CN117821448A - 一种血清/血浆miRNA全自动化提取试剂盒及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血清/血浆miRNA全自动化提取试剂盒及其提取方法，试剂盒包括提取深孔板和封装于所述提取深孔板中的提取及纯化试剂，所述提取及纯化试剂包括裂解结合液、磁珠液、洗液1、洗液2和洗脱液，所述提取深孔板设有N排12列，每排第1~6列以及第7~12列的孔位中分别封装有裂解结合液、磁珠液、洗液1、洗液2、洗液2和洗脱液。利用本发明的试剂盒和提取方法对血清或（和）血浆miRNA进行提取时，操作人员仅需将样本注入预封装提取深孔板的对应孔位内，即可实现miRNA的完全自动化提取，后续再无需人工干预。
Description
技术领域
本发明属于miRNA提取技术领域，涉及一种血清/血浆miRNA全自动化提取试剂盒及其提取方法。
背景技术
核酸提取作为核酸检测的第一步，是极其关键的步骤，其获得的核酸质量的优劣直接影响到下游分子生物学试验的成败。由于手动核酸提取存在操作步骤复杂、效率低、核酸纯度低、难以满足高通量样品提取纯化等问题，而自动化核酸提取具有操作简单、提取速度快、精确性高、稳定性强的优势。
MicroRNA（miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。在动植物以及病毒中已经发现有28645个miRNA分子。有大量的资料显示，miRNA通过基因调控参与了各种疾病患者中蛋白的异常表达。随着miRNA对生物途径的影响越来越大，并改变了许多基因的生物学状态，miRNA的提取分离近年越来越受到研究者的关注。
目前，还没有针对血清/血浆miRNA全自动化提取的先例。现有的核酸自动化提取都是主要针对DNA开发的。针对miRNA自动化提取的仅有1例，为天根生化科技（北京）有限公司申请的《一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒》（公开号为：CN117247992A），但该技术在进行自动化提取前需要对样本首先进行裂解前处理后才能上机提取，并非完全自动化提取。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种血清/血浆miRNA全自动化提取试剂盒及其提取方法。利用本发明的试剂盒和提取方法对血清或（和）血浆miRNA进行提取时，操作人员仅需将样本注入预分装深孔板的对应孔位内，即可实现miRNA的完全自动化提取，后续再无需人工干预。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种血清/血浆miRNA全自动化提取试剂盒，包括提取深孔板和封装于所述提取深孔板中的提取及纯化试剂，所述提取及纯化试剂包括裂解结合液、磁珠液、洗液1、洗液2和洗脱液，所述提取深孔板设有N排12列，每排第1~6列以及第7~12列的孔位中分别封装有裂解结合液、磁珠液、洗液1、洗液2、洗液2和洗脱液，其中：
所述的裂解结合液包括：0.18%~0.30%（m/V）CTAB、0.36%~0.73%（m/V）柠檬酸钠无水、0.009%~0.018%（m/V）葡聚糖2万、10~20mM pH7.5的Tris-HCl、3.5~7mM pH8.0的EDTA、2.9~3.2M 盐酸胍、50%~60%（V/V）异丙醇，所述的裂解结合液pH为8.0±0.05；
所述的磁珠液包括硅羟基磁珠；
所述的洗液1包括：5~20mM pH7.5的Tris-HCl、4~10mM pH8.0的EDTA、1~2M 盐酸胍、0.4%~0.8%（m/V）柠檬酸钠无水、0.1~1M 氯化钠、60%（V/V）无水乙醇；
所述的洗液2包括：6~10mM pH7.5的Tris-HCl、70%（V/V）无水乙醇；
所述的洗脱液包括：加入酚红试剂的无核酸酶水。
优选地，所述的裂解结合液、磁珠液、洗液1、洗液2、洗液2和洗脱液的体积比为16:4:10:10:10:1。
优选地，所述的硅羟基磁珠的浓度为100mg/mL。
优选地，所述的硅羟基磁珠的平均粒径为1.4±0.5μm。
优选地，所述的硅羟基磁珠的保存液为20%~100%的异丙醇。
