CN116904442A - 一种高灵敏血浆游离核酸提取试剂盒、提取方法和应用 - Google Patents

一种高灵敏血浆游离核酸提取试剂盒、提取方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高灵敏血浆游离核酸提取试剂盒、提取方法和应用，所述试剂盒包括裂解结合液、硅羟基磁珠悬浮液；其中裂解结合液包括2‑5M的盐酸胍、1‑4％的十二烷基硫酸钠、10％PEG、10‑50mM的EDTA、10‑100mM的Tris、体积占比40‑80％的异丙醇、体积占比1‑4％的NP‑40；硅羟基磁珠悬浮液，磁珠粒径范围为40‑200nm，含量为10‑100mg/mL。采用该试剂盒能够从血浆样本中提取目标cfDNA，且其对血浆目标cfDNA的提取率高于市售游离DNA的提取率，检测灵敏度可达1ng/mL，能够应用于疾病检测、癌症早期筛查、癌症监测和无创产检等。

Description

一种高灵敏血浆游离核酸提取试剂盒、提取方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种高灵敏血浆游离核酸提取试剂盒、提取方法和应用。
背景技术
游离DNA(Circulating cell-free DNA，cfDNA)是游离于细胞外的部分降解的DNA片段，存在于人体的各种体液如血液、尿液、唾液、脑脊液等体液中。cfDNA一般起源于坏死、凋亡的细胞或肿瘤细胞，通常认为健康人体血浆cfDNA中180bp左右的DNA片段含量较高，而癌症患者血浆cfDNA中150bp左右的片段DNA含量较高，孕妇中胎儿的DNA大小在313-798bp，且在特定的生理条件或者疾病发生、发展过程中，cfDNA能够随着组织损伤、癌症和炎症反应等发生浓度变化。目前cfDNA已被广泛应用于实体器官移植后的组织排斥反应、妊娠期间胎儿非整倍体的无创产检和癌症早筛等领域。
现有研究表明，肿瘤患者cfDNA浓度水平与肿瘤阶段、大小、位置、治疗及预后因素有关。近年来，在肿瘤治疗过程中，通过监测血液cfDNA的动态变化或甲基化、突变来监测病情发展也得到临床医生的广泛重视。但血浆cfDNA分子片段小(通常认为血浆cfDNA主要分布在100-220bp)、浓度低且半衰期短(一般在0.5-2小时)，因其提取困难且容易受基因组DNA的影响，对检测方法的灵敏度和准确性要求高。
目前，血浆cfDNA的检测方法主要为硅膜离心柱吸附法和磁珠吸附法。离心柱吸附法提取核酸纯度较高，且操作复杂用时较长，需要多次高速离心，更换离心管等，无法适配高通量的提取仪器。磁珠吸附法由于能够与核酸自动提取仪配套使用实现高通量提取，是现有cfDNA提取研究的一个主要方向，如专利CN 107663521A血浆游离核酸提取试剂盒及其应用，该试剂盒主要是提取小于100bp和大于200bp的血浆核酸；专利CN114058616A一种基于磁珠法快速提取血浆游离核酸的试剂盒，该试剂盒主要是提取小于100bp和300bp的血浆核酸。虽然市售Qiagen循环核酸试剂盒能够提取大小在100-220bp的DNA，但是其对血浆cfDNA的检测灵敏度和提取率较低，一般获得的目标DNA含量较低难以达到下游直接检测的要求。因此，研究一种高灵敏磁珠法提取血浆cfDNA的提取试剂盒，利于提高对cfDNA的提取率和检测准确性，尤其是对大小在100-220bp的cfDNA，进而提高基于cfDNA的体外诊断的准确性。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种高灵敏血浆游离核酸提取试剂盒、提取方法和应用，其目的在于意外发现2-5M的盐酸胍、1-4％的十二烷基硫酸钠硫酸钠、10％的PEG6000(聚乙二醇)、10-50mM的EDTA(乙二胺四乙酸)、10-100mM的Tris(三羟甲基氨基甲烷)、体积占比40-80％的异丙醇、体积占比1-4％的NP-40(乙基苯基聚乙二醇)的裂解结合液，以及粒径范围为40-200nm，含量为10-100mg/mL的硅羟基磁珠，二者配合对大小在100-220bp的血浆cfDNA的结合提取能力强且检测灵敏度可达1ng/mL，其制备成的提取试剂盒能够提取多种大小在100-220bp的血浆cfDNA和300bp以上的cfDNA，其中对大小在150bp左右和180bp左右的cfDNA片段提取率分别可达98％和90％且对血浆cfDNA提取量高于市售Qiagen循环核酸试剂盒，由此解决现有血浆cfDNA提取试剂盒对游离DNA检测灵敏度和提取量较低的技术问题。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其包括裂解结合液、硅羟基磁珠悬浮液；
