CN115851702A

CN115851702A - 一种适用于三代测序的高分子量基因组dna提取试剂盒

Info

Publication number: CN115851702A
Application number: CN202211543403.1A
Authority: CN
Inventors: 邹爱兰; 高玉洁; 