CN103756981A - 离子液体用于螺旋藻Fe-SOD酶的提取 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超氧化物歧化酶的提取方法，特别设及一种从螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法。将螺旋藻原料进行机械粉碎，加入适量水浸泡放入超声波破碎机中对螺旋藻细胞进行破壁处理。利用离子液体、磷酸氢二钾及水形成的离子液体双水相体系对处理后螺旋藻液中的Fe-SOD进行选择性的萃取。萃取液经磷酸盐缓冲溶液反萃取得到超氧化物歧化酶的粗酶液。对粗酶液进行热变性法和凝胶柱层析法进行纯化，纯化后的酶液经浓缩后进行真空干燥得到超氧化物歧化酶精粉。离子液体双水相体系经反萃取分离出蛋白质和酶后，可以直接应用于下一次的萃取过程，多次重复利用不影响离子液体的萃取效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种超氧化物歧化酶的提取方法，特别设及一种从螺旋藻中提取含铁超氧化物歧化酶的方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)是一类广泛存在于生物体内的金属酶，是一种具有特定生物催化功能的蛋白质，由蛋白质和金属离子组成，它广泛存在于自然界的动物、植物以及一些微生物体内。1938年Keilin从牛血中分离出一种含Cu的血铜蛋白，1953年又从小牛肝、鲸肝分离出肝铜蛋白。目前，根据所含金属离子(辅基)的不同，SOD可分为以下四种类型：第一类为Cu/Zn-SOD，呈蓝绿色，相对分子量约为32k道尔顿，来源于动物血、猪肝、牛肝以及菠菜叶、面包酵母中，在某些原核生物中也存在；第二类为Mn-SOD，呈紫红色，相对分子量约为40k道尔顿，主要存在于原核细胞和真核细胞以及线粒体的基质中，在高等植物中的过氧化物酶体中也含有。第三类为Fe-SOD，呈黄褐色，相对分子量约为38.7k道尔顿，主要存在真核生物如藻类，部分高等植物如油菜、柠檬、菠萝、甜橙、番茄、银杏等体内也存在。第四类为Ni-SOD，是近年来才发现的一种新型SOD，目前只有从链球菌中分离得到，对其研究及报道较少。
人们最早从动物的血液中提取SOD制成产品，由于国际上疯牛病的蔓延，从动物血中提取的SOD，给人们在使用上带来一些危险因素。从藻类中提取SOD，使用安全性非常高。螺旋藻是一种富含蛋白质、维生素、必需氨基酸、矿物质和必需脂肪酸的丝状微藻，其细胞壁不是由纤维素组成，而是由一些多糖类物质构成，易于消化吸收，具有极高的营养价值。螺旋藻也是极易大规模工业化生产的微藻类之一。螺旋藻中富含超氧化物歧化酶，并且仅含有Fe-SOD，从其中提取Fe-SOD，不仅原料丰富，而且成本低。
很多研究表明，活性氧(O2 -、·OH、H2O2、1O2、ROO·)能与蛋白质、核酸和脂类发生反应，导致膜脂过氧化、碱基突变、DNA链的断裂和蛋白质的损伤等。在动物体，活性氧导致细胞坏死、过敏反应、癌变或其他病理过程。在植物体内，活性氧可导致植物代谢失活、细胞死亡、光和作用速率降低，甚至造成植物品质降低、产量下降等。超氧化物歧化酶是能够催化超氧阴离子自由基O2 -发生歧化反应，平衡机体代谢过程中产生的过多自由基，减轻或消除自由基对机体的危害，受到全世界学术界广泛关注，使之成为涉及分子生物学、微生物学、医学等学科领域及医药、化工、食品等生产行业的一个热门研究课题。超氧化物歧化酶也是近年来应用最广泛的酶，具有抗衰老、免疫调节、抑制肿瘤、调节血脂、抗辐射、消炎和美容等功效。