所述裂解结合液包括2-5M的盐酸胍、1-4％的十二烷基硫酸钠、10％PEG、10-50mM的EDTA、10-100mM的Tris、体积占比40-80％的异丙醇、体积占比1-4％的NP-40；
所述硅羟基磁珠悬浮液，磁珠粒径范围为40-200nm，含量为10-100mg/mL。
优选地，所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其所述裂解结合液为3-4M的盐酸胍、2-3％的十二烷基硫酸钠、10％PEG、30-50mM的EDTA、50-100mM的Tris、40-80％的异丙醇、体积占比2-3％的NP-40；所述硅羟基磁珠悬浮液，磁珠粒径范围为100-200nm，含量为50-100mg/mL。
优选地，所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，还包括carrier RNA，所述carrier RNA含量在0.3-1μg。
优选地，所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其还包括蛋白酶K溶液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液。
优选地，所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其所述洗涤液1包括2-4M的盐酸胍、10-100mM的Tris、1-10mM的EDTA、体积占比1-4％的NP-40、体积占比30-60％的异丙醇；所述洗涤液2包括体积占比70-80％的乙醇、10-100mM的Tris-HCL，pH为7.5-8。
优选地，所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其所述洗脱液包括1-10mM的乙二胺四乙酸二钠、10-100mM的Tris-HCL，pH为7.5-8。
按照本发明的另一方面，还提供了一种血浆cfDNA的提取方法，其采用如本发明所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒进行提取。
优选地，所述血浆cfDNA的提取方法，其具体包括以下步骤：
取1-3mL血浆样本，加入1.5-4.5mL裂解结合液和20-60μL硅羟基磁珠进行裂解结合，混匀后30-40℃孵育20-30min，吸磁，弃掉液体，获得裂解结合混合物，经洗涤、洗脱后即为提取的目标cfDNA，所述目标cfDNA包括大小在100-220bp的cfDNA。
优选地，所述血浆cfDNA的提取方法，其在裂解结合时还添加0.3-1μg carrierRNA和100-500μL蛋白酶K溶液。
按照本发明的另一方面，还提供了一种如本发明所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒在制备基于cfDNA的体外诊断试剂中的应用，其所述基于cfDNA的体外诊断试剂包括癌症早筛试剂或无创产检检测试剂。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明提供的高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，由于该裂解结合液中1-4％的十二烷基硫酸钠(SDS)能够使游离DNA和蛋白质离析释放出纯的cfDNA，但是对细胞膜的破环强度较弱，利于减少基因组DNA被释放出来；另外在10-50mM的EDTA和2-5M的盐酸胍的协同作用下能够快速有效抑制核酸酶，可同时避免细胞内基因组DNA和细胞外游离DNA被降解，影响不同片段大小cfDNA检测的准确性；而体积占比40-80％的异丙醇和体积占比1-4％的NP-40利于提取纯的cfDNA。实验结果表明，本发明提供的血浆cfDNA提取试剂盒对100-220bp的cfDNA的结合提取能力强且其检测灵敏度可达1ng/mL，其对cfDNA的提取率和检测准确性高于市售血浆游离DNA提取试剂盒，其中对150bp左右和180bp左右的cfDNA片段提取率分别可达98％和90％，利于提高癌症早筛的准确性，市场应用前景广阔。
