CN108642044A - 用于提取病毒核酸的试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于提取血筛混检样本中病毒核酸的试剂盒和方法，试剂盒包括裂解液、结合液、第一漂洗液、第二漂洗液、洗脱液、二氧化硅磁珠、蛋白酶K和核酸助沉剂，其中，第一漂洗液含有结合液和柠檬酸钠。本发明还公开了一种快速检测血浆\血清中病毒的方法。采用本发明的试剂盒和方法，在特定的pH下可以从样本中轻松捕获微量病毒核酸，所得核酸回收率高；操作流程简洁，30min内即可完成病毒核酸的提取纯化，比现有的大多数商品化试剂盒都省时省力；而且针对的样本体积量大，可以对小体积样本合并提取，节省时间，节省试剂。

Description

用于提取病毒核酸的试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及核酸纯化技术领域，尤其是用于提取血清\血浆中病毒核酸的方法和试剂盒。
背景技术
核酸的提取纯化是进行分子生物学各项研究的基础，特别是在分子诊断领域，PCR、RT-PCR、Northern blot、RT-qPCR、cDNA文库构建、酶切等技术手段都需要纯度高、完整性好的核酸。但由于外源及内源性核酸酶的存在及其酶活性相当稳定等原因，使得提取和纯化高质量的核酸相对比较困难。核酸提取试剂配方对核酸的质量和得率有很大的影响，因此研发高效快速、回收范围广、得率高的核酸提取试剂是本领域不断探索的课题。磁珠法作为近年来兴起的新型核酸提取方法，主要原理是基于磁性纳米材料一在高盐环境下对核酸进行特异性的吸附，经过磁性分离和漂洗杂质后，在低盐溶液中被洗脱下来，从而达到对核酸进行提取纯化的目的。
目前市场上用于核酸提取的裂解液种类较多，常见的有经典的TRIzol、CATB-LiCl、碱裂解液等。TRIzol含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞内源性核酸酶，保持提取核酸的完整性；但是其用时操作繁琐、费时，提取样本中核酸的质量不佳。CATB-LiCl在低离子强度的溶液中可与核酸形成不溶的复合物，有利于去除多糖、酚类等杂质，常被用来提取植物样本材料的核酸，有局限性。碱裂解是最早的核酸的提取方法，但利用碱裂解液裂解所得的核酸含有大量杂质，严重干扰下游实验。经检索，从用于血液筛查(简称血筛)的混检样本中血浆或血清等样本中快速提取病毒核酸的试剂盒，及其在利用磁珠法提取病毒核酸中的应用还未见报道。
传统的核酸提取方法用时操作繁琐、费时，如硅胶膜吸附法需要多次离心，容易出现交叉污染等问题。然而，目前市面上的磁珠法病毒核酸提取试剂盒主要是针对小样本小体积的试验，对于血站或临床批量的体检样本，无法做到一次性快速提取，耗费时间较长，而且分多次提取，发生污染的风险会增大。
发明内容
基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于血液筛查的混检样本中病毒核酸的提取方法，采用该提取方法提取病毒核酸具有快速高效的优势，而且该方法能提取大体积样本中的病毒核酸，样本体积可达2.4ml。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：
在一个方面，本发明提供一种用于提取血筛混检样本中病毒核酸的试剂盒，包括裂解液、结合液、第一漂洗液、第二漂洗液、洗脱液、二氧化硅磁珠、蛋白酶K和核酸助沉剂，其中，所述第一漂洗液含有所述结合液和柠檬酸钠。优选地，所述裂解液含有高氯酸钠、Tris-HCl、EDTA、DTT和Triton X-100。
优选地，所述结合液中含有高氯酸钠、DEPC水和无水乙醇。
优选地，所述第二漂洗液中含有DEPC水和无水乙醇。
优选地，所述洗脱液为Tris-HCl和DEPC水的溶液。
优选地，所述蛋白酶K采用DEPC水溶解。
在另一个方面，本发明提供一种血筛混检样本中病毒核酸的提取方法，采用上述试剂盒提取病毒核酸，具体包括如下步骤：(1)样本准备：取灭活处理后的血清或血浆若干份，每份体积相同，分别标记和编号，将若干份血清或血浆合并成1份待测样本；
