CN103740667A - 离子液体用于玉米sod酶的提取 - Google Patents
离子液体用于玉米sod酶的提取 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103740667A CN103740667A CN201410029481.9A CN201410029481A CN103740667A CN 103740667 A CN103740667 A CN 103740667A CN 201410029481 A CN201410029481 A CN 201410029481A CN 103740667 A CN103740667 A CN 103740667A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ionic liquid
- extraction
- corn
- sod
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 title claims abstract description 40
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 title claims abstract description 35
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 title claims abstract description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 30
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 title claims description 38
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title abstract description 39
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims abstract description 47
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract 3
- 229940032362 superoxide dismutase Drugs 0.000 claims description 27
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 25
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 39
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 39
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 12
- 239000000843 powder Substances 0.000 abstract description 8
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 7
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 abstract description 5
- 241000209149 Zea Species 0.000 abstract 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 abstract 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 abstract 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 abstract 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 abstract 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 abstract 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 abstract 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 abstract 1
- 238000004537 pulping Methods 0.000 abstract 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 21
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 5
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 4
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 3
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 2
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 1
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 1
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 101000836247 Aquifex pyrophilus Superoxide dismutase [Fe] Proteins 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 1
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 1
- 235000005976 Citrus sinensis Nutrition 0.000 description 1