附图说明
图1是实施例4中提取的cfDNA毛细管电泳图；
图2是实施例5中3种提取试剂盒提取的cfDNA毛细管电泳图；
图3是实施例6中提取cfDNA结果；
图4是实施例7中手动提取cfDNA结果；
图5是实施例8中cfDNA提取试剂盒的灵敏度测试结果；
图6是实施例8中提取的cfDNA实时荧光定量检测结果；
图7是不同磁珠对不同大小cfDNA提取效果的比较；
图8是实施例2中本发明提取试剂盒与市售提取试剂盒对cfDNA提取效果的比较。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
现有的核酸提取试剂盒的开发主要是以血液为实验材料，筛选符合要求的提取试剂，进而制备成提取试剂盒，但血液中难免会残留一些基因组DNA，虽然基因组DNA主要存在于细胞内，游离DNA存在于细胞外，但无论是细胞内基因组DNA还是细胞外游离DNA都会与组蛋白结合在一起，提取时都需要先裂解使DNA与蛋白质分离。然而绝大部分磁珠会优先吸附基因组DNA或者大片段DNA，即对基因组DNA或者大片段DNA结合提取能力强，容易影响真实游离DNA检测的准确性。而本发明根据血浆游离DNA分布的特性，针对性的筛选和研发对100-220bp大小游离DNA结合提取能力强的磁珠以及提取试剂。
本发明基于人体血浆cfDNA的大小分布与哺乳动物血浆cfDNA的大小分布相吻合的特点，从成年试验兔中分离血浆并提取cfDNA，发现提取的cfDNA片段大小主要分布在100-220bp以及少量在320-350bp，其中集中分布在180bp左右。基于此，本发明通过扩增不同预设大小的GAPDH基因片段(100、120、140、160、180、200和320bp)，回收纯化扩增的DNA片段并测定其对应的实际片段大小，依据获得的DNA片段由小到大按照质量比例为1～2:1～2:1～2:1～2:1～2:1～2:0.5～1混合，作为血浆cfDNA的标准品。将获得的血浆cfDNA标准品与哺乳动物血浆或血清按照预设比例混合，使cfDNA总浓度在1-200ng/ml，即为模拟的含cfDNA标准品的血浆或血清样本。
基于现用现配的模拟血浆或血清样本，研究比较不同提取试剂对上述各片段cfDNA的提取效果，结果发现2-5M的盐酸胍、1-4％的十二烷基硫酸钠硫酸钠、10％的PEG6000、10-50mM的EDTA、10-100mM的Tris、体积占比40-80％的异丙醇、体积占比1-4％的NP-40的裂解结合液，以及粒径范围为40-200nm，含量为10-100mg/mL的硅羟基磁珠，二者配合能够提取模拟血浆样本中各片段的cfDNA，经验证提取物为对应片段大小的cfDNA标准品，且各片段回收率多数在75％以上，尤其是在裂解结合时添加carrier RNA，提取物中大小在150bp左右和180bp左右的DNA片段回收率分别可达98％和90％，并得到动物血液提取效果的验证。
基于上述发现，本发明提供了一种高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其包括裂解结合液、硅羟基磁珠悬浮液；
所述裂解结合液包括2-5M的盐酸胍、1-4％的十二烷基硫酸钠、10％PEG、10-50mM的EDTA、10-100mM的Tris、体积占比40-80％的异丙醇、体积占比1-4％的NP-40；
实验中发现该裂解结合液中1-4％的十二烷基硫酸钠(SDS)能够使游离DNA和蛋白质离析释放出纯的cfDNA，但是对细胞膜的破环强度较弱，利于减少基因组DNA被释放出来；另外10-50mM的EDTA能够有效螯合Mg2+和Mn2+，抑制细胞中核酸酶活性，可避免样本中残留细胞中的基因组DNA在细胞内被降解成小片段DNA而释放出来，影响游离DNA的检测结果；而盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，可避免游离出来的纯DNA被进一步降解，影响不同大小cfDNA片段真实浓度的检测准确性。在该体系中2-5M的盐酸胍和10-50mM的EDTA的协同作用下能够同时避免基因组DNA在细胞内或细胞外被降解成小片段DNA以及细胞外游离DNA进一步地降解，能够提高不同片段大小cfDNA的检测准确性。而在体积占比40-80％的异丙醇和体积占比1-4％的NP-40的共同作用下能够促进与蛋白质分离后的cfDNA的沉淀，利于cfDNA与多糖、蛋白质等杂质进一步分离，进而提取纯的cfDNA。
