CN116590279A - 一种基于羟基磁珠提取血浆游离dna的试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒及使用方法，试剂盒包括蛋白酶K、裂解液、裂解结合液、漂洗缓冲液A、漂洗缓冲液B、洗脱液以及羟基磁珠。本提取方法主要是将血浆样本、蛋白酶K、裂解液、羟基磁珠混合进行细胞裂解，破坏样品细胞结构，从而使样品中的DNA游离在裂解体系中的过程，通过漂洗纯化使DNA与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。利用少量血浆样本即可获得较高纯度和得率的核酸，满足后续核酸检测用量，并且提取的核酸不含核酸酶及PCR检测抑制剂，DNA保存时间长，运用于后续核酸PCR扩增等分子检测灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及DNA提取技术领域，具体涉及一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒及使用方法。
背景技术
细胞通过凋亡、坏死和分泌相结合的方式释放cfDNA。cfDNA可以来自癌细胞，cfDNA中的突变是癌症的高度特异性标记，这就产生了术语“循环肿瘤DNA”(ctDNA)；也可以来自肿瘤微环境中的细胞、免疫细胞或其他身体器官。在血液中，cfDNA可能以游离形式存在或与胞外囊泡(如外泌体)混合在一起。在cfDNA中可以找到多种遗传和表观遗传的改变。
在恶性肿瘤的状态下，cfDNA血液水平可增加到50-1000ng/ml，其中肿瘤DNA(ctDNA)占总数的3-90％。升高的水平可能是由于肿瘤细胞的高周转率和对死亡细胞的低效清除率以及来自死亡的细胞。肿瘤来源的cfDNA(这里称为ctDNA)在实体和血液恶性肿瘤中释放的主要机制仍然存在争议，但多种特性表明细胞死亡是主要因素，双链ctDNA片段最常见的大小是160-180bp。
过去的研究倾向于从血清中收集ctDNA，因为总cfDNA产量始终高于血浆。然而，近年来的研究表明，这种差异是由于血凝时白细胞溶解水平较高所致。因此，血浆已成为提取ctDNA理想的介质，并已被证明含有更高比例的肿瘤衍生核酸。目前常见的cfDNA提取方法有磁珠法、氯仿、硅胶柱法；氯仿试剂因其毒性较大，现已慢慢被淘汰使用；使用硅胶柱法，当样本数量较多时，其操作时间较长，不利于高通量提取；磁珠法技术不成熟，提取的cfDNA纯度低、回收率低、提取产物会对下游会产生抑制。
发明内容
本发明目的是针对现有cfDNA提取方法提取的有cfDNA纯度低、回收率低、提取产物对下游会产生抑制的问题，设计一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒及使用方法，利用少量血浆样本即可获得较高纯度和得率的核酸，满足后续核酸检测用量，并且提取的核酸不含核酸酶及PCR检测抑制剂，DNA保存时间长，运用于后续核酸PCR扩增等分子检测灵敏度高。具体采用如下技术方案：
一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒，包括试剂盒，试剂盒包括蛋白酶K、裂解液、裂解结合液、漂洗缓冲液A、漂洗缓冲液B、洗脱液以及羟基磁珠；蛋白酶K、裂解液、裂解结合液、漂洗缓冲液A、漂洗缓冲液B、洗脱液的体积比为1：3.3：83.3：16：16：3.3。
优选的，裂解液为表面活性剂，裂解液为质量浓度为20％w/v的SDS十二烷基硫酸钠。
优选的，裂解结合液由摩尔浓度为1-6M的尿素或异硫氰酸胍或其组合物、质量浓度为0.5％-30％w/v的Tween-20吐温-20、1％-10％Triton-X100聚乙二醇辛基苯基醚、50-200mM的硫酸铵、金属离子螯合剂混合而成，pH为4.0-6.0。
优选的，金属离子螯合剂为1-10mM EDTA乙二胺四乙酸缓冲液、12％-20％的异丙醇、20-100mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液混合而成，pH为4.0-6.0。
优选的，磁珠悬浮液为体积分数为70-80％的超顺磁微球，超顺磁微球的粒径介于50～100nm。
优选的，漂洗缓冲液A由摩尔浓度为0.5-4M的异硫氰酸胍和尿素、质量浓度为0.5％-30％w/v Tween-20吐温-20、1-5％ Triton-X100聚乙二醇辛基苯基醚、50-200mM硫酸铵、20-100mM Tris-HCl缓冲液调节、10％-55％体积的异丙醇混合而成，pH为4.0-6.0。
优选的，漂洗缓冲液B由摩尔浓度为0.1-2M的氯化钠溶液、1-5mM EDTA乙二胺四乙酸、20-100mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、10％-55％体积的异丙醇混合而成，pH为6.0-8.0。
优选的，洗脱液选自无核酸酶水、Tris缓冲液、TE缓冲液中任一种。
一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒使用方法，包括以下步骤：
步骤1：样本裂解；向离心管中依次加入30μL Proteinase K蛋白酶K、2mL血浆、100μL 20％ SDS十二烷基硫酸钠，放于60℃、1200rpm恒温混匀仪上震荡20分钟，孵育结束后将离心管冰浴5-10分钟；