优选地，所述试剂盒还包括蛋白酶K和磁棒套。
优选地，N表示≥8的整数。
本发明还提供了一种血清/血浆miRNA全自动化提取方法，采用上述试剂盒，包括：在所述提取深孔板第1列和第7列中分别加入血清或/和血浆样本以及蛋白酶K，所述血清或/和血浆样本和裂解结合液的体积比为1：8，所述蛋白酶K和所述血清或/和血浆样本的体积比为1~2：10；将提取深孔板放入核酸自动提取仪中，装上磁棒套，启动提取程序进行自动化提取，提取后将第6列和第12列中的液体吸取出来，即得miRNA溶液。
本发明的有益效果在于：
本发明采用磁性粒子纯化技术，开发独有的miRNA自动化提取及纯化试剂，本发明试剂盒独有的裂解体系，结合高效的硅羟基磁珠，提高了低浓度样本的提取效率；本发明试剂盒洗脱液中加入带有颜色的酚红试剂作为标识，可以降低后续实验人员漏加样情况，杜绝人为失误操作；所有试剂预分装至深孔内，完美适配于市面上常见的核酸自动化提取设备。
本发明的试剂盒搭配合适的自动化提取系统，可以轻松实现“一步上样，全自动提取”，在23分钟内轻松完成数十个样本的miRNA的提取，达到快速、高通量、标准化提取的效果。
本发明试剂盒整合磁棒法自动核酸提取仪可进行高通量提取，另外搭配磁力分离架也可进行手动操作，兼容自动提取和手动提取。
利用本发明的试剂盒和提取方法时，样本使用量少，仅需100μL即可实现高效提取。
本发明试剂盒和提取过程不使用氯仿、苯酚等有毒试剂，可保护实验人员安全，同时利用本发明的试剂盒和提取方法可降低人为实验产生的误差，提取复孔间重复性高，复孔间CV值≤3%，提取结果稳定可靠。
附图说明
图1 为本发明与不同产品提取100μL血清样本 miRNA进行qPCR荧光曲线图（靶点1）。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合实施例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本申请中，“m/V”表示组分在溶液中的质量体积比（g/mL），“V/V ”表示组分在溶液中的体积百分比。
本发明提供的一种血清/血浆miRNA全自动化提取试剂盒，包括提取深孔板和封装于所述提取深孔板中的提取及纯化试剂，所述提取及纯化试剂包括裂解结合液、磁珠液、洗液1、洗液2和洗脱液，所述提取深孔板设有8排12列，每排第1~6列以及第7~12列的孔位中分别封装有裂解结合液、磁珠液、洗液1、洗液2、洗液2和洗脱液，裂解结合液、磁珠液、洗液1、洗液2、洗液2和洗脱液的体积比为16:4:10:10:10:1。
如表1所示，一块提取深孔板可同时提取16个样本。
表1 试剂分装情况
其中：
裂解结合液包括以下组分：0.18 %~0.30 %（m/V）CTAB、0.36 %~0.73 %（m/V）柠檬酸钠无水、0.009~0.018%（m/V）葡聚糖2万、10~20mM Tris-HCl（pH7.5）、3.5~7mM EDTA（pH8.0）、2.9~3.2M 盐酸胍、50%~60%（V/V）异丙醇。
所述的磁珠液为硅羟基磁珠颗粒，磁珠浓度100mg/mL，平均粒径为1.4±0.5μm。磁珠的保存液为20%~100%的异丙醇。使用时加入10~20μL，磁珠液中磁珠的总量为1~2mg。
所述的洗液1包括以下组分：5~20mM Tris-HCl（pH7.5）、4~10mM EDTA（pH8.0）、1~2M 盐酸胍、0.4%~0.8%（m/V）柠檬酸钠无水、0.1~1M 氯化钠、60%（V/V）无水乙醇。
所述的洗液2包括以下组分：6~10mM Tris-HCl（pH7.5）、70%（V/V）无水乙醇。
所述的洗脱液为加入酚红试剂的无核酸酶水。对于酚红试剂的浓度没有特殊限定。
该试剂盒还包括蛋白酶K和磁棒套。
本发明的试剂盒不仅可以对血清样本和血浆样本进行miRNA的手动提取，还可以实现血清和血浆中miRNA的全自动化提取。
本发明还提供了利用上述试剂盒提取血清和血浆中miRNA的方法，具体包括以下步骤：
1、将蛋白酶K和血清（或血浆）样本加入到提取深孔板的第1列或（和）第7列中，蛋白酶K和血清或/和血浆样本的体积比为1~2：10，血清或/和血浆样本和裂解结合液的体积比为1：8。