所述硅羟基磁珠悬浮液，磁珠粒径范围为40-200nm，含量为10-100mg/mL。
实验结果意外发现，上述裂解结合液和40-200nm的硅羟基磁珠配合，对大小在100-220bp中各片段的cfDNA的结合提取能力强，且强于对大片段DNA的结合能力，其对血浆cfDNA的提取量高于市售Qiagen循环核酸试剂盒，且对血浆cfDNA提取准确性高于市售Qiagen循环核酸试剂盒。
优选所述裂解结合液为3-4M的盐酸胍、2-3％的十二烷基硫酸钠、10％PEG、30-50mM的EDTA、50-100mM的Tris、40-80％的异丙醇、体积占比2-3％的NP-40。
所述硅羟基磁珠悬浮液，磁珠粒径范围为100-200nm，含量为50-100mg/mL。
优选所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，还包括0.3-1μg的carrier RNA，优选所述carrier RNA大小在100-300bp，实验发现在裂解结合时添加0.3-1μg的carrier RNA可以替代目标cfDNA被有机试剂吸附，减少被吸附的目标cfDNA量，利于保留更多目标cfDNA；实验结果表明，裂解结合过程中添加carrier RNA的提取率明显高于不添加carrier RNA，尤其是添加carrier RNA后，对大小在140-160bp、160-180bp和180-200bp的DNA片段回收率均可达90％以上。
更优选所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，还包括蛋白酶K溶液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液。
在一些实施例中所述蛋白酶溶液中蛋白酶K的浓度为20mg/mL，提取试剂盒中的蛋白酶K可使离析后的蛋白质进一步降解，利于提高提取目标cfDNA的纯度。
在一些实施例中优选所述洗涤液1包括2-4M的盐酸胍、10-100mM的Tris、1-10mM的EDTA、体积占比1-4％的NP-40、体积占比30-60％的异丙醇；
在一些实施例中优选所述洗涤液2包括体积占比70-80％的乙醇、10-100mM的Tris-HCL，pH为7.5-8；
在一些实施例中优选所述洗脱液包括1-10mM的乙二胺四乙酸二钠、10-100mM的Tris-HCL，pH为7.5-8。
另外，本发明还提供了一种血浆cfDNA的提取方法，其采用本发明所述血浆cfDNA提取试剂盒进行提取，具体包括以下步骤：
(1)裂解结合：取1-3mL血浆样本，加入1.5-4.5mL裂解结合液和20-60μL硅羟基磁珠，混匀后30-40℃孵育20-30分钟，吸磁，弃掉液体，获得裂解结合混合物；
优选裂解结合时还添加0.3-1μg carrier RNA和100-500μL蛋白酶K溶液；
(3)洗涤洗脱：分别向(1)中加入800-1000μL的洗涤液1和洗涤液2依次进行洗涤，再加入50-100μL洗脱液洗脱，获得提取物cfDNA，获得的提取物cfDNA可以经毛细管电泳进行验证和实时荧光定量检测。
本发明提供的提取方法，能够实现裂解和结合同步进行，无需先裂解后结合，蛋白酶K在一定温度范围内随着温度升高其活性增加，在磁珠法提取DNA时蛋白酶K一般在60-65℃条件下活性最佳，而本发明提供的提取方法在该裂解结合液体系下在40℃条件下孵育的提取效果反而优于现有试剂盒在60-65℃条件下孵育提取效果。
另外，本发明还提供了一种如本发明所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒在制备基于cfDNA的体外诊断试剂中的应用，其所述基于cfDNA的体外诊断试剂包括癌症早筛试剂或无创产检检测试剂。
以下为实施例：
本实施例中以模拟的血浆样本为待提取样本，以提取的不同片段大小的cfDNA种类及各大小片段cfDNA的提取率为评价指标，筛选能够特异性提取大小在100-220bp的cfDNA且提取率较高的提取试剂，并按照筛选的提取试剂制备成cfDNA提取试剂盒，其中模拟的血浆样本，按照如下方法获得：