- 240000002319 Citrus sinensis Species 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 244000241257 Cucumis melo Species 0.000 description 1
- 235000015510 Cucumis melo subsp melo Nutrition 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 235000011201 Ginkgo Nutrition 0.000 description 1
- 244000194101 Ginkgo biloba Species 0.000 description 1
- 235000008100 Ginkgo biloba Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000042295 Vigna mungo Species 0.000 description 1
- 235000010716 Vigna mungo Nutrition 0.000 description 1
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 description 1
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 description 1
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 description 1
- 235000011453 Vigna umbellata Nutrition 0.000 description 1
- FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N [4,6-bis(cyanoamino)-1,3,5-triazin-2-yl]cyanamide Chemical compound N#CNC1=NC(NC#N)=NC(NC#N)=N1 FJJCIZWZNKZHII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 235000021336 beef liver Nutrition 0.000 description 1
- 238000010960 commercial process Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000007323 disproportionation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000008204 material by function Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000004223 radioprotective effect Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y115/00—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15)
- C12Y115/01—Oxidoreductases acting on superoxide as acceptor (1.15) with NAD or NADP as acceptor (1.15.1)
- C12Y115/01001—Superoxide dismutase (1.15.1.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种超氧化物歧化酶的提取方法，特别设及一种从植物中提取超氧化物歧化酶的方法。将玉米原料预处理后，打浆。利用离子液体、磷酸氢二钾及水形成的离子液体双水相体系对玉米浆中的超氧化物歧化酶进行选择性的萃取。萃取液经磷酸盐缓冲溶液反向萃取得到超氧化物歧化酶的粗酶液。对粗酶液进行热变性法和凝胶柱层析法进行纯化，纯化后的酶液进行真空干燥得到超氧化物歧化酶精粉。离子液体双水相体系经反向萃取分离出蛋白质和酶后，可以直接应用于下一次的萃取过程，多次重复利用不影响离子液体的萃取效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种超氧化物歧化酶的提取方法，特别设及一种从植物中提取超氧化物歧化酶的方法，属于精细化工技术领域。
背景技术
超氧化物歧化酶(SOD)是一种具有特定生物催化功能的蛋白质，为等电点偏酸性的酸性蛋白质，由蛋白质和金属离子组成，它广泛存在于自然界的动物、植物以及一些微生物体内。根据所含金属离子(辅基)的不同，SOD可分为以下四种类型：第一类为Cu／Zn-SOD，呈蓝绿色，相对分子量约为32k道尔顿，来源于动物血、猪肝、牛肝以及菠菜叶、面包酵母中，在某些原核生物中也存在；第二类为Mn-SOD，呈紫红色，相对分子量约为40k道尔顿，主要存在于原核细胞和真核细胞以及线粒体的基质中，在高等植物中的过氧化物酶体中也含有。第三类为Fe-SOD，呈黄褐色，相对分子量约为38.7k道尔顿，主要存在真核生物如藻类，部分高等植物如油菜、柠檬、菠萝、甜橙、番茄、银杏等体内也存在。第四类为Ni-SOD，是近年来才发现的一种新型SOD，目前只有从链球菌中分离得到，对其研究及报道较少。
很多研究表明，活性氧(O2 -、·OH、H2O2、1O2、ROO·)能与蛋白质、核酸和脂类发生反应，导致膜脂过氧化、碱基突变、DNA链的断裂和蛋白质的损伤等。在动物体，活性氧导致细胞坏死、过敏反应、癌变或其他病理过程。在植物体内，活性氧可导致植物代谢失活、细胞死亡、光和作用速率降低，甚至造成植物品质降低、产量下降等。超氧化物歧化酶是能够催化超氧阴离子自由基O2 -发生歧化反应，平衡机体代谢过程中产生的过多自由基，减轻或消除自由基对机体的危害，受到全世界学术界广泛关注，使之成为涉及分子生物学、微生物学、医学等学科领域及医药、化工、食品等生产行业的一个热门研究课题。超氧化物歧化酶也是近年来应用最广泛的酶，具有抗衰老、免疫调节、抑制肿瘤、调节血脂、抗辐射、消炎和美容等功效。
