CN111233970A - 一种离子液体提取细胞膜蛋白的方法及试剂盒 - Google Patents

一种离子液体提取细胞膜蛋白的方法及试剂盒 Download PDF

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徐春雷
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Abstract

一种从生物样品中提取膜蛋白的方法，包括如下步骤：1.将组织切成小块，使用TBS缓冲液反复清洗，除去不相关部分；2.对切成小块的组织进行机械匀浆，3.加入裂解缓冲液进行细胞裂解，离心弃上清，取沉淀加裂解缓冲液重悬4.重悬后的沉淀中加入离子液体提取液提取膜蛋白后离心，膜蛋白位于离心层的上清液中，真空低温蒸发离子液体后得到膜蛋白。

Description

一种离子液体提取细胞膜蛋白的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及蛋白质组学领域，具体涉及一种离子液体提取细胞膜蛋白的试剂盒。
背景技术
蛋白质作为生物膜的重要组成成分，是生物膜功能的主要承载者。并且膜蛋白质也是重要的药物靶点，其功能异常与多种疾病直接相关，在目前的药物开发中，约有70% 的药物靶点为膜蛋白。然而，膜蛋白质的难以溶解以及低丰度等问题一直是制约膜蛋白质组发展的瓶颈。
目前现有的以尿素为代表的变性剂、甲醇为代表的有机试剂及以十二烷基磺酸钠为代表的表面活性剂等膜蛋白质溶解体系，存在着无法同时满足强溶解能力和好的酶活兼容性及溶解试剂去除困难，干扰后续液相分离-质谱鉴定等问题。因此，发展一种溶解能力强、酶活兼容性好且不干扰后续
的色谱分离和质谱鉴定的新型膜蛋白质溶解体系，对于膜蛋白组学的研究具有重要意义。
离子液体是由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的、在室温或室温附近呈液态的盐类。室温离子液体, 又称离子液体, 是一种在室温及接近室温的环境中完全以离子状态存在的液态物质. 由于其具有不可燃、蒸汽压极低、黏度大、导电性和溶解能力好、高温稳定等特点, 已被广泛应用于有机合成、催化、电化学、分析化学等领域. 离子液体具有一些传统有机和无机化学试剂不可比拟的优点, 如蒸汽压极低、不易挥发、黏度大、不可燃、导电性和溶解能力好、高温稳定、电化学窗口较宽等。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题而提供。
本发明通过以下技术方案实现：1.在冰上将组织切成小块，使用预冷到4℃的TBS缓冲液反复清洗，除去不相关部分；2.对切成小块的组织进行低温机械匀浆，3.加入裂解缓冲液进行细胞裂解，离心弃上清，取沉淀.沉淀中加入裂解缓冲液重悬，4.重悬后的沉淀加入离子液体提取液提取膜蛋白后离心，膜蛋白位于离心层的上清液中，真空低温蒸发离子液体后得到膜蛋白。试剂盒组分包括：提取缓冲液，离子液体试剂，蛋白酶抑制剂混合液。裂解缓冲液成分为：300mM蔗糖，15 mM NaCl，10 mM Pipes (哌嗪-1,4-双（2-乙磺酸）),0.5mMEDTA, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 0.025%洋地黄皂苷，pH 7.4；TBS: 50 mM Tris，150 mM.NaCl，pH 7.4。蛋白酶抑制剂混合液购自碧云天生物技术。提取缓冲液为离子液体是1-十二烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(C12MIMBF4), 1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐(VEIMBF4),1-乙烯基-3-乙基咪唑三氟甲烷磺酰亚胺盐(VEIMNTF2)或其混合物，或包含所述与水混溶的离子液体和水的混合物。
具体方法为：在分离目标组织后，快速去除不需要的物质（例如结缔组织，脂肪，血管等）。将组织快速切成约2 mm3的碎片。 将组织切片加入含有2ml冰冷TBS的试管中。轻轻地轻弹管子以去除血细胞和其他松散附着的物质。通过在4℃下以100×g离心2分钟来收集组织块。 去除并丢弃上清液。
收集组织小块，转移到预先冷却的均化器中进行机械匀浆获得细胞后，用裂解缓冲液液将细胞在冰上裂解15分钟。裂解过程加入蛋白酶抑制剂混合液防止蛋白降解，4℃低温1000g离心15分钟后，弃上清后收集沉淀。用裂解缓冲液将沉淀重悬，加入离子液体或其混合液进行膜蛋白提取，离子液体为1-十二烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(C12MIMBF4), 1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐(VEIMBF4), 1-乙烯基-3-乙基咪唑三氟甲烷磺酰亚胺盐(VEIMNTF2)或其混合物，充分离心后，取上清，即为膜蛋白溶液，蛋白浓度用Bradford试剂测定。
附图说明
图1 泳道1为本发明提取法提取的膜蛋白，泳道2位对比实施例的方法提取的膜蛋白，泳道3为国内某试剂厂家制备的试剂盒提取的膜蛋白，泳道4为蛋白分子量标记。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。
实施例一 组织膜蛋白的提取
1.确保所有缓冲液都解冻并充分混合。 在提取过程中将提取缓冲液保持在冰上。 将蛋白酶抑制剂混合液保持在室温下以防止DMSO冻结.
2.在分离目标组织后，快速去除不需要的物质（例如结缔组织，脂肪，血管等）。
3.将组织快速切成约2 mm3的碎片。 将组织切片加入含有2ml冰冷TBS的试管中。
4.轻轻地轻弹管子以去除血细胞和其他松散附着的物质。
5.通过在4℃下以100×g离心2分钟来收集组织块。 去除并丢弃上清液。
6.重复步骤4和5，共洗涤两次。 第二次洗涤后，确保已完全除去所有TBS。
7.将组织（新鲜或冷冻）转移到预先冷却的均化器中匀浆。
8.将5μl蛋白酶抑制剂混合液加入均化器的壁上，小心均质化，直到组织完全均匀化，不再能看到完整的碎片。
9.将2ml冰冷的裂解缓冲液加入均化器中，冰上裂解15分钟。裂解过程加入蛋白酶抑制剂混合液防止蛋白降解，裂解后取裂解产物4℃低温1000×g离心15分钟后，小心地去除上清液，得到沉淀，沉淀用2mL裂解缓冲液重悬。
10.将重悬后的沉淀加入0.2ml离子液体提取液 +5μl蛋白酶抑制剂混合液中。
11.温和搅拌，在4℃孵育15分钟。
12.在4℃下以16,000×g离心15分钟。
13.将富含整合膜蛋白的上清液转移到新管中。
14.用BCA测定确定细胞溶质和膜组分的总蛋白质浓度。
实施例二 培养细胞或者菌液的膜蛋白提取
1.将细胞或者菌液转移到预先冷却的离心管中，用TBS缓冲液清洗几次后离心，加TBS重悬。
2.将5μl蛋白酶抑制剂混合液加入离心管中。
3.将2ml冰冷的裂解缓冲液加入离心管中，冰上裂解15分钟。裂解过程加入蛋白酶抑制剂混合液防止蛋白降解，裂解后去裂解产物4℃低温1000×g离心15分钟后，小心地去除上清液，得到沉淀，沉淀用2mL裂解缓冲液重悬。
4.将重悬后的沉淀加入0.2ml离子液体提取液 +5μl蛋白酶抑制剂混合液中。
5.温和搅拌，在4℃孵育15分钟。
6.在4℃下以16,000×g离心15分钟。
7.将富含整合膜蛋白的上清液转移到新管中。
8.用BCA测定确定细胞溶质和膜组分的总蛋白质浓度。
对比实施例一
1.配制疏水性蛋白提取液(非裂解液)：1% Triton X-114，150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，调pH值至8.0备用。
2.将菌液或者匀浆后的细胞于4 ℃条件下15000 g离心15 min收集细胞或者菌体;用1 ml 含有5 mM MgCl2 的PBS洗涤3次，最后于4 ℃条件下15000 g离心15 min收集菌体。
3.菌体沉淀加入1 ml冷提取液，于4 ℃条件下放置2 h，17000 g离心10 min，去除沉淀取上清。
4.将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%，再加入20 mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性，37 ℃条件下放置10 min使其分层。室温下1000 g离心10 min使液相和去污相充分分层。
5.将液相和去污相分开，分别用10倍体积的冷丙酮在冰上沉淀45 min。
6.于4 ℃条件下17000 g离心30 min，用去离子水洗涤沉淀3次。
7.将沉淀溶解在1% SDS溶液中，测定蛋白浓度，比较液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白较多，适于进一步蛋白实验。
实验例一，对比实验
将实施例1和实施例2所得到的膜蛋白样本进行SDS-PAGE电泳分析，结果如说明书附图所示。