(1)制备目的DNA片段标准品：将293悬浮细胞培养至2×106，提取细胞总RNA，并且反转录获得cDNA。使用该cDNA以及相应的引物、dNTP、高保真酶等进行聚合酶链式反应(PCR)，分别获得预设大小为100bp，120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，320bp的DNA片段；所述引物基于GAPDH基因设计，具体的序列如下：
F:ATGGTTTACATGTTCCAATATGATTCC；
100R：TGGTGATGGGATTTCCATTGATG；
120R：GGGATCTCGCTCCTGGAAGATG；
140R：TCGCCCCACTTGATTTTGGA；
160R：CGACGTACTCAGCGCCAGCA；
180R：GAAGACGCCAGTGGACTCCA；
200R：CCAGCCTTCTCCATGGTGGT；
320R：TTGCTGATGATCTTGAGGCT；
PCR结束后，采用琼脂糖电泳进行鉴定、纯化回收。回收完成后，进行毛细管电泳检测DNA片段大小，结果显示，上述聚合酶链式反应获得的DNA片段主峰大小分别为104bp、127bp、149bp、170bp、189bp、208bp、335bp，即为目的DNA片段，以获得的目的DNA片段作为血浆cfDNA的模拟标准品。
(2)制备含cfDNA的血浆模拟样本：按照(1)获得的血浆cfDNA的模拟标准品，按照DNA片段从小到大以1:1:1:1:1:1:0.5质量比例配制，并稀释于胎牛血清，即为含7种不同大小cfDNA的血清模拟样本。其中模拟样本中cfDNA大小及浓度可以依据实验要求进行调整。
基于上述血清模拟样本筛选的cfDNA提取试剂盒，具体如下：
实施例1cfDNA提取试剂盒1
所述试剂盒1，包括裂解结合液、磁珠悬浮液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液、蛋白酶K溶液和carrier RNA溶液；
所述裂解结合液为4M的盐酸胍、2％的十二烷基硫酸钠、10％PEG、30mM的EDTA、100mM的Tris、80％的异丙醇、体积占比3％的NP-40；
所述磁珠悬浮液为硅羟基磁珠，粒径范围为100-200nm，含量为100mg/mL；
所述洗涤液1为3M盐酸胍、100mM的Tris、5mM的EDTA、体积占比3％的NP-40、体积占比50％的异丙醇；
所述洗涤液2为体积占比75％的乙醇、100mM的Tris-HCL(pH＝7.5-8)；
所述洗脱液为5mM的乙二胺四乙酸二钠、100mM的Tris-HCL(pH＝7.5-8)；
所述蛋白酶K溶液，其蛋白酶K的浓度为20mg/mL；
所述carrier RNA溶液，其carrier RNA浓度为0.2μg/μL。
实施例2cfDNA提取试剂盒2
所述试剂盒2，包括裂解结合液、磁珠悬浮液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、蛋白酶K溶液；
所述裂解结合液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液以及蛋白酶K溶液同实施例1；
所述磁珠悬浮液为硅羟基磁珠，粒径范围为40-100nm，含量为100mg/mL。
实施例3cfDNA提取试剂盒3
所述试剂盒3，包括裂解结合液、磁珠悬浮液、洗涤液1、洗涤液2、洗脱液、蛋白酶K溶液和carrier RNA浓度；
所述裂解结合液为2M的盐酸胍、4％的十二烷基硫酸钠、10％PEG、50mM的EDTA、50mM的Tris、40％的异丙醇、体积占比2％的NP-40；
所述磁珠悬浮液为硅羟基磁珠，粒径范围为100-200nm，含量为50mg/mL；
所述洗涤液1为1M盐酸胍、100mM的Tris、3mM的EDTA、体积占比4％的NP-40、体积占比40％的异丙醇；
所述洗涤液2为体积占比75％的乙醇、100mM的Tris-HCL(pH＝7.5-8)；
所述洗脱液为5mM的乙二胺四乙酸二钠、100mM的Tris-HCL(pH＝7.5-8)；
所述蛋白酶K溶液，其蛋白酶K的浓度为20mg/mL；
所述carrier RNA溶液，其carrier RNA浓度为0.2μg/μL。