2、将提取深孔板置于提取仪的相应卡槽中，在提取仪磁棒套架的固定插槽内插入磁棒套。
3、关闭仓门，运行程序，开始提取。自动化程序如表2。
表2 自动化提取程序
4、待程序运行结束后，取出提取深孔板，将每个深孔板第6列或（和）第12列的核酸溶液转移至新的1.5mL 无核酸酶离心管中，即为洗脱的miRNA溶液。
5、对提取获得的miRNA溶液进行RT-qPCR检测，检测方法具体如下所述：
使用麦锐克反转录试剂，取2μL提取得到的miRNA进行反转录反应，使用麦锐克PCR扩增检测试剂盒对反转录得到的cDNA进行检测，反应体系程序按试剂盒说明书进行，cDNA模板加入量为2μL。反应结束后，划定阈值线，读取Ct值。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例
各实施例所用样本为经过合法途径获得的血清样本，血清样本加入量为100μL，实施例1~14中，靶点：miR-486，内参：U6；实施例15~18中，靶点1：miR-130a；靶点2：miR-486；内参：U6。
实施例1-4：不同裂解结合液成分对miRNA的提取效果
实施例1的试剂盒中包含以下溶液：
裂解结合液配方为：0.23%CTAB、0.55%柠檬酸钠无水、0.009%葡聚糖2万、11mMTris-HCl（pH7.5）、4.5mM EDTA（pH8.0）、3.2M 盐酸胍、58%异丙醇。
洗液1配方为：15mM pH7.5的Tris-HCl、5.5mM pH8.0的EDTA、1.8M 盐酸胍、0.6%柠檬酸钠无水、1M 氯化钠、60%无水乙醇。
洗液2配方为：10mM pH7.5的Tris-HCl、70%无水乙醇。
洗脱液均为加入酚红试剂的无核酸酶水。
裂解结合液、洗液1和洗液2的具体配制如下：
按照裂解结合液800μL、磁珠液200μL、洗液1 500μL、洗液2 500μL、洗液2 500μL和洗脱液50μL封装到提取深孔板中。
磁珠液均为1mg硅羟基磁珠（粒径为1.4μm）。
蛋白酶K浓度为20mg/mL，用量10μL。
实施例2~4与实施例1试剂盒组成的区别仅在于裂解结合液成分配方不同，其他溶液成分配方均相同。
实施例2的裂解结合液配方为：0.23%CTAB、0.55%柠檬酸钠无水、0.009%葡聚糖2万、11mM Tris-HCl（pH7.5）、4.5mM EDTA（pH8.0）、3.2M 盐酸胍、10%曲拉通、58%异丙醇。
实施例3的裂解结合液配方为：0.23%CTAB、0.55%柠檬酸钠无水、0.009%葡聚糖2万、11mM Tris-HCl（pH7.5）、4.5mM EDTA（pH8.0）、3.2M 盐酸胍、12.5%吐温-20、58%异丙醇。
实施例4的裂解结合液配方为：0.23%CTAB、0.55%柠檬酸钠无水、0.009%葡聚糖2万、11mM Tris-HCl（pH7.5）、4.5mM EDTA（pH8.0）、3.2M 盐酸胍、6.25%曲拉通、6.25%吐温-20、58%异丙醇。
由表4可知，实施例1的表现最优，明确该试剂盒裂解结合液成分不添加曲拉通和吐温-20。对其他成分的浓度范围进行研究，确定该试剂盒裂解结合液成分包括：0.18%~0.30%CTAB、0.36%~0.73%柠檬酸钠无水、0.009~0.018%葡聚糖2万、10~20mM pH7.5的Tris-HCl、3.5~7mM pH8.0的EDTA、2.9~3.2M 盐酸胍、50%~60%异丙醇。由于各成分的浓度研究采用单因素研究，且研究的因素较多，这里就不再对各个成分的浓度研究进行赘述。
实施例5-7：不同pH值的裂解结合液对miRNA的提取效果
实施例5-7的区别仅在于裂解结合液配制完成后，调节pH至不同数值，其他成分配方与实施例1相同。
由表5可知，实施例6的表现最优，裂解结合液在偏酸性条件下效果差于偏碱性条件。
实施例8-14：不同类型磁珠对miRNA的提取效果
实施例8-14提供了一种自动化提取血清miRNA的试剂盒，上述实施例的不同之处在于磁珠的供应商及类型，试剂盒其他成分配方与实施例1均相同。利用上述试剂盒自动化提取血清miRNA的方法具体包括上述的步骤1~6。