Claims (10)

1.一种从生物样品中提取膜蛋白的方法，包括将生物样本匀浆分散，使用裂解液裂解细胞，使用两相提取试剂提取等步骤，其特征在将分散裂解后的样品与可与水混溶的离子液体接触，所述离子液体是1-十二烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(C12MIMBF4), 1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐(VEIMBF4), 1-乙烯基-3-乙基咪唑三氟甲烷磺酰亚胺盐(VEIMNTF2)或其混合物，或包含所述与水混溶的离子液体和至少一种其他溶剂的混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，包括使用包含水混溶性离子液体和水的混合物。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于包括以下步骤：1.在冰上将组织切成小块，使用预冷的TBS缓冲液反复清洗，除去不相关部分；2.对切成小块的组织进行低温机械匀浆，3.加入裂解缓冲液进行细胞裂解，离心弃上清，取沉淀加裂解缓冲液重悬.4. 重悬后的沉淀中加入离子液体提取液提取膜蛋白后离心，膜蛋白位于离心层的上清液中，真空低温蒸发离子液体后得到膜蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述膜蛋白包含两个或更多个跨膜区。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述生物样品是组织，细胞，细胞培养物样品，体液，细菌，真菌，病毒或植物。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于其中预先裂解所述生物样品的步骤，包括添加洗涤剂，表面活性物质或成孔剂用于裂解所述生物样品。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于裂解缓冲液成分为：300mM蔗糖，15mM NaCl，10mM Pipes (哌嗪-1,4-双（2-乙磺酸）),0.5mM EDTA, 1 mM DTT, 2 mM ATP, 0.025%洋地黄皂苷，pH 7.4；TBS: 50 mM Tris，150 mM. NaCl，pH 7.4。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述机械作用通过摇动或搅拌来实现。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述提取在4至37℃的温度下进行。
10.一种膜蛋白提取试剂盒试剂盒，其特征在于包含至少一种离子液体或包含所述离子液体的混合物，所述离子液体为1-十二烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(C12MIMBF4), 1-乙烯基-3-乙基咪唑四氟硼酸盐(VEIMBF4), 1-乙烯基-3-乙基咪唑三氟甲烷磺酰亚胺盐(VEIMNTF2)或其混合物。
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