人们最早从动物的血液中提取SOD制成产品，由于国际上疯牛病的蔓延，从动物血中提取的SOD，给人们在使用上带来一些危险因素。从植物，特别是人们日常经常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取SOD，使用安全性非常高，避免了可能发生的交叉感染。利用全新的提取技术从植物中提取SOD，具有明显的社会和经济效益，市场前景广阔。目前从植物中提取SOD的方法主要包括缓冲液提取法、超临界CO2萃取法和热变性法，其中以磷酸缓冲液法应用最为普遍。但该方法的缺点是浸出范围广，选择性相对差，容易浸出大量的无效成分，且会引起一些有效成分的水解。超临界CO2萃取法需要应用超临界流体，虽然分离粗产品较为便捷，但同样存在萃取过程选择性差，萃取后的粗产品在酶的纯化过程之前需要去除杂质。热变性法是依据SOD的热稳定性原理设计的。SOD的热稳定性高，当温度低于60℃时，短时间的热处理不会使酶活力有明显的变化，而一般的杂蛋白却在温度高于55℃时就易变性沉淀，因此，对SOD提液进行短时间的热处理可以达到去除杂蛋白的目的。热变性法作为一种初步的纯化手段，操作简便，经济实惠，但热变性过程容易导致酶的失活。
离子液体是近年来迅速发展起来的一种全新绿色介质和功能材料。离子液体具有不易挥发、不可燃、稳定性高、溶解能力强、功能可调节等优点，其应用领域正不断地扩大，使其在生物活性物质的分离上展现了十分诱人的应用前景。离子液体双水相萃取技术是近年来兴起的新的生物质分离技术，该体系一般是由亲水性离子液体、无机盐(如磷酸盐、碳酸盐、氢氧化物等)和水形成的双水相体系，它综合了离子液体和双水相体系的优点。作为一种高效的新型绿色分离体系，离子液体双水相具有分相时间短、黏度低、萃取过程不易乳化、萃取率高、分离条件温和、对生物活性物质不破坏且离子体系可以且易回收利用等优点，因此，离子液体双水相这一新的萃取分离体系，广泛用于生物活性物质的分离和纯化。如大多数酶和蛋白质等都能用双水相体系进行分离纯化。离子液体双水相萃取蛋白质机理属于液-液萃取，当蛋白质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的作用和溶液环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同，即各成分在两相间的选择性分配，从而达到萃取分离的目的。蛋白质与离子液体作用，主要有盐析作用；与辅助盐萃取剂发生配位作用生成配合物，配合物被萃取到离子液体中；或者调节pH，使蛋白质的疏水基团暴露出来，从而萃取到离子液体中等。
在传统农作物中，玉米、大蒜、绿豆、饭豆、芝麻、黄豆这六种作物中SOD含量较高，并且以玉米中的含量最高，因此本发明以玉米为原料，采用离子液体双水相体系对玉米中SOD中分离纯化，以期建立一种简便、高效的SOD分离纯化路线。
发明内容
本发明是为解决常规SOD粗提过程中，萃取剂对酶选择性较差且酶易变性失活的缺点，提出采用离子液体双水相体系高效选择性的萃取玉米中的蛋白质与SOD。该技术生产方法简单易行，适合工业化生产过程。
本发明的技术方案由以下部分组成。
1)玉米原料的预处理。对玉米原料进行筛选、清洗、消毒、洗净，晾干备用。将玉米粒浸入水池中，以质量比1∶2的水，温度为28-32℃时浸泡18-36h，玉米粒完全溶胀后，发芽16-36h，粉碎打浆。
2)离子液体双水相萃取。将离子液体、K2HPO4按比例加入到玉米浆中，搅拌萃取30-90min，当体系出现明显分层时，萃取过程结束。过滤分离去除玉米浆中的固体，液体部分进行静置分层，下层为含有蛋白质的离子液体层。
3)蛋白质与酶的反萃取。将含有蛋白质的离子液体层进行分离后，向其中加入pH值为7.8的磷酸盐缓冲溶液，搅拌60-90min后，蛋白质溶解于缓冲溶液中，而与离子液体相分离，缓冲溶液层为粗酶液。分离后的离子液体层可以直接用于下一次的萃取过程。
4)蛋白质的分离。将粗酶液缓慢升温至60℃，保温反应15-30min。降温至0-4℃，离心分离蛋白质，其滤液为SOD酶浓缩液。
5)SOD的纯化。将SOD酶浓缩液进行超滤和纳滤处理，截留分子量大于15k道尔顿以上的物质。所得滤液继续采用Sephadex G-75凝胶柱子层析分离。层析液浓缩后进行真空干燥，得SOD酶精粉。
上述的离子液体为咪唑衍生物，其结构式如1所示。
式中R=-CH2CH2OH，-CH2CH2CH2OH，-CH2CHOHCH2OH。X为离子液体带负电荷的部分，具有如式2所示的结构。
上述的离子液体双水相体系的构成为离子液体的质量浓度为20-35％，无机盐K2HPO4的质量浓度为17-25％。
本发明所采用的离子液体双水相体系萃取玉米中的SOD酶，其在离子液体相的分配系数超过13.5，SOD能够快速的从玉米浆中进入离子液体层，获得的粗提液总活力超过5000U。在萃取过程中，离子液体只能够萃取蛋白质，对玉米浆中的脂肪、蜡质等杂质没有萃取能力，因此，离子液体双水相体系对SOD具有选择性的萃取性能。离子液体双水相体系经反萃取分离出蛋白质和酶后，可以直接应用于下一次的萃取过程，多次重复利用不影响离子液体的萃取效率。
下面结合实例对本发明内容进行描述。
具体实施例
实施例1
1)玉米原料的预处理。取玉米粒1.5kg，进行水洗，随后用1％的次氯酸钠水洗消毒、洗净消毒水，沥干水分。将玉米粒进入水池中，以质量比1∶2的水，温度为28℃时浸泡24h，玉米粒完全溶胀后，发芽24h，粉碎打浆。
2)离子液体双水相萃取。将0.7kg离子液体、0.6kgK2HPO4加入到玉米浆中，搅拌萃取90min，当体系出现明显分层时，萃取过程结束。过滤分离去除玉米浆中的固体，液体部分进行静置分层，下层为含有蛋白质的离子液体层。
3)蛋白质与酶的反萃取。将含有蛋白质的离子液体层进行分离后，向其中0.05mol／L磷酸盐缓冲溶液6.0L，搅拌60min后，蛋白质溶解于缓冲溶液中，而与离子液体相分离，得到粗酶液。
4)蛋白质的分离。将粗酶液缓慢升温至60℃，保温反应20min。降温至0-4℃，将透析液8000r／min离心20min后，离心分离蛋白质，留取上清液，即为酶的浓缩液。
5)SOD的纯化。将SOD酶浓缩液进行超滤和纳滤处理，截留分子量大于15k道尔顿以上的物质。所得滤液继续采用Sephadex G-75凝胶柱子层析分离，淋洗液为0.05mol／L磷酸盐缓冲溶液，淋洗速度为20mL／min。层析液浓缩后放入真空干燥箱，控制真空度0.09MPa、温度为35℃条件进行干燥，得SOD酶精粉。
经上述方法获得的SOD酶精粉的总活力5860U，比活力为3079U／mg，纯化倍数达到83.2。
