液为2-5%的氯化钠或12.6 - 13.0%的硫酸铵的水溶液。
所述的木瓜蛋白酶用量为2-4%，反应温度50-70℃。
所述的聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)双水相体系中PEG浓度为8.0-9.8%，Reppal PEG浓度为39.0-41.5%，萃取温度为25-35℃。
所述萃取液超滤所用的超滤膜为中空纤维超滤膜，截留分子量为5000-10000Da，操作压力0.3-0.4MPa，操作温度为25-35℃。
所述的喷雾干燥，入口温度100-105℃，出口温度50-55℃。
本发明利用双水相萃取与酶解技术相结合处理发酵液中蛋白废渣，在获得主产物D-核糖的同时，可以获得抗菌性的活性多肽，多肽的收率达到80%以上。活性多肽可广泛应用于食品防腐剂、新型医药饲料抗生素、植物病害防治等。因此，此工艺可以有效减少发酵废物，创造更多的经济效益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
将酸化后D-核糖发酵液2m3，通过膜过滤收集含有蛋白的浓缩液，按750-800mg/L加入聚氯化铝对浓缩液中蛋白和多肽絮凝，板框过滤得到蛋白与多肽的混合滤渣。用4%的氯化钠水溶液作为溶解液溶解滤渣中的部分多肽和蛋白，将蛋白混合物用氢氧化钠调节PH至中性，加入木瓜蛋白酶在60-70℃范围内保温，所用的生物酶为1000-1500u/g的木瓜蛋白酶，用量为2.0%。保温后得到酶解的多肽水溶液。在酶解液中加入8.0-9.8%的PEG4000与39.0-41.5%的Reppal PES所组成的双水相体系萃取，萃取温度25-35℃。
将上述萃取液通过截留分子量为10000Da的中空纤维超滤膜过滤，平均膜通量为230-240L/H。操作温度30-35℃，操作压力为0.3MPa，超滤的目的是除去处理不到位的杂蛋白，以及建立萃取体系过程中引入的杂质。
采用1%的离子交换树脂在60℃下搅拌30min脱盐，料液温度控制在30-40℃，反渗透进行浓缩，通过喷雾干燥得到成品多肽，入口温度100-105℃，出口温度50-55℃，得到多肽1.56Kg，收率81.70%。
实施例2
将酸化后D-核糖发酵液2m3，通过膜过滤收集含有蛋白的浓缩液，按750-800mg/L加入聚氯化铝对浓缩液中蛋白和多肽絮凝，板框过滤。用12.6 - 13.0%的硫酸铵水溶液作为溶解液溶解滤渣中的部分多肽和蛋白。将蛋白混合物用氨水调节PH至中性，加入碱性蛋白酶在30-50℃范围内保温，所用的生物酶为2000- 2500u/g的碱性蛋白酶，用量为0.2%。保温后得到酶解的多肽溶液。萃取按照实施例1 中后续提取方法进行，得到多肽1.53Kg，收率80.13%。
实施例3
将酸化后D-核糖发酵液2m3，通过膜过滤收集含有蛋白的浓缩液，按750-800mg/L加入聚氯化铝对浓缩液中蛋白和多肽絮凝，板框过滤。用3%的氯化钠水溶液作为溶解液溶解滤渣中的部分多肽和蛋白，将蛋白混合物用氢氧化钠调节PH至中性，加入木瓜蛋白酶在55-60℃范围内保温，所用的生物酶为1000-1500u/g的木瓜蛋白酶，用量为4.0%。保温后得到酶解的多肽水溶液。萃取体系同实施例1。
将上述萃取液通过截留分子量为5000Da的中空纤维超滤膜过滤，操作温度30-40℃，平均膜通量为180-200L/H。操作温度30-35℃，操作压力为0.3MPa，脱盐按照实施例1 中后续提取方法进行，得到多肽1.58Kg，收率82.75%。

Claims (6)

1.一种从D-核糖发酵废料中提取多肽类物质的方法，其特征在于它包括以下步骤：将废料进行微滤除菌得到的发酵液，通过超滤得到蛋白和多肽物质的浓缩液，向浓缩液中按750-800mg/L加入聚氯化铝对蛋白和多肽絮凝，板框过滤得到蛋白滤渣；向蛋白废渣中加入8-10倍体积的溶解液溶解盐蛋白和多肽类得到蛋白混合液；调节蛋白混合液PH为中性，用1000-1500u/g的木瓜蛋白酶对蛋白混合物酶解2h；酶解液通过聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)双水相体系进行萃取；萃取液通过超滤除去处理不到位的杂蛋白，得到超滤液；超滤液用Sephadex G-25柱凝胶过滤层析或1%的离子交换树脂在60℃下搅拌30min脱盐，料液温度控制在30-40℃，采用反渗透进行浓缩；通过喷雾干燥得到成品多肽。
2.根据权利要求1所述的一种从D-核糖发酵废料中提取多肽类物质的方法，其特征在于：所述的溶解液为2-5%的氯化钠或12.6 - 13.0%的硫酸铵的水溶液。
3. 根据权利要求1所述的一种从D-核糖发酵废料中提取多肽类物质的方法，其特征在于：所述的木瓜蛋白酶用量为2-4%，反应温度50-70℃。
4. 根据权利要求1所述的一种从D-核糖发酵废料中提取多肽类物质的方法，其特征在于：所述的聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)双水相体系中PEG浓度为8.0-9.8%，Reppal PEG浓度为39.0-41.5%，萃取温度为25-35℃。
5. 根据权利要求1所述的一种从D-核糖发酵废料中提取多肽类物质的方法，其特征在于：萃取液超滤所用的超滤膜为中空纤维超滤膜，截留分子量为5000-10000Da，操作压力0.3-0.4MPa，操作温度为25-35℃。
6. 根据权利要求1所述的一种从D-核糖发酵废料中提取多肽类物质的方法，其特征在于：所述的喷雾干燥，入口温度100-105℃，出口温度50-55℃。
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