(2)设置阳性对照和阴性对照样本；其中，阳性对照样本为血站经检测已经确认为某病毒阳性的灭活血浆，阴性对照样本为血站经检测已经确认为某病毒阴性的灭活血浆；或者，为采购于中国食品药品鉴定研究院的对照样本；
(3)核酸提取阶段：
1)向深孔板1中加入第一漂洗液，放到核酸提取仪器相应卡槽上；
2)向深孔板2中加入第二漂洗液，放到核酸提取仪器相应卡槽上；
3)向洗脱管中加入洗脱液，放到核酸提取仪器相应卡槽上；
4)将磁力套板放到核酸提取仪器相应卡槽上；
5)往深孔板3中依次加入所述待测样本、蛋白酶K溶液、核酸助沉剂和裂解液；
6)核酸提取仪器初始化，然后按设定提取程序进行样本裂解；
7)裂解完成后，核酸提取仪器暂停；
8)取出深孔板3，依次加入纳米磁珠，结合液；
9)继续运行核酸提取仪器，直至提取完成。
其中，核酸助沉剂为AcrylCarrier(从市场购得)；所述血清或血浆优选为12份，每份为200μL；提取的仪器为中山大学达安基因股份有限公司研发的全自动核酸提取仪，型号为DA3000；提取的程序为：裂解8分钟，结合15分钟，洗涤液1洗涤2分钟，洗涤液2洗涤2分钟，静置5分钟，洗脱2分钟。
优选地，所述步骤(1)中待测样本体积为2.4mL；不足2.4mL的待测样本用经鉴定后的阴性空白血浆补足。
在第三个方面，本发明还提供一种快速检测血浆\血清中病毒的方法，包括如下步骤：将12人份的血浆/血清样品合并为一个检测样本，采用权利要求1～6任一项的试剂盒进行提取，若提取的核酸经PCR检测相应的病毒DNA/RNA为阴性，则判定为该12个人的血浆/血清样品为阴性；若出现阳性结果，则分别采用PCR检测各人的血浆/血清样本。
优选地，所述PCR为荧光定量PCR。
综上所述，本发明的有益效果为：
本发明的试剂盒在特定的pH(pH＝6.5)下可以从样本中轻松捕获微量病毒核酸，所得核酸回收率高；操作流程简洁，30min内即可完成病毒核酸的提取纯化，比现有的大多数商品化试剂盒都省时省力；而且针对的样本体积量大，可以对小体积样本合并提取，节省时间，节省试剂。
附图说明
图1为本发明的实施例3的荧光定量PCR的结果图；
图2为本发明的实施例4的荧光定量PCR的结果图。
具体实施方式
本申请的发明人从实用角度出发，研发出一种能够在大体积的样本中快速、高效的提取纯化病毒的核酸的方法，并且对DNA或RNA病毒同时具有很好的兼容性；同时，研发出一种快速、高效的用于血筛混检样本的病毒核酸提取试剂盒；本发明的试剂盒针对样本的提取体积量是2.4mL，是目前市面仍未开发的大体积提取产品，具有重要的现实意义。
本申请的发明人通过大量实验筛选得到合适的核酸提取试剂配方，用于提取血筛混检的病毒核酸提取。以血筛试验为例，单人份的检测样本体积为200μL血浆/血清，本发明可以把12人份的血浆/血清合并为一检测样本进行提取，若提取的核酸经PCR检测相应的病毒DNA/RNA为阴性，则判定为该12个单人份样品为阴性；若出现阳性，则再分别单独检测各人份的样本，这样的混检和单检相结合的模式可以节省大量时间和试剂，提高效率。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明的用于提取血筛混检样本中病毒核酸的试剂盒的一种实施例，包括的成分及其浓度如下:
洗脱液：10mM Tris-HCl(pH8.0)-DEPC水溶液；
磁珠：商业化二氧化硅磁珠；
蛋白酶K：商业化产品，用DEPC水溶解，终浓度为20mg/mL；
核酸助沉剂：商业化Acryl Carrier。
实施例2
本发明的血筛混检样本中病毒核酸的提取方法的一种实施例，包括如下步骤：
1)样本准备：取血站或临床样品灭活处理后的血清或血浆，每份200μL，12份合并成1份2.4mL待测样本，分别标记和编号，不足2.4mL的样本用经鉴定后的阴性空白血浆补足。
2)设置阳性对照和阴性对照样本；其中，阳性对照样本为血站经检测已经确认为乙肝病毒阳性的灭活血浆，阴性对照样本为血站经检测已经确认为乙肝病毒阴性的灭活血浆；