步骤2：吸附结合；准备2.5ml裂解结合液、30ul磁珠形成裂解液/磁珠混合液加到步骤1的样本管中；涡旋震荡1分钟，然后手工上下颠倒或使用混匀仪混匀5-10分钟，使磁珠一直处于悬浮状态；
步骤3：漂洗；将离心管放于磁力架上静置，待磁珠吸附到磁力架上，管内溶液变澄清后，翻转离心管冲洗瓶盖上残留磁珠，再放置1分钟左右，之后弃去溶液；向离心管中加入1ml漂洗缓冲液A，震荡混匀后将混悬液转移到新的1.5ml离心管中；将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；向离心管中加入1ml漂洗缓冲液A，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟；将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。向离心管中加入1ml漂洗缓冲液B，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟；将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；重复漂洗缓冲液B步骤,离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，开盖室温放置5-10分钟使乙醇充分挥发；
步骤4：洗脱；离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，开盖室温放置5-10分钟使乙醇充分挥发；向离心管中加入50-100μL无核酸酶水后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后将离心管固定于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟；将离心管固定于磁力架上静置2分钟，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
与最接近的现有技术比，本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
1、本发明采用高结合能力的硅基包被磁珠，高效提取游离DNA，回收率高；利用少量血浆样本即可获得较高纯度和得率的核酸，满足后续核酸检测用量，并且提取的核酸不含核酸酶及PCR检测抑制剂，DNA可以在-20±5℃保存时间长达1年，运用于后续核酸PCR扩增等分子检测灵敏度高；
2、本发明试剂盒不含目前现有技术常见的酚氯仿等有毒试剂，安全无毒；
3、本提取方法主要是将血浆样本、蛋白酶K、裂解液、羟基磁珠混合进行细胞裂解，破坏样品细胞结构，从而使样品中的DNA游离在裂解体系中的过程，通过漂洗纯化使DNA与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离；使用本试剂盒进行回收的cfDNA纯度好，使用荧光定量扩增目的片段，加入不同模板量，其Ct差值符合理论值，可以有效提高下游检测成功率；
4、本试剂盒可搭配自动化提取仪、液体工作站配套使用，简单、快速地进行高通量提取。
附图说明
图1为本发明实施4使用人KTB长片段引物进行QPCR测定结果图；
图2为本发明实施4使用人KTB短片段引物进行QPCR测定结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围，请参阅图1-2。
实施例1：
一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒，包括试剂盒，试剂盒包括蛋白酶K、裂解液、裂解结合液、漂洗缓冲液A、漂洗缓冲液B、洗脱液以及羟基磁珠；蛋白酶K、裂解液、裂解结合液、漂洗缓冲液A、漂洗缓冲液B、洗脱液的体积比为1：3.3：83.3：16：16：3.3。试剂盒不含目前现有技术常见的酚氯仿等有毒试剂，安全无毒。
进一步的，裂解液为表面活性剂，裂解液为质量浓度为20％w/v的SDS十二烷基硫酸钠。
进一步的，裂解结合液由摩尔浓度为1-6M的尿素或异硫氰酸胍或其组合物、质量浓度为0.5％-30％w/v的Tween-20吐温-20、1％-10％Triton-X100聚乙二醇辛基苯基醚、50-200mM的硫酸铵、金属离子螯合剂混合而成，pH为4.0-6.0。
进一步的，金属离子螯合剂为1-10mM EDTA乙二胺四乙酸缓冲液、12％-20％的异丙醇、20-100mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液混合而成，pH为4.0-6.0。
进一步的，磁珠悬浮液为体积分数为70-80％的超顺磁微球，超顺磁微球的粒径介于50～100nm。采用高结合能力的硅基包被磁珠，高效提取游离DNA，回收率高；利用少量血浆样本即可获得较高纯度和得率的核酸，满足后续核酸检测用量，并且提取的核酸不含核酸酶及PCR检测抑制剂，DNA可以在-20±5℃保存时间长达1年，运用于后续核酸PCR扩增等分子检测灵敏度高。
