CN117247992A - 一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒以及利用该试剂盒的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物检测的技术领域，具体公开了一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒以及利用该试剂盒的提取方法。该试剂盒包括磁珠颗粒、蛋白酶K、裂解液、复合结合液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液；所述试剂盒还包括试剂条；上述溶液根据需要预封装在试剂条中；所述磁珠颗粒为硅羟基羧基双修饰的磁珠颗粒，粒径范围为50‑150 nm。利用本申请的试剂盒对外泌体miRNA进行提取，过程中无需使用酚、氯仿等有毒试剂，而且能够实现磁珠法全自动对外泌体miRNA的提取，提取获得的外泌体miRNA纯度好，能够满足qPCR和NGS等需求。
Description
技术领域
本申请涉及生物检测的技术领域，更具体地说，涉及一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒以及利用该试剂盒的提取方法。
背景技术
外泌体(exosome)来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，为直径30-150nm的小囊泡。在人体体液样本，比如血液、唾液、尿液、脑脊液或者培养的细胞上清中，均存在外泌体。
研究发现，外泌体微小RNA(microRNA，miRNA)参与恶性肿瘤中癌细胞增殖、血管生成和肿瘤转移等不同发生和发展过程，被认为是恶性肿瘤诊断中极具潜力的非侵入性生物标志物之一，引起了越来越多的关注。
外泌体长链非编码RNA(lncRNA)是长于200个核苷酸的RNA转录物，也参与染色质修饰、基因表达和核转运等许多重要的生物过程。lncRNA可以同时与mRNA和miRNA结合，在基因表达中起沉默作用。
目前，从外泌体中分离miRNA大部分是基于Trizol原理等方法或者是基于Trizol裂解的柱法提取，提取过程中需要用到酚、氯仿等有毒试剂。另外，目前市面上基本没有利用自动化仪器进行外泌体miRNA提取的方法。
发明内容
本申请提供一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒以及利用该试剂盒的提取方法。从血浆、细胞培养液、尿液等样本中分离出外泌体后，再利用本申请的试剂盒和提取方法对外泌体miRNA进行提取，过程中使用的试剂均为安全试剂，无需使用酚、氯仿等有毒试剂，而且能够实现磁珠法全自动对外泌体miRNA的提取。
采用本申请的方法提取获得的外泌体miRNA纯度好，能够满足qPCR和NGS等需求。此外，还可以利用本申请的试剂盒实现对lncRNA的自动化提取，从而实现对外泌体miRNA和lncRNA的同时提取。
第一方面，本申请提供一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒，采用如下的技术方案：
一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒，所述试剂盒包括磁珠颗粒、蛋白酶K、裂解液、复合结合液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液；所述试剂盒还包括试剂条；上述溶液根据需要预封装在试剂条中；
所述磁珠颗粒为硅羟基羧基双修饰的磁珠颗粒，粒径范围为50-150nm。
使用本申请的试剂盒提取外泌体miRNA时，首先，将待提取样本与裂解液、蛋白酶K、核酸保护剂(例如：TIANGEN，RK247)混匀放置，通过裂解液和蛋白酶K的共同裂解，同时在核酸保护剂的协同作用下，释放出外泌体中包括miRNA在内的核酸；然后，加入复合结合液，在适当盐离子及pH值缓冲液(裂解液提供的环境)和复合结合液的条件下，释放出来的RNA结合于硅羟基羧基双重修饰的磁珠颗粒上；接着，利用去蛋白液和漂洗液进一步去除杂质；最后，通过改变盐离子浓度及pH值范围(漂洗时中等盐浓度，洗脱时高盐浓度；漂洗时略低的pH，洗脱时较高的pH)，将miRNA等RNA从磁珠颗粒上洗脱下来。
本申请中，试剂盒中涉及到的溶液可以根据需要在试剂条耗材中进行预封装。只需要对待提取样本进行简单前处理，就可以通过天根TGuide S16自动化仪器完成RNA提取，操作简单，节约人工时间。在无需使用酚、氯仿等有毒试剂的情况下，提取效率比传统Trizol方法效果更好。