实施例4基于血清模拟样本提取cfDNA
称取50ng的cfDNA标准品，其中片段大小为104bp、127bp、149bp、170bp、189bp、208bp、335bp的DNA质量比为1:1:1:1:1:1:0.5，稀释于0.2mL胎牛血清中，制备成含cfDNA的血清模拟样本，采用实施例1中的cfDNA提取试剂盒进行cfDNA提取，具体如下：
取1mL的血清模拟样本，利用24通道核酸提取仪(本实施例中使用的核酸提取仪由纳磁生物科技有限公司提供)，进行批量提取，打开仪器电源，待仪器完成自检后，按下表所示设置仪器参数：
步骤 第1步 第2步 第3步 第4步 第5步 第6步
工位 1 2 3 4 5 4
等待 00:00:00 00:00:00 00:00:00 00:00:00 00:02:00 00:00:00
混合 2 2 2 2 1 2
混合 00:20:00 00:01:00 00:01:00 00:01:00 00:05:00 00:00:30
是否 否 否 否 否 否 否
吸磁 00:02:00 00:01:00 00:01:00 00:01:00 00:02:00 00:00:00
温度 40℃ -- -- -- 60℃ --
样本和试剂设置：
(1)取5个深孔板，分别用于工位1、工位3、工位4、工位5、工位6；
(2)在工位1深孔板中依次加入200μL蛋白酶K、1mL样本、1.5mL裂解结合液、2.5μLcarrier RNA和40μL的磁珠；
(3)工位2深孔板中加入1000μL洗涤液1；
(4)工位3和工位5深孔板中加入1000μL洗涤液2；
(5)工位5深孔板中加入55μL洗脱液；
(6)全部深孔板放入相应工位后，关闭舱门，继续运行程序。
(7)自动化程序结束后，工位5的深孔板内为提取的核酸样品。若要长时间保存，可以封装或转移至干净的无核酸酶离心管中。
(8)将提取的cfDNA进行毛细管电泳，结果如图1所示，并统计每种cfDNA片段的平均提取浓度和回收率，结果如表1所示。
表1不同片段大小cfDNA的提取浓度及回收率
由图1可知，该提取试剂盒提取的目标物大小与样本中标准物一一对应，说明能够准确提取各小片段的目标cfDNA。
由表1可知，采用本发明提供的提取试剂盒提取血清模拟样本中cfDNA标准品，与血清模拟样本中的标准品DNA片段(104bp、127bp、149bp、170bp、189bp、208bp、335bp)对比可知，本发明的总回收率达82.4％，对于片段170-189bp的回收率高达90％，对于片段149bp的回收率高达98％，而对片段335bp的回收率为67％，说明本发明提供的提取试剂盒对小片段cfDNA具有高回收率。
实施例5基于血浆模拟样本提取cfDNA
将30ngcfDNA标准品，其中片段大小为108bp、132bp、156bp、177bp、193bp、215bp、343bp的DNA质量比为1:1:1:1:1:1:0.5，稀释于0.2mL兔血浆中，制备成含cfDNA的血浆模拟样本，取3份血浆模拟样本，分别采用实施例1-3中的cfDNA提取试剂盒进行cfDNA提取，其中试剂盒1和试剂盒3提取方法同实施例4，试剂盒2中不含carrier RNA，故工位1不用加carrier RNA，其他同实施例4。
将提取的cfDNA进行毛细管电泳，结果如图2所示，并统计每组每种cfDNA片段的提取浓度和55μL洗脱液中cfDNA的总量，结果如表2所示。
表2提取的不同片段大小cfDNA的浓度及提取总量
式中，总提取率＝提取cfDNA总量/cfDNA标准品添加量×100％；
由图2可知，本发明提供cfDNA提取试剂盒能够模拟样本中7种大小的cfDNA，且总提取率均在80％以上，整体提取效果较佳。
实施例6基于兔血浆提取cfDNA
兔血浆制备：使用麻醉机麻醉试验兔，然后采用耳源采血方式，取适量静脉血，采血管采用EDTA-2K抗凝剂，采血后马上进行血浆分离，分离后的血浆分成3等份，每份3mL，采用实施例1中的提取试剂盒重复提取cfDNA，提取步骤同实施例4，结果如图3所示，其中55μL洗脱液中cfDNA提取总量如表3所示。
表3提取试剂盒提取稳定性
由表3可知，本发明提供的试剂盒提取cfDNA的重复性好，提取稳定性高，尤其是对主峰189bp的cfDNA提取量最高，且显著高于400bp和597bp的提取量，说明本提取试剂盒对小片段100-220bp的cfDNA的结合提取能力强。