进一步的，漂洗缓冲液A由摩尔浓度为0.5-4M的异硫氰酸胍和尿素、质量浓度为0.5％-30％w/v Tween-20吐温-20、1-5％ Triton-X100聚乙二醇辛基苯基醚、50-200mM硫酸铵、20-100mM Tris-HCl缓冲液调节、10％-55％体积的异丙醇混合而成，pH为4.0-6.0。
进一步的，漂洗缓冲液B由摩尔浓度为0.1-2M的氯化钠溶液、1-5mM EDTA乙二胺四乙酸、20-100mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、10％-55％体积的异丙醇混合而成，pH为6.0-8.0。
进一步的，洗脱液选自无核酸酶水、Tris缓冲液、TE缓冲液中任一种。
一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒使用方法，包括以下步骤：
步骤1：样本裂解；向离心管中依次加入30μL Proteinase K蛋白酶K、2mL血浆、100μL 20％ SDS十二烷基硫酸钠，放于60℃、1200rpm恒温混匀仪上震荡20分钟，孵育结束后将离心管冰浴5-10分钟；
步骤2：吸附结合；准备2.5ml裂解结合液、30ul磁珠形成裂解液/磁珠混合液加到步骤1的样本管中；涡旋震荡1分钟，然后手工上下颠倒或使用混匀仪混匀5-10分钟，使磁珠一直处于悬浮状态；
步骤3：漂洗；将离心管放于磁力架上静置，待磁珠吸附到磁力架上，管内溶液变澄清后，翻转离心管冲洗瓶盖上残留磁珠，再放置1分钟左右，之后弃去溶液；向离心管中加入1ml漂洗缓冲液A，震荡混匀后将混悬液转移到新的1.5ml离心管中；将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；向离心管中加入1ml漂洗缓冲液A，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟；将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。向离心管中加入1ml漂洗缓冲液B，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟；将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；重复漂洗缓冲液B步骤,离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，开盖室温放置5-10分钟使乙醇充分挥发；
步骤4：洗脱；离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，开盖室温放置5-10分钟使乙醇充分挥发；向离心管中加入50-100μL无核酸酶水后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后将离心管固定于25℃、1600rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟；将离心管固定于磁力架上静置2分钟，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
本试剂盒方法将血浆样本、蛋白酶K、裂解液、羟基磁珠混合进行细胞裂解，破坏样品细胞结构，从而使样品中的DNA游离在裂解体系中的过程，通过漂洗纯化使DNA与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离；使用本试剂盒进行回收的cfDNA纯度好，使用荧光定量扩增目的片段，加入不同模板量，其Ct差值符合理论值，可以有效提高下游检测成功率。
总的来说，本试剂盒提取方法大致可以分为四个步骤，第一步是裂解，核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来，细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。其中，酶作用主要是通过加入蛋白酶以使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。第二步是结合，硅基磁珠在需要高浓度的盐溶液和一定比例的醇溶液作用下，因为疏水作用，高浓度的盐离子可以破坏核酸分子表面的水化层，促进磁珠表面与核酸分子进行吸附。通过外加磁场，对核酸进行收集。第三步是洗涤，核酸的高电荷磷酸骨架使其比蛋白质、多糖、脂肪等其他生物大分子物质更具亲水性，根据它们理化性质的差异，用选择性沉淀、层析、密度梯度离心等方法可将核酸分离、纯化。第四步是洗脱，加水或者TE破坏高盐环境，形成低盐环境，使DNA从磁珠上脱落。
实施例2：优化血浆游离DNA提取试剂盒自动提取程序
样本：新鲜血浆样本
试剂：按照实施例1配制的提取试剂
仪器：CWE240自动核酸提取仪(此仪器为康为世纪自制)
匹配CWE240仪器具体操作如下：
1、样本裂解；按下表1向24DW深孔板中加入试剂：
表1深孔板中试剂表
2、吸附结合、漂洗、洗脱；
将“Spin tips pack for CWE2400”与24DW深孔板放入CWE240核酸提取仪的相应位置中，运行“cfDNA程序”。
3、约25分钟后仪器暂停，将“Plate 1”拿出仪器后立即放到冰上5-10分钟，然后按下表2加入试剂：
表2 Plate 1中试剂表