本申请提出了一种可以同时用于miRNA和lncRNA的磁珠吸附材料，为硅羟基羧基双修饰的磁珠颗粒，粒径范围为50-150nm，可以有效吸附片段小的miRNA。经验试验分析可知，本申请的试剂体系结合硅羟基羧基双重修饰的磁珠颗粒的方案，获得的miRNA外参CR100和miRNA内参U6的Ct值结果，均优于本申请的试剂体系结合硅羟基磁珠或本申请的试剂体系结合羧基磁珠的方案的结果。说明待提取样本在含适当盐离子浓度和pH值缓冲液的裂解液裂解后，释放出外泌体中的RNA，之后在复合结合液的条件下，本申请中的硅羟基羧基双修饰的磁珠颗粒对RNA的吸附效果优于单独使用硅羟基修饰的磁珠(硅羟基磁珠)或单独使用羧基修饰的磁珠(羧基磁珠)的吸附效果。
可选地，所述磁珠颗粒的粒径范围为50-100nm或100-150nm。
可选地，所述磁珠颗粒的粒径范围为10nm、50nm、100nm、150nm、200nm。
可选地，所述裂解液包括以下组分：1-2M异硫氰酸胍、0.5-3M硫氰酸钠、50-100mMpH为6.0的柠檬酸钠、质量浓度为0.2-1％的脱氧胆酸钠、质量浓度为0.5-1.5％的磺酸锂、质量浓度为0.1-1％的聚氧乙烯十六烷基醚。
可选地，所述裂解液组分中，异硫氰酸胍的浓度为0.5M、1M、1.5M、2M、2.5M。
可选地，所述裂解液组分中，异硫氰酸胍的浓度为1-1.5M或1.5-2M。
上述裂解液含有合适浓度的胍盐和表面活性剂，结合蛋白酶K可以更充分的裂解出核酸RNA。
可选地，所述复合结合液包括以下组分：质量浓度为20-30％的PEG 4000、1-2M氯化钠、质量浓度为50-70％的异丙醇。
上述复合结合液包含PEG 4000、氯化钠、异丙醇，可以更有效地结合miRNA和lncRNA。
可选地，所述去蛋白液包括以下组分：1-3M异硫氰酸胍、50-100mM pH为8.5的Tris-Cl、10-50mM EDTA、30-75％无水乙醇。
可选地，所述去蛋白液组分中，无水乙醇的浓度为25％、30％、40％、60％、70％、75％。
可选地，所述去蛋白液组分中，无水乙醇的浓度为30-40％、30-60％、30-70％、40-60％、40-70％、40-75％、60-70％、60-75％、70-75％。
可选地，所述漂洗液包括以下组分：100-300mM LiCl、70-85％无水乙醇。
可选地，所述洗脱液为无核酸酶水。
可选地，所述外泌体的来源为血浆、细胞培养液、尿液、唾液或脑脊液。
可选地，所述试剂盒的提取样本为外泌体、血浆或干血斑。
本申请的试剂盒也可应用于干血斑样本和血浆中miRNA的提取，干血斑样本前处理经过消化后经过进一步的裂解，提取得到miRNA，同时表明在去蛋白液中随着乙醇比例的增加，在去蛋白的同时对于miRNA的吸附效果更好。
可选地，所述核酸保护剂选自有机还原剂。
核酸保护剂的添加可防止生物样本中的核酸降解，抑制核酸酶，并保证得到更完整的miRNA和lncRNA。
可选地，所述核酸保护剂包括选自巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦盐酸盐中的至少一种。
经过大量试验发现，采用上述试剂对核酸的保护效果较好。
可选地，所述核酸保护剂的终浓度为5-100mM。
经过大量试验发现，上述较优添加量对核酸的保护效果较佳。
需要说明的是，“核酸保护剂的终浓度”是指核酸保护剂加入生物样本后，在生物样本中的终浓度。
第二方面，本申请提供一种利用上述试剂盒提取外泌体miRNA的方法，采用如下技术方案：
将待提取样本与裂解液、蛋白酶K以及核酸保护剂室温下混匀，释放出RNA；利用硅羟基羧基双重修饰的磁珠颗粒结合释放出的RNA；再利用去蛋白液和漂洗液去除杂质；后将miRNA从磁珠颗粒上洗脱下来。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请的试剂盒中涉及到的溶液可以根据需要在试剂条耗材中进行预封装。只需要对待提取样本进行简单前处理，就可以通过天根TGuide S16自动化仪器完成提取，操作简单，节约人工时间。
2.本申请中使用了粒径范围为50-150nm的小粒径磁珠，吸附miRNA小片段的效率更高，同时也可以吸附较大的lncRNA。同时在裂解液、蛋白酶K和核酸保护剂的共同作用下，能够有效裂解释放RNA，并抑制核酸酶的作用。
3.利用本申请的试剂盒对miRNA和lncRNA的提取，在无需使用酚、氯仿等有毒试剂的情况下，提取效率比传统Trizol方法效果更好。
4.利用本申请的试剂盒对miRNA和lncRNA的提取，获得的外泌体RNA纯度好，能够满足qPCR和NGS等需求。
具体实施方式