3)仪器运行阶段：
(1)往深孔板1中加入3mL漂洗液1，放到仪器相应卡槽上；
(2)往深孔板2中加入3mL漂洗液2，放到仪器相应卡槽上；
(3)往洗脱管中加入200μL洗脱液，放到仪器相应卡槽上；
(4)把磁力套板放到仪器相应卡槽上；
(5)往深孔板3中依次加入2.4mL样本，100μL蛋白酶K溶液，7μL核酸助沉剂AcrylCarrier，2.4mL裂解液；
(6)仪器运行初始化，按设定提取程序进行样本裂解；
(7)裂解完成后，仪器暂停；
(8)取出深孔板3，依次加入80μL纳米磁珠，7.7 mL结合液；
(9)继续运行仪器，直至提取完成；
(10)取出洗脱管，拧上盖帽，-20℃保存备用；
(11)取出其他耗材，按生物废弃品处理，关闭仪器。
其中，提取的仪器为中山大学达安基因股份有限公司研发的全自动核酸提取仪，型号为DA3000；提取的程序为：裂解8分钟，结合15分钟，洗涤液1洗涤2分钟，洗涤液2洗涤2分钟，静置5分钟，洗脱2分钟。
实施例3
本发明的快速检测血浆\血清中病毒的方法的一种实施例，包括如下步骤：
1、试剂准备：按实施例1配制实验所需溶液，包括裂解液，结合液，漂洗液1，漂洗液2，洗脱液，蛋白酶K溶液；
2、样本准备：取乙型肝炎质控品，用阴性血浆稀释至103IU/mL，稀释50mL备用；
3、病毒DNA提取:
(1)往深孔板1中加入3mL漂洗液1，放到仪器(同实施例2)相应卡槽上；
(2)往深孔板2中加入3mL漂洗液2，放到仪器相应卡槽上；
(3)往洗脱管中加入200μL洗脱液，放到仪器相应卡槽上；
(4)把磁力套板放到仪器相应卡槽上；
(5)往深孔板3中依次加入2.4mL样本，100μL蛋白酶K溶液，7μL核酸助沉剂AcrylCarrier，2.4mL裂解液；
(6)仪器运行初始化，按设定提取程序(同实施例2)进行样本裂解；
(7)裂解完成后，仪器暂停；
(8)取出深孔板3，依次加入80μL纳米磁珠，7.7mL结合液；
(9)继续运行仪器，直至提取完成。
4、样本的荧光定量PCR检测：
(1)取商业化的《乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(荧光定量PCR探针法)》，按产品说明书进行配制PCR反应体系，分装至定量PCR八连管中；
HBV Mix 19.45μL
酶混合液 0.55μL
(2)分别加入步骤3所提取的核酸样本30μL，混匀，瞬时离心；
(3)打开PCR仪，设定如下表1所示的程序参数；
表1 PCR程序
(4)荧光通道选择为FAM作为检测通道；
(5)设置完毕，保存文件，运行反应程序；
(6)运行完毕，分析结果。
表2荧光定量PCR检测HBV样品提取结果(CT值)
样品 国内某公司提取试剂盒 本发明提取试剂盒
1 27.45 26.32
2 27.48 26.78
3 28.04 26.72
平均值 27.66 26.61
标准偏差 0.33 0.25
CV值(％) 1.20 0.94
实验结果：参见图1和表2所示，图1为荧光定量PCR检测HBV样品提取结果，由表2和图1可以看出，本发明提取的病毒DNA比国内某公司的病毒提取试剂盒提取的浓度要高(CT值小)，而且重复性更好(CV值小)。
实施例4本发明的试剂盒的病毒核酸回收率
测试对象：实施例1的试剂盒；
测试方法：
1、往1.5ml离心管中加入浓度为5*10^4IU/ml的HBV-DNA标准品100ul，加入结合液500ul，磁珠20ul，轻轻涡旋混匀，短暂离心，静置5min，吸磁1分钟,弃掉上清，加入W3500ul,轻轻涡旋混匀，短暂离心，静置1min，吸磁1分钟，弃掉上清，加入W4 500ul,轻轻涡旋混匀，短暂离心，静置1min，吸磁1分钟，弃掉上清，打开离心管盖，静置10min，加入EB100ul,轻轻涡旋混匀，短暂离心，静置2min，吸磁1分钟，把洗脱液转移到新的1.5ml离心管中，-20℃保存备用。
2、样本的荧光定量PCR检测
(1)取商业化的《乙型肝炎病毒核酸测定试剂盒(荧光定量PCR探针法)》，按产品说明书进行配制PCR反应体系，分装至定量PCR八连管中；