实施例2
1)玉米原料的预处理。取玉米粒1.5kg，进行水洗，随后用1％的次氯酸钠水洗消毒、洗净消毒水，沥干水分。将玉米粒进入水池中，以质量比1∶2的水，温度为28℃时浸泡36h，玉米粒完全溶胀后，发芽24h，粉碎打浆。
2)离子液体双水相萃取。将0.7kg离子液体、0.6kgK2HPO4加入到玉米浆中，搅拌萃取90min，当体系出现明显分层时，萃取过程结束。过滤分离去除玉米浆中的固体，液体部分进行静置分层，下层为含有蛋白质的离子液体层。
3)蛋白质与酶的反萃取。将含有蛋白质的离子液体层进行分离后，向其中0.05mol／L磷酸盐缓冲溶液6.0L，搅拌60min后，蛋白质溶解于缓冲溶液中，而与离子液体相分离，得到粗酶液。
4)蛋白质的分离。将粗酶液缓慢升温至60℃，保温反应20min。降温至0-4℃，将透析液8000r／min离心20min后，离心分离蛋白质，留取上清液，即为酶的浓缩液。
5)SOD的纯化。将SOD酶浓缩液进行超滤和纳滤处理，截留分子量大于15k道尔顿以上的物质。所得滤液继续采用Sephadex G-75凝胶柱子层析分离，淋洗液为0.05mol／L磷酸盐缓冲溶液，淋洗速度为20mL／min。层析液浓缩后放入真空干燥箱，控制真空度0.09MPa、温度为35℃条件进行干燥，得SOD酶精粉。
经上述方法获得的SOD酶精粉的总活力8657U，比活力为3215U／mg，纯化倍数达到118。
实施例3
1)玉米原料的预处理。取玉米粒1.5kg，进行水洗，随后用1％的次氯酸钠水洗消毒、洗净消毒水，沥干水分。将玉米粒进入水池中，以质量比1∶2的水，温度为28℃时浸泡24h，玉米粒完全溶胀后，粉碎打浆。
2)离子液体双水相萃取。将0.7kg离子液体、0.6kgK2HPO4加入到玉米浆中，搅拌萃取60min，当体系出现明显分层时，萃取过程结束。过滤分离去除玉米浆中的固体，液体部分进行静置分层，下层为含有蛋白质的离子液体层。
3)蛋白质与酶的反萃取。将含有蛋白质的离子液体层进行分离后，向其中0.05mol／L磷酸盐缓冲溶液6.0L，搅拌60min后，蛋白质溶解于缓冲溶液中，而与离子液体相分离，得到粗酶液。
4)蛋白质的分离。将粗酶液缓慢升温至55℃，保温反应15min。降温至0-4℃，将透析液8000r／min离心20min后，离心分离蛋白质，留取上清液，即为酶的浓缩液。
5)SOD的纯化。将SOD酶浓缩液进行超滤和纳滤处理，截留分子量大于15k道尔顿以上的物质。所得滤液继续采用Sephadex G-75凝胶柱子层析分离，淋洗液为0.05mol／L磷酸盐缓冲溶液，淋洗速度为20mL／min。层析液浓缩后放入真空干燥箱，控制真空度0.09MPa、温度为35℃条件进行干燥，得SOD酶精粉。
上述方法中所用的玉米未进行发芽加工，因此获得的SOD酶精粉的总活力仅有4892U，比活力为2375U／mg，纯化倍数达到56.1。
Claims (2)
1.离子液体用于玉米SOD酶的提取方法，其特征在于离子液体、磷酸氢二钾及水形成双水相体系用于提取玉米中的超氧化物歧化酶粗酶液，其中离子液体具有式(1)所示结构
式中R=-CH2CH2OH，-CH2CH2CH2OH，-CH2CHOHCH2OH；X为离子液体带负电荷的部分，具有如式2所示的结构。
。
2.根据权利要求1所述的离子液体用于玉米SOD提取方法，其特征在于离子液体双水相体系的构成为离子液体的质量浓度为20-35％，磷酸氢二钾的质量浓度为17-25％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410029481.9A CN103740667A (zh) | 2014-01-15 | 2014-01-15 | 离子液体用于玉米sod酶的提取 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410029481.9A CN103740667A (zh) | 2014-01-15 | 2014-01-15 | 离子液体用于玉米sod酶的提取 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103740667A true CN103740667A (zh) | 2014-04-23 |
Family
ID=50497734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410029481.9A Pending CN103740667A (zh) | 2014-01-15 | 2014-01-15 | 离子液体用于玉米sod酶的提取 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103740667A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114431331A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-05-06 | 无锡金农生物科技有限公司 | 一种高水溶性大米蛋白的制备方法 |
| CN114621943A (zh) * | 2020-12-14 | 2022-06-14 | 中粮营养健康研究院有限公司 | 一种利用经修饰化的离子液体萃取果蔬中劣变蛋白酶的方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1570093A (zh) * | 2003-07-23 | 2005-01-26 | 韩伯钧 | 一种从玉米中提取sod复合酶精粉的制造方法 |
| CN1626654A (zh) * | 2003-12-11 | 2005-06-15 | 张明 | 玉米超氧化物歧化酶提取方法 |
| CN101016176A (zh) * | 2006-12-13 | 2007-08-15 | 辽宁大学 | 一种新型离子液体－无机盐－水双水相体系 |
| CN103173423A (zh) * | 2013-03-29 | 2013-06-26 | 湖南大学 | 从玉米中高产率提取超氧化物歧化酶的方法 |
-
2014
- 2014-01-15 CN CN201410029481.9A patent/CN103740667A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1570093A (zh) * | 2003-07-23 | 2005-01-26 | 韩伯钧 | 一种从玉米中提取sod复合酶精粉的制造方法 |