下面详细描述本申请的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本申请的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本申请提供的一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒。该试剂盒包括包括磁珠颗粒、蛋白酶K、裂解液、复合结合液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液；所述试剂盒还包括试剂条；上述溶液根据需要预封装在试剂条中；所述磁珠颗粒为硅羟基羧基双修饰的磁珠颗粒，粒径范围为50-150nm。
其中，裂解液包括以下组分：1-2M异硫氰酸胍、0.5-3M硫氰酸钠、50-100mM pH为6.0的柠檬酸钠、质量浓度为0.2-1％的脱氧胆酸钠、质量浓度为0.5-1.5％的磺酸锂、质量浓度为0.1-1％的聚氧乙烯十六烷基醚。
其中，所述复合结合液包括以下组分：质量浓度为20-30％的PEG 4000、1-2M氯化钠、质量浓度为50-70％的异丙醇。
本申请的试剂盒不仅可以对提取好的外泌体进行miRNA和lncRNA的提取，还可以实现对干血斑和血浆中miRNA的提取。
本申请还提供了利用上述试剂盒提取外泌体miRNA的方法，具体包括以下步骤：
1.样本预处理
将100μl分离好的外泌体样本，加入200μl裂解液、20μl蛋白酶K、30μl核酸保护剂(TIANGEN，RK247,来源于TIANMicrobe磁珠法病原微生物DNA/RNA提取试剂盒(NG550)中)，室温混匀充分后放置5-10min，获得样本处理液。
2.试剂预封装
将磁珠颗粒、复合结合液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液(RNase-Free H2O)，按照表1所示分装到单条试剂槽的相应的孔中。
表1分装情况
3.将步骤1获得的样本处理液加入到试剂槽的第1孔中。
4.运行自动化程序。自动化程序的详细过程如表2所示。
表2自动化程序
5.提取结束后，从第5孔中吸出提取好的外泌体RNA，含miRNA和lncRNA，并于-80℃保存。
对提取获得的外泌体RNA进行检测，检测方法具体如下所述。
(1)外泌体中miRNA qPCR检测流程如下：
使用TIANGEN KR211，取4μl提取得到的外泌体RNA进行加A尾法逆转录，按试剂盒说明书进行操作。使用TIANGEN FP411对逆转录后得到的cDNA进行检测，反应体系程序按试剂盒说明书进行操作，cDNA模板加入量为2μl。
(2)外泌体中lncRNA qPCR检测流程如下：
使用TIANGEN FP314，取4μl提取得到的外泌体RNA进行一步法反转定量。
下面将结合实施例对本申请的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本申请，而不应视为限定本申请的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下结合实施例、对比例以及检测结果对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例1-6：不同类型磁珠颗粒对外泌体miRNA的吸附结合效果
实施例1-6提供了一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒。上述实施例的不同之处在于磁珠颗粒类型。
利用上述试剂盒提取外泌体miRNA的方法，具体包括以下步骤：
1.样本预处理
将100μl分离好的外泌体样本，添加1μl的1μM的miRNA检测外参(TIANGEN CR100)，加入200μl裂解液(1.5M异硫氰酸胍、1M硫氰酸钠、50mM柠檬酸钠(pH＝6.0)、0.5％(M/V)脱氧胆酸钠、0.75％(M/V)磺酸锂、0.2％(M/V)聚氧乙烯十六烷基醚)、20μl蛋白酶K、30μl核酸保护剂(TIANGEN，RK247)，室温混匀充分后放置5-10min，获得样本处理液。
2.试剂预封装
将磁珠颗粒、复合结合液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液等，按照表1所示分装到单条试剂槽的相应的孔中。
3.将步骤1获得的样本处理液加入到试剂槽的第1孔中。
4.运行自动化程序。自动化程序的详细过程如表2所示。
5.提取结束后，从第5孔中吸出提取好的外泌体RNA，含miRNA，并于-80℃保存。
表3实施例1-6以及对比例1-2提取获得的外泌体RNA的吸附效果对比——样本A