由表6可知，实施例8和实施例10的表现较优。利用本发明的试剂盒提取获得的miRNA，无论从靶点的Ct值，还是内参的Ct值来看，本发明的试剂体系结合硅羟基磁珠的方案较优。
实施例15-18：不同蛋白酶K用量对miRNA的提取效果
实施例15-18的区别在于蛋白酶K用量，其他成分配方与实施例1均相同。
由表7可知，实施例15、实施例16和实施例17的表现相近，其中实施例15的表现最优，10~20μL蛋白酶K能够充分消化血清中的蛋白干扰。
对比例
靶点1：miR-29C；靶点2：miR-92a；靶点3：miR-1285。
对比例1：与诺唯赞自动化提取试剂的对比
使用的是组织RNA提取试剂盒1.0 Plus(预封装)（Tissue RNA Extraction Kit1.0 Plus(Repackaged)），货号R411-C1。该试剂盒进行自动化提取前需使用Trizol对样本进行前处理。
对比例2：与凯杰柱提试剂盒的对比
使用的是miRNeasy血清血浆升级版试剂盒，货号217204。
检测结果：使用对比例1和2提取方法对样本进行处理，提取获得的miRNA进行RT-qPCR检测，检测结果如表8和图1所示。其中，Ct值越小，表示效果越好。
由表8和图1可知，本申请（实施例1）表现最优。本发明提供的试剂盒的提取效果均优于其他国内外现有产品。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (8)
1.一种血清/血浆miRNA全自动化提取试剂盒，包括提取深孔板和封装于所述提取深孔板中的提取及纯化试剂，所述提取及纯化试剂包括裂解结合液、磁珠液、洗液1、洗液2和洗脱液，所述提取深孔板设有N排12列，每排第1~6列以及第7~12列的孔位中分别封装有裂解结合液、磁珠液、洗液1、洗液2、洗液2和洗脱液，其中：
所述的裂解结合液包括：0.18%~0.30%CTAB、0.36%~0.73%柠檬酸钠无水、0.009~0.018%葡聚糖2万、10~20mM pH7.5的Tris-HCl、3.5~7mM pH8.0的EDTA、2.9~3.2M 盐酸胍、50%~60%异丙醇，所述的裂解结合液pH为8.0±0.05；
所述的磁珠液包括硅羟基磁珠；
所述的洗液1包括：5~20mM pH7.5的Tris-HCl、4~10mM pH8.0的EDTA、1~2M 盐酸胍、0.4%~0.8%柠檬酸钠无水、0.1~1M 氯化钠、60%无水乙醇；
所述的洗液2包括：6~10mM pH7.5的Tris-HCl、70%无水乙醇；
所述的洗脱液包括：加入酚红试剂的无核酸酶水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的裂解结合液、磁珠液、洗液1、洗液2、洗液2和洗脱液的体积比为16:4:10:10:10:1。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的硅羟基磁珠的浓度为100mg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的硅羟基磁珠的平均粒径为1.4±0.5μm。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的硅羟基磁珠的保存液为20%~100%的异丙醇。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括蛋白酶K和磁棒套。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，N表示≥8的整数。
8.一种血清/血浆miRNA全自动化提取方法，采用权利要求1~7任意一项所述的试剂盒，包括：在所述提取深孔板第1列和第7列中分别加入血清或/和血浆样本以及蛋白酶K，所述血清或/和血浆样本和裂解结合液的体积比为1：8，所述蛋白酶K和所述血清或/和血浆样本的体积比为1~2：10；将提取深孔板放入核酸自动提取仪中，装上磁棒套，启动提取程序进行自动化提取，提取后将第6列和第12列中的液体吸取出来，即得miRNA溶液。
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