| CN1626654A (zh) * | 2003-12-11 | 2005-06-15 | 张明 | 玉米超氧化物歧化酶提取方法 |
| CN101016176A (zh) * | 2006-12-13 | 2007-08-15 | 辽宁大学 | 一种新型离子液体－无机盐－水双水相体系 |
| CN103173423A (zh) * | 2013-03-29 | 2013-06-26 | 湖南大学 | 从玉米中高产率提取超氧化物歧化酶的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| YU-PING TZENG ET AL.: "Liquid-liquid extraction of lysozyme using a dye-modified ionic liquid", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A》 * |
| 刘杰凤 等: "玉米超氧化物歧化酶的提取与纯化工艺", 《食品研究与开发》 * |
| 吴夏 等: "双水相萃取技术在植物SOD 提取纯化中的应用", 《中国食物与营养》 * |
| 宋小青: "玉米SOD的分离与纯化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库·农业科技辑》 * |
| 陈旭伟 等: "离子液体在蛋白质萃取分离中的应用", 《化学进展》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114621943A (zh) * | 2020-12-14 | 2022-06-14 | 中粮营养健康研究院有限公司 | 一种利用经修饰化的离子液体萃取果蔬中劣变蛋白酶的方法 |
| CN114621943B (zh) * | 2020-12-14 | 2024-06-04 | 中粮营养健康研究院有限公司 | 一种利用经修饰化的离子液体萃取果蔬中劣变蛋白酶的方法 |
| CN114431331A (zh) * | 2021-12-31 | 2022-05-06 | 无锡金农生物科技有限公司 | 一种高水溶性大米蛋白的制备方法 |
| CN114431331B (zh) * | 2021-12-31 | 2024-03-15 | 无锡金农生物科技有限公司 | 一种高水溶性大米蛋白的制备方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101856367B (zh) | 一种具有抗氧化活性的鸡骨泥酶解物的制备方法 | |
| CN105919110B (zh) | 黑茶复合酵素及其制备方法 | |
| JP2013056868A (ja) | 生理活性液状組成物及びその製造方法 | |
| US20210298330A1 (en) | Oral solution having high sod enzymatic activity and preparation method therefor | |
| KR101697107B1 (ko) | 조청을 이용한 유산균 발효 음료의 제조방법 및 이에 의해 제조된 유산균 발효 음료 | |
| CN106119326A (zh) | 从牛软骨中提取胶原蛋白多肽联产软骨素的方法 | |
| CN102417546A (zh) | 一种玫瑰花粗多糖的提取方法 | |
| CN105901476A (zh) | 基于物理与酶促联合方法解除白果毒性的方法 | |
| CN110616207A (zh) | 一种以植物为原料提取超氧化物歧化酶的方法 | |
| CN104939242B (zh) | 一种芦笋的综合利用方法 | |
| KR101978336B1 (ko) | 아로니아 농축액의 제조방법 | |
| CN108066210B (zh) | 一种利用食用菌的地茶叶发酵物及其制备方法与应用 | |
| CN103740667A (zh) | 离子液体用于玉米sod酶的提取 | |
| CN103289967A (zh) | 一种从神州草中提取超氧化物歧化酶的提取方法 | |
| CN106188329A (zh) | 一种扇贝多糖的提取方法和制品 | |
| CN107712548A (zh) | 一种用于食品保鲜的竹叶提取物的制备方法 | |
| CN103756981A (zh) | 离子液体用于螺旋藻Fe-SOD酶的提取 | |
| CN101554222B (zh) | 香菇味素的提取方法 | |
| CN109619594A (zh) | 一种螺旋藻速溶粉及其制备方法 | |
| CN105193880A (zh) | 一种软枣猕猴桃黄酮的提取方法 | |
| CN104087562A (zh) | 一种超氧化物歧化酶的提取方法 | |
| CN105248832B (zh) | 一种从菠菜中提取铁蛋白的方法 | |
| CN113826886A (zh) | 一种葛根酵素及其制备方法 | |
| CN107412281A (zh) | 一种红椎菌提取物的制备方法 | |
| CN106539075A (zh) | 一种高效吸收海参营养含片的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Jiang Yikuan Inventor before: Li Meifeng |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160531 Address after: 266061 Hongkong East Road, Laoshan District, Shandong, China, No. 7, No. Applicant after: Qingdao University Address before: 266071 building 306, No. 10, Ningxia Road, Shandong, Qingdao Applicant before: Li Meifeng |
|
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140423 |