实施例7基于兔血浆样本手动提取cfDNA
取兔血浆样本2等份，采用实施例1中的提取试剂盒进行提取，其中一份采用核酸自动提取仪提取，同实施例4，另一份采用手动提取，具体如下：
(1)裂解结合：在15mL离心管中，加入25μL蛋白酶K、3mL兔血浆样本、4.5mL裂解结合液和2.5μL carrier RNA；涡旋振荡混匀后，40℃孵育30min，获得裂解结合混合物。
(2)将离心管移至磁力架上，吸磁5min，澄清后，弃上清。
(3)从磁力架上取下离心管，向管中加入1mL洗涤液1，涡旋振荡混匀5-10秒，将其转移到新的1.5mL离心管中；将离心管放入磁力架，吸磁5min，澄清后，将上清吸回原来的15mL离心管，润洗管壁和管盖，将其转移到1.5mL离心管中。
(4)将离心管放入磁力架，吸磁5min，澄清后，弃上。
(5)向离心管中加入1mL洗涤液2，涡旋振荡混匀5-10s。
(6)瞬时离心，将离心管放入磁力架，吸磁2min，澄清后，弃上清。
(7)重复步骤(5)-(6)步骤。
(8)瞬时离心，使用小量程移液枪，小心吸出剩余上清。
(9)开启1.5mL离心管，室温晾干磁珠5分钟。
(10)向1.5mL离心管中加入50μL洗脱液，涡旋振荡5-10秒，混匀后60℃静置5min。
(11)瞬时离心，将离心管放入磁力架，吸磁3-5min，澄清后，吸取DNA溶液转移至新的离心管中。
(12)将提取的cfDNA进行毛细管电泳，结果如图4所示。
由图4可知，采用本发明提供的cfDNA提取试剂盒无论是核酸自动仪提取还是手动提取，两者峰型相同，提取的目标物是一样的，各目标物的含量也几乎相同，即两种提取方法提取效果几乎相同，说明手动提取效果也很好。
实施例8cfDNA提取试剂盒的灵敏度测试
(1)制备血清模拟样本：分别取1ng、10ng、100ng、1000ng实施例1获得的目的DNA片段，加入1mL胎牛血清中，制备成含不同浓度cfDNA的血清模拟样本。
(2)cfDNA提取：取步骤(1)的模拟样本1mL，采用实施例1中提取试剂盒，按照实施例4中的提取方法进行cfDNA提取，不同浓度的模拟样本的cfDNA提取结果如图5所示，并进行实时荧光定量检测，结果如图6所示。
由图5可知，模拟样本中cfDNA浓度低至1ng/mL，采用本发明提供的提取试剂盒也能够检测出cfDNA，说明本发明提供的提取试剂盒灵敏度高。
由图6可知，提取物的实时荧光定量检测的CT值与模拟样本中cfDNA标准品的总量呈现线性关系，关系式为y＝-3.382x+23.958，R2＝0.9995，说明当样本中核酸浓度低至1ng时，仍然能提取出cfDNA，且随着核酸浓度的升高，提取产物呈线性增加，再次说明本试剂盒对cfDNA的提取效果佳。
对比例1
除试剂盒中磁珠不同外，其他提取试剂同实施例1，其中磁珠A为硅羧基-50nm，磁珠B为本发明所述的硅羟基磁珠40-200nm，磁珠C为硅羟基-500nm。
称取150ng的cfDNA标准品，其中片段大小为116bp、139bp、161bp、184bp、202bp、225bp、356bp的DNA质量比为1:1:1:1:1:1:0.5，稀释于1mL胎牛血清中，制备成含cfDNA的血清模拟样本，以此血清模拟样本进行cfDNA的提取，按照实施例4的提取步骤进行提取，比较不同磁珠对不同大小cfDNA提取效果，提取物电泳结果如图7所示，cfDNA提取量如表4所示：
表4不同磁珠对cfDNA提取量的比较
各片段cfDNA提取浓度可由图7获知，虽然本发明中提取试剂与不同磁珠配合都能够提取模拟样本中的7种cfDNA，但各片段cfDNA提取浓度存在差异；由表4可知，本发明中提取试剂盒中提取试剂与40-200nm的硅羟基磁珠配合，提取的各片段cfDNA产量均最高，其总提取率在90％以上且显著高于其他磁珠的提取率。
对比例2
以市售Qiagen循环核酸试剂盒为对照，分别取人体血浆样本3ml进行cfDNA的提取，其中实施例2中的提取试剂盒具体的按照实施例4的提取步骤进行提取，市售Qiagen循环核酸试剂盒的提取步骤根据其说明书进行提取，其中提取试剂盒Qiagen提取过程先裂解后结合，并于60℃条件下孵育，两种试剂盒对cfDNA提取结果如图8及下表5所示。
表5cfDNA提取总量的比较
提取试剂盒 cfDNA提取总量(单位：ng)