4、将24DW深孔板放回仪器中，继续运行程序。约55分钟后程序运行结束。把“Plate6”中的DNA洗脱产物转移至离心管中-20℃保存备用。
将加入试剂的深孔板和磁套放于核酸提取仪的相应位置，按照下
表3所示，运行自动化提取程序。
表3运行自动化提取程序表
实施例3：测试不同磁珠提取效果
实验材料：血浆样本；实施例1中制备的血浆样本提取试剂，其中磁珠分别选用国产磁珠1国产磁珠2和国产磁珠3
实验方法：取4等份(各1ml)血浆样本按照实施例2中匹配CWE240仪器的提取方案3运行仪器，进行自动化提取。
4份样本分为三组，分别进行三种提取处理：(国产磁珠组1)其中4份血浆样本采用康为世纪目前使用的国产磁珠进行提取；(国产磁珠组2)其中4份血浆样本采用生物公司A的国产磁珠，羟基修饰，粒径500nm的磁珠进行提取；(国产磁珠组3)其中4份血浆样本采用生物公司B，羧基修饰，粒径200nm的磁珠进行提取。
提取后的DNA使用Qubit2.0检测核酸样本浓度，荧光定量，结果如表4和表5所示，实验结果表明国产生物公司A，羟基修饰，粒径500nm的磁珠提取效果略优。
表4不同磁珠提取的核酸样本浓度表
表5不同磁珠提取的核酸样本CT表
实施例4:血浆样本提取试剂盒提取能力测试
实验材料：4个志愿者提供的血浆样本。
实验组试剂：实施例1中制备的血浆样本提取试剂(采用国产磁珠组3的磁珠)
对比组试剂：Thermo提取MagMAXTM游离DNA分离试剂盒(A29319)
实验方法：将4个志愿者抽取的血保存于血浆游离DNA保存管中(康为世纪，货号CWY055)，先用1600g,10min离心取上层血浆，再用16000g,10min离心去除残留的红细胞，将血浆分离出来，分别进行2种提取处理：
(A)实验组试剂-CWE240仪器提取组：取其中4份样本，每份样本按实施例3中提取程序方案运行仪器进行自动化提取；
(B)对比组试剂-Kingfisher仪器提取组：取其中4份样本(每份样本2ml)，采用Thermo的MagMAXTM游离DNA分离试剂盒按照说明书操作提取。
提取后的核酸用Qubit2.0进行DNA浓度检测，每组实验平行处理4个样本，实验数据为二个平行处理的均值。实验结果如表6、表7所示：
| 浓度ng/ul | 实验组-CWE240提取 | 对比组-Kingfisher提取 |
| 样本1 | 0.125 | 0.0448 |
| 样本2 | 0.123 | 0.0424 |
| 样本3 | 0.166 | 0.0564 |
| 样本4 | 0.172 | 0.069 |
表6血浆提取试剂盒提取浓度表
表7血浆提取试剂盒提取含量表
实验组提取组和对比组Kingfisher仪器提取组提取浓度相比，实验组CWE240仪器提取组提取浓度、含量(含量＝浓度X洗脱体积)均优于对比组Kingfisher仪器提取组；并且后续使用人KTB长短片段引物进行QPCR测定(通过长片段引物222bp，短片段引物97bp)，实验组CWE240仪器提取组检测Ct值低于对比组Kingfisher仪器提取组，其结果如图1和图2所示。
以上表明本实施例4提供的实验组试剂-CWE240仪器提取组提取试剂和方法采用的磁珠吸附法，提取浓度、含量较高，PCR检测Ct值更低，可以更好地满足后续核酸检测实验要求。
表8为实验组-CWE240提取和对比组-Kingfisher提取样本血浆提取试剂盒建库
| 含量 | 实验组-CWE240提取 | 对比组-Kingfisher提取 |
| 样本1 | 54 | 27.2 |
| 样本2 | 40 | 34 |
| 样本3 | 59.6 | 24.8 |
| 样本4 | 60.8 | 30.4 |
表8血浆提取试剂盒建库表
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在申请待批的本发明的权利要求保护范围之内。
Claims (9)
1.一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒，包括试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括蛋白酶K、裂解液、裂解结合液、漂洗缓冲液A、漂洗缓冲液B、洗脱液以及羟基磁珠；蛋白酶K、裂解液、裂解结合液、漂洗缓冲液A、漂洗缓冲液B、洗脱液的体积比为1：3.3：83.3：16：16：3.3。
2.根据权利要求1所述的一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于：所述裂解液为表面活性剂，裂解液为质量浓度为20%w/v的SDS十二烷基硫酸钠。
3.根据权利要求1所述的一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于：所述裂解结合液由摩尔浓度为1-6M的尿素或异硫氰酸胍或其组合物、质量浓度为0.5%-30%w/v的Tween-20吐温-20、1%-10% Triton-X100聚乙二醇辛基苯基醚、50-200mM的硫酸铵、金属离子螯合剂混合而成，pH为4.0-6.0。