对比例
对比例1
本对比例提供了一种从外泌体中分离miRNA的方法。
使用的是miRNA和总RNA纯化试剂盒miRNeasy Mini Kit50T，型号为QIAGEN217004。其中用到了QIAzol含酚试剂。
对比例2
本对比例提供了一种从外泌体中分离miRNA的方法。
使用的是Tiangen dp501 miRcute miRNA提取分离试剂盒，型号为TIANGENDP501。其中用到了天根柱法含酚试剂。
检测结果一
对实施例1-6和对比例1-2分别对样本A进行处理，提取获得的外泌体RNA进行miRNA qPCR检测，检测结果如表3所示。其中，Ct值越大，表示效果越差。
由表3可知，利用本申请的试剂盒提取获得的外泌体RNA中，无论从miRNA外参CR100的Ct值，还是miRNA内参U6的Ct值来看，本申请的试剂体系结合硅羟基羧基双重修饰的磁珠颗粒的方案均优于其他方案。50-150nm的小粒径磁珠颗粒相比1μm硅羟基磁珠颗粒，对于20-100nt的小片段RNA的结合能力更强。结合样本中的杂质较少，对于下游qPCR定量检测无抑制现象。此外，本申请的试剂盒不使用有毒试剂酚、氯仿等，且能够达到很好的裂解效果。
实施例7-14：不同裂解液对外泌体miRNA的吸附结合效果
实施例7-14分别提供了一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒。
利用上述试剂盒提取外泌体miRNA的方法与实施例1的不同之处在于：样本预处理中所用的裂解液配方不同。具体如表4所示。
表4实施例1、7-14提取获得的外泌体RNA的吸附效果对比——样本B
检测结果二
对实施例7-14分别对样本B进行处理，提取获得的外泌体RNA进行miRNA qPCR检测，检测结果如表4所示。
由表4可知，实施例11的3种miRNA的结果均表现较好，结合两种离液盐异硫氰酸胍和硫氰酸钠、酸性的柠檬酸钠缓冲液、3种不同类型的表面活性剂的裂解液，更能充分裂解外泌体中的miRNA，对于外参CR100的回收率也更高。
实施例15-17：不同复合结合液对外泌体miRNA和lncRNA的吸附结合效果
实施例15-17分别提供了一种用于自动化提取外泌体miRNA和lncRNA的试剂盒。
利用上述试剂盒提取外泌体miRNA和lncRNA的方法与实施例1的不同之处在于：复合结合液配方不同。具体如表5所示。
上述实施例中涉及到的裂解液配方如下：2M异硫氰酸胍、0.5M硫氰酸钠、100mM柠檬酸钠(pH＝6.0)、1％(M/V)脱氧胆酸钠，1.5％(M/V)磺酸锂，0.5％(M/V)聚氧乙烯十六烷基醚。
表5实施例15-17提取获得的外泌体RNA的吸附效果对比——样本C
检测结果三
对实施例9-11分别对样本C进行处理，提取获得的外泌体RNA进行miRNA qPCR检测和lncRNA qPCR检测，检测结果如表5所示。
由表5可知，无论从miRNA还是lncRNA的qPCR结果来看，本申请中的复合结合液在结合miRNA和lncRNA的效果上均优于单一组分异丙醇结合液，并整体上优于竞品Q TRizol含酚试剂的效果。
实施例18-23：干血斑中miRNA的提取方案
为了拓展本申请的样本适用性，利用本申请的试剂盒从干血斑中进行了miRNA的提取实验。
实施例18-23分别提供了一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒。
利用上述试剂盒从干血斑中提取外泌体miRNA的方法与实施例1的不同之处在于：去蛋白液配方不同。具体如表6所示。
利用上述试剂盒提取外泌体miRNA的方法，与实施例1的不同之处在于：
样本预处理中，将1片6mm直径的干血斑，利用天根DP344试剂盒进行预处理，加入250μl缓冲液GAS(TIANGEN RK203)，20μl蛋白酶K和30μl核酸保护剂(TIANGEN，RK247)，75℃消化15min。然后加入200μl裂解液(1M异硫氰酸胍、1.5M硫氰酸钠、75mM柠檬酸钠(pH＝6.0)、0.5％(M/V)脱氧胆酸钠，1％(M/V)磺酸锂，0.5％(M/V)聚氧乙烯十六烷基醚)，室温混匀充分后放置5-10min，获得样本处理液。
表6实施例18-23提取获得的外泌体RNA的吸附效果对比——样本D
检测结果四
对实施例18-23分别对样本D干血斑进行处理，提取获得的外泌体RNA进行miRNAqPCR检测，检测结果如表6所示。
由表6可知，在磁珠颗粒结合miRNA后，更高浓度的无水乙醇在去除蛋白杂质的同时，可以更牢度地吸附已结合的miRNA，随着无水乙醇浓度的增加，miRNA的结合效率逐渐提高，以70％的无水乙醇比例效果呈现最佳。同时，也说明该自动化方案除了适合提取分离纯化好的外泌体中的RNA，也可以适用于干血斑中的miRNA提取。