当两种聚合物(或一种聚合物与一种盐)溶于同一溶液时，由于聚合物溶液之间(或聚合物溶液与盐溶液之间)的不相溶性，使得当聚合物(或盐浓度)达到一定值时，就会形成互不相溶的两相，由于这两相中水的含量都很高，因此称为双水相系统。双水相萃取技术是由Albertsson于20世纪50年代后期开发的一种高效而温和的生物分离技术。70年代以后，众多科学家发展了双水相萃取技术在生物分离过程中的应用。离子液体是近年来迅速发展起来的一种全新绿色介质和功能材料。离子液体双水相萃取技术是近年来兴起的新的生物质分离技术，该体系一般是由亲水性离子液体、无机盐(如磷酸盐、碳酸盐、氢氧化物等)和水形成的双水相体系，它综合了离子液体和双水相体系的优点。作为一种高效的新型绿色分离体系，离子液体双水相具有分相时间短、粘度低、萃取过程不易乳化、萃取率高、分离条件温和、对生物活性物质不破坏、易于放大、且离子体系可以且易回收利用等优点，广泛用于生物活性物质的分离和纯化，如大多数酶和蛋白质等都能用双水相体系进行分离纯化。离子液体双水相萃取蛋白质机理属于液-液萃取，当蛋白质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同，即各成分在两相间的选择性分配，从而达到萃取分离的目的。蛋白质与离子液体作用，主要有盐析作用；与辅助盐萃取剂发生配位作用生成配合物，配合物被萃取到离子液体中；或者调节pH，使蛋白质的疏水基团暴露出来，从而萃取到离子液体中等。
本发明以螺旋藻为原料，采用离子液体双水相体系对螺旋藻中的Fe-SOD分离纯化，以期建立一种简便、高效的SOD分离纯化路线。
发明内容
本发明是为解决常规SOD粗提过程中，萃取剂对酶选择性较差且酶易变性失活的缺点，提出采用离子液体双水相体系高效选择性的萃取螺旋藻中的Fe-SOD。该技术生产方法简单易行，适合工业化生产过程。
本发明的技术方案由以下部分组成。
1)螺旋藻原料的预处理。对干燥螺旋藻原料进行机械粉碎，藻粉中加入10倍质量的水，温度为18-32℃时浸泡2-6h。浸泡结束后，将其放入超声波破碎机中，开启超声，对螺旋藻细胞进行破壁处理。
2)离子液体双水相萃取。将离子液体、K2HPO4按比例加入到进行破壁处理的螺旋藻液中，搅拌萃取30-90min，当体系出现明显分层时，萃取过程结束。过滤分离去除固体，液体部分进行静置分层，下层为含有蛋白质的离子液体层。
3)Fe-SOD酶的反萃取。将含有蛋白质的离子液体层进行分离后，向其中加入pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液，搅拌60-90min后，蛋白质溶解于缓冲溶液中，而与离子液体相分离，缓冲溶液层为粗酶液。分离后的离子液体层可以直接用于下一次萃取过程。
4)蛋白质的分离。将粗酶液缓慢升温至60℃，保温反应15-30min。降温至0-4℃，离心分离蛋白质，其滤液为Fe-SOD酶溶液。
5)Fe-SOD的纯化。将Fe-SOD酶溶液进行超滤和纳滤处理，所得滤液继续采用
Sephadex G-100凝胶柱子层析分离。层析液采用聚乙二醇(PEG-20000)浓缩后，进行真空干燥，得Fe-SOD酶精粉。
上述的离子液体为的阳离子部分为咪唑衍生物，阴离子部分为活性染料结构，其结构式如1所示。
式中R=-CH2CH2OH，-CH2CH2CH2OH，-CH2CHOHCH2OH。X为离子液体带负电荷活性染料部分，具有如式2所示的结构。
上述的离子液体双水相体系的构成为离子液体的质量浓度为20-35％，无机盐K2HPO4的质量浓度为17-25％。
本发明所采用的离子液体双水相体系萃取螺旋藻中的Fe-SOD酶，其在离子液体相的分配系数超过8.2，Fe-SOD能够快速进入离子液体层，获得的粗提液总活力超过4000U。在萃取过程中，离子液体只能够萃取蛋白质(包括藻蛋白和Fe-SOD)，但对螺旋藻中的多糖、脂肪等没有萃取能力，因此，离子液体双水相体系萃取蛋白质具有较高的选择性。离子液体双水相体系经反萃取分离出蛋白质和酶后，可以直接应用于下一次的萃取过程，多次重复利用不影响离子液体的萃取效率。
下面结合实例对本发明内容进行描述。
具体实施例
实施例1
1)螺旋藻原料的预处理。取1kg干燥钝顶螺旋藻藻粉中加入10.0L的水，温度为20℃时浸泡4h。浸泡结束后，将其放入频率为40kHz，功率为5000W超声波破碎机中，开启超声，使破碎机中的温度升高至40(2，对螺旋藻细胞进行破壁处理25min。
2)离子液体双水相萃取。将2.7kg离子液体、2.2kgK2HPO4加入到进行破壁处理的螺旋藻液中，搅拌萃取60min，当体系出现明显分层时，萃取过程结束。过滤分离去除固体，液体部分进行静置分层，下层为含有蛋白质的离子液体层。