HBV Mix 19.45μL
酶混合液 0.55μL
(2)分别加入步骤1所提取的核酸样本30μL(pH＝6.5)，混匀，瞬时离心；
(3)打开PCR仪，设定程序参数，如下表3所示；
表3 PCR程序
(4)荧光通道选择为FAM作为检测通道；
(5)设置完毕，保存文件，运行反应程序；
(6)运行完毕，分析结果。
表4荧光定量PCR检测HBV-DNA回收结果(CT值)
测试结果：参见图2和表4所示，图2为荧光定量PCR检测HBV-DNA回收结果，由表4和图2可以看出，本发明的试剂盒提取的病毒DNA扩增曲线与标准液的扩增曲线相接近，说明该试剂盒可回收大部分的核酸；本发明利用荧光定量PCR测定HBV浓度标准曲线公式Y(CT值)＝-3.045X(lg(浓度))+36.48(数据没有展出)，计算得到的HBV-DNA标准液的浓度为46182IU/ml，HBV-DNA回收液的浓度为37464IU/ml，回收率为81.12％。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.用于提取血筛混检样本中病毒核酸的试剂盒，其特征在于，包括裂解液、结合液、第一漂洗液、第二漂洗液、洗脱液、二氧化硅磁珠、蛋白酶K和核酸助沉剂，其中，所述第一漂洗液含有所述结合液和柠檬酸钠。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液含有高氯酸钠、Tris-HCl、EDTA、DTT和Triton X-100。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述结合液中含有高氯酸钠、DEPC水和无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二漂洗液中含有DEPC水和无水乙醇。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为Tris-HCl和DEPC水的溶液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶K采用DEPC水溶解。
7.一种血筛混检样本中病毒核酸的提取方法，其特征在于，采用权利要求1～6任一项的试剂盒提取病毒核酸，具体包括如下步骤：
(1)样本准备：取灭活处理后的血清或血浆若干份，每份体积相同，分别标记和编号，将若干份血清或血浆合并成1份待测样本；
(2)设置阳性对照和阴性对照样本；
(3)核酸提取阶段：
1)向深孔板1中加入第一漂洗液，放到核酸提取仪器相应卡槽上；
2)向深孔板2中加入第二漂洗液，放到核酸提取仪器相应卡槽上；
3)向洗脱管中加入洗脱液，放到核酸提取仪器相应卡槽上；
4)将磁力套板放到核酸提取仪器相应卡槽上；
5)往深孔板3中依次加入所述待检测样本、蛋白酶K溶液、核酸助沉剂和裂解液；
6)核酸提取仪器初始化，然后按设定提取程序进行样本裂解；
7)裂解完成后，核酸提取仪器暂停；
8)取出深孔板3，依次加入纳米磁珠，结合液；
9)继续运行核酸提取仪器，直至提取完成。
8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中待测样本体积为2.4mL；不足2.4mL的待测样本用经鉴定后的阴性空白血浆补足。
9.一种快速检测血浆\血清中病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：将12人份的血浆/血清样品合并为一个检测样本，采用权利要求1～6任一项的试剂盒进行提取，若提取的核酸经PCR检测相应的病毒DNA/RNA为阴性，则判定为该12个人的血浆/血清样品为阴性；若出现阳性结果，则分别采用PCR检测各人的血浆/血清样本。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述PCR为荧光定量PCR。
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