实施例24-26：不同类型磁珠颗粒对miRNA的吸附结合效果——血浆样本
实施例24-26分别提供了一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒。
利用上述试剂盒提取外泌体miRNA的方法，分别与实施例1-3的不同之处在于：样本为血浆样本，而非外泌体样本。具体如表7所示。
表7实施例24-26提取获得的外泌体RNA的吸附效果对比
检测结果五
对实施例24-26分别提取获得的外泌体RNA进行miRNA qPCR检测，检测结果如表7所示。
由表7可知，利用本申请的试剂盒提取获得的外泌体RNA中，无论从miRNA外参CR100的回收率上，还是miRNA内参U6 miRNA的Ct值结果来看，本申请的试剂体系结合硅羟基羧基双重修饰的磁珠颗粒的方案均优于其他方案。100nm的小粒径磁珠颗粒相比1μm硅羟基磁珠颗粒，对于20-100nt的小片段RNA的结合能力更强。本申请不使用有毒试剂酚、氯仿等，也可以从血浆中成功提取miRNA。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本申请的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本申请的限制，本领域的普通技术人员在本申请的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种用于自动化提取外泌体miRNA的试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒包括磁珠颗粒、蛋白酶K、裂解液、复合结合液、去蛋白液、漂洗液、洗脱液；所述试剂盒还包括试剂条；上述溶液根据需要预封装在试剂条中；
所述磁珠颗粒为硅羟基羧基双修饰的磁珠颗粒，粒径范围为50-150 nm。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括以下组分：1-2 M异硫氰酸胍、0.5-3 M硫氰酸钠、50-100 mM pH为6.0的柠檬酸钠、质量浓度为0.2-1%的脱氧胆酸钠、质量浓度为0.5-1.5%的磺酸锂、质量浓度为0.1-1%的聚氧乙烯十六烷基醚。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述复合结合液包括以下组分：质量浓度为20-30%的PEG 4000、1-2 M氯化钠、质量浓度为50-70%的异丙醇。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述去蛋白液包括以下组分：1-3 M异硫氰酸胍、50-100 mM pH为8.5的Tris-Cl、10-50 mM EDTA、30-75%无水乙醇。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述漂洗液包括以下组分：100-300 mMLiCl、70-85%无水乙醇。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为无核酸酶水。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述外泌体的来源为血浆、细胞培养液、尿液、唾液或脑脊液。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的提取样本为外泌体、血浆或干血斑。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂条的试剂槽中依次预封装所述复合结合液、所述蛋白液、所述蛋白液、所述漂洗液、所述洗脱液以及所述漂洗液和所述磁珠颗粒。
10.一种利用权利要求1-9中任一项所述的试剂盒提取外泌体miRNA的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
将待提取样本与裂解液、蛋白酶K以及核酸保护剂室温下混匀，释放出RNA；利用硅羟基羧基双重修饰的磁珠颗粒结合释放出的RNA；再利用去蛋白液和漂洗液去除杂质；后将miRNA从磁珠颗粒上洗脱下来；
可选地，所述核酸保护剂包括选自巯基乙醇、二硫苏糖醇或三（2-羧乙基）膦盐酸盐中的至少一种；
可选地，所述核酸保护剂的终浓度为5-100mM。
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