3)Fe-SOD酶的反萃取。将含有蛋白质的离子液体层进行分离后，向其中加入pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液，搅拌60min后，蛋白质溶解于缓冲溶液中，而与离子液体相分离，得到粗酶液。
4)蛋白质的分离。将粗酶液缓慢升温至60℃，保温反应15min。降温至O-4℃，将透析液10000r/min离心20min后，离心分离藻蓝蛋白，留取上清液，其为Fe-SOD酶溶液。
5)Fe-SOD的纯化。将Fe-SOD酶溶液进行超滤和纳滤处理，所得滤液继续采用Sephadex G-100凝胶柱子层析分离。层析液采用聚乙二醇(PEG-20000)浓缩后，进行真空干燥，得Fe-SOD酶精粉。
经上述方法获得的SOD酶精粉的总活力4857U，纯化倍数达到58.4。其中离子液体双水相体系的损失率约为11.5％
实施例2
1)螺旋藻原料的预处理。取1kg新鲜钝顶螺旋藻进行机械破碎，加入2kg的水后，将其放入频率为40kHz，功率为5000W超声波破碎机中，开启超声，使破碎机中的温度升高至40℃，对螺旋藻细胞进行破壁处理15min。
2)离子液体双水相萃取。将实例1回收使用2次的离子液体双水相体系加入到进行破壁处理的螺旋藻液中，搅拌萃取60min，当体系出现明显分层时，萃取过程结束。过滤分离去除固体，液体部分进行静置分层，下层为含有蛋白质的离子液体层。
3)Fe-SOD酶的反萃取。将含有蛋白质的离子液体层进行分离后，向其中加入pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液，搅拌60min后，蛋白质溶解于缓冲溶液中，而与离子液体相分离，得到粗酶液。
4)蛋白质的分离。将粗酶液缓慢升温至60℃，保温反应15min。降温至0-4℃，将透析液10000r/min离心20min后，离心分离藻蓝蛋白，留取上清液，其为Fe-SOD酶溶液。
5)Fe-SOD的纯化。将Fe-SOD酶溶液进行超滤和纳滤处理，所得滤液继续采用Sephadex G-100凝胶柱子层析分离。层析液采用聚乙二醇(PEG-20000)浓缩后，进行真空干燥，得Fe-SOD酶精粉。
经上述方法获得的SOD酶精粉的总活力4786U，纯化倍数达到57.9。
实施例3
1)螺旋藻原料的预处理。取50g干燥钝顶螺旋藻藻粉中加入500mL的水，温度为20℃时浸泡4h。浸泡结束后，将其放入频率为40kHz，功率为4000W超声波破碎机中，开启超声对螺旋藻细胞进行破壁处理15min。
2)离子液体双水相萃取。将0.66kg离子液体、0.51kgK2HPO4加入到进行破壁处理的螺旋藻液中，搅拌萃取90min，当体系出现明显分层时，萃取过程结束。过滤分离去除固体，液体部分进行静置分层，下层为含有蛋白质的离子液体层。
3)Fe-SOD酶的反萃取。将含有蛋白质的离子液体层进行分离后，向其中加入pH值为7.2的磷酸盐缓冲溶液，搅拌90min后，蛋白质溶解于缓冲溶液中，而与离子液体相分离，得到粗酶液。
4)蛋白质的分离。将粗酶液缓慢升温至60℃，保温反应30min。降温至0-4℃，将透析液10000r/min离心30min后，离心分离藻蓝蛋白，留取上清液，其为Fe-SOD酶溶液。
5)Fe-SOD的纯化。将Fe-SOD酶溶液进行超滤和纳滤处理，所得滤液继续采用Sephadex G-100凝胶柱子层析分离。层析液采用聚乙二醇(PEG-20000)浓缩后，进行真空干燥，得Fe-SOD酶精粉。
经上述方法获得的SOD酶精粉的总活力4689U，纯化倍数达到51.8。
Claims (2)
1.离子液体用于螺旋藻Fe-SOD酶的提取方法，其特征在于离子液体、磷酸氢二钾及水形成双水相体系用于提取螺旋藻中的超氧化物歧化酶粗酶液，其中离子液体具有式(1)所示结构
2.根据权利要求1所述的离子液体用于螺旋藻Fe-SOD酶的提取方法，其特征在于离子液体双水相体系的构成为离子液体的质量浓度为20-35％，磷酸氢二钾的质量浓度为17-25％。
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