实施例2提供的提取试剂盒2 9.291
市售提取试剂盒Qiagen 8.067
结果显示，相比市售提取试剂盒Qiagen，本试剂盒提取的cfDNA产量更高，相比现有市售试剂盒，本试剂盒提取的血浆cfDNA量增加了15％。
由图8可知，两种提取试剂盒提取的cfDNA大小都在100-220bp之间，其中本发明提供的cfDNA提取试剂盒提取的血浆cfDNA主峰在180-190bp，而市售提取试剂盒Qiagen主峰约为210bp，可见本试剂盒提取结果与现有报道的健康人体血浆cfDNA集中在180bp左右的结果一致，说明相比现有市售提取试剂盒，本发明提供的血浆游离核酸提取试剂盒提取的准确性更高。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其特征在于，包括裂解结合液、硅羟基磁珠悬浮液；
所述裂解结合液包括2-5M的盐酸胍、1-4％的十二烷基硫酸钠、10％PEG、10-50mM的EDTA、10-100mM的Tris、体积占比40-80％的异丙醇、体积占比1-4％的NP-40；
所述硅羟基磁珠悬浮液，磁珠粒径范围为40-200nm，含量为10-100mg/mL。
2.如权利要求1所述的高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其特征在于，所述裂解结合液为3-4M的盐酸胍、2-3％的十二烷基硫酸钠、10％PEG6000、30-50mM的EDTA、50-100mM的Tris、40-80％的异丙醇、体积占比2-3％的NP-40；所述硅羟基磁珠悬浮液，磁珠粒径范围为100-200nm，含量为50-100mg/mL。
3.如权利要求1或2所述的高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其特征在于，所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，还包括carrier RNA，所述carrier RNA含量在0.3-1μg。
4.如权利要求3所述的高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其特征在于，还包括蛋白酶K溶液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液。
5.如权利要求4所述的高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液1包括2-4M的盐酸胍、10-100mM的Tris、1-10mM的EDTA、体积占比1-4％的NP-40、体积占比30-60％的异丙醇；所述洗涤液2包括体积占比70-80％的乙醇、10-100mM的Tris-HCL pH为7.5-8。
6.如权利要求5所述的高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包括1-10mM的乙二胺四乙酸二钠、10-100mM的Tris-HCL，pH为7.5-8。
7.一种血浆cfDNA的提取方法，其特征在于，采用如权利要求1至6任意一项所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒进行提取。
8.如权利要求7所述的血浆cfDNA的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
取1-3mL血浆样本，加入1.5-4.5mL裂解结合液和20-60μL硅羟基磁珠进行裂解结合，混匀后30-40℃孵育20-30min，吸磁，弃掉液体，获得裂解结合混合物，经洗涤、洗脱后即为提取的目标cfDNA，所述目标cfDNA包括大小在100-220bp的cfDNA。
9.如权利要求8所述的血浆cfDNA的提取方法，其特征在于，在裂解结合时还添加0.3-1μg carrier RNA和100-500μL蛋白酶K溶液。
10.一种如权利要求1至6任意一项所述高灵敏血浆cfDNA提取试剂盒在制备基于cfDNA的体外诊断试剂中的应用，其特征在于，所述基于cfDNA的体外诊断试剂包括癌症早筛试剂或无创产检检测试剂。
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