4.根据权利要求3所述的一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于：所述金属离子螯合剂为1-10mM EDTA乙二胺四乙酸缓冲液、12%-20%的异丙醇、20-100mMTris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液混合而成，pH为4.0-6.0。
5.根据权利要求1所述的一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于：所述磁珠悬浮液为体积分数为70-80％的超顺磁微球，超顺磁微球的粒径介于50～100nm。
6.根据权利要求1所述的一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于：所述漂洗缓冲液A由摩尔浓度为0.5-4M的异硫氰酸胍和尿素、质量浓度为0.5%-30%w/vTween-20吐温-20、1-5% Triton-X100聚乙二醇辛基苯基醚、50-200mM硫酸铵、20-100mMTris-HCl缓冲液调节、10％-55％体积的异丙醇混合而成，pH为4.0-6.0。
7.根据权利要求1所述的一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于：所述漂洗缓冲液B由摩尔浓度为0.1-2M的氯化钠溶液、1-5 mM EDTA 乙二胺四乙酸、20-100mM Tris-HCl三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液、10％-55％体积的异丙醇混合而成，pH为6.0-8.0。
8.根据权利要求1所述的一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒，其特征在于：所述洗脱液选自无核酸酶水、Tris缓冲液、TE缓冲液中任一种。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的一种基于羟基磁珠提取血浆游离DNA的试剂盒使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：样本裂解；向离心管中依次加入30μL Proteinase K蛋白酶K、2 mL血浆、100μL20% SDS十二烷基硫酸钠， 放于60℃、1200 rpm恒温混匀仪上震荡20分钟，孵育结束后将离心管冰浴5-10 分钟；
步骤2：吸附结合；准备2.5ml裂解结合液、30ul磁珠形成裂解液/磁珠混合液加到步骤1的样本管中；涡旋震荡1分钟，然后手工上下颠倒或使用混匀仪混匀5-10分钟，使磁珠一直处于悬浮状态；
步骤3：漂洗；将离心管放于磁力架上静置，待磁珠吸附到磁力架上，管内溶液变澄清后，翻转离心管冲洗瓶盖上残留磁珠，再放置1分钟左右，之后弃去溶液；向离心管中加入1ml 漂洗缓冲液A，震荡混匀后将混悬液转移到新的1.5 ml离心管中；将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；向离心管中加入1 ml漂洗缓冲液A，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟；将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液。向离心管中加入1 ml漂洗缓冲液B，涡旋震荡5秒钟后放于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡结合2分钟；将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；重复漂洗缓冲液B步骤, 离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，开盖室温放置5-10分钟使乙醇充分挥发；
步骤4：洗脱；离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，开盖室温放置5-10分钟使乙醇充分挥发；向离心管中加入50-100μL无核酸酶水后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后将离心管固定于25℃、1600 rpm的恒温混匀仪上震荡洗脱10分钟；将离心管固定于磁力架上静置2分钟，待磁珠完全吸附于离心管侧壁后用移液器将洗脱液转移至新的离心管中-20℃保存备用。
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|---|---|---|---|---|
| CN117586952A (zh) * | 2024-01-19 | 2024-02-23 | 首都医科大学宣武医院 | 一种分离血浆外泌体的分离试剂及分离方法 |
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2023
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| CN117586952B (zh) * | 2024-01-19 | 2024-04-26 | 首都医科大学宣武医院 | 一种分离血浆外泌体的分离试剂及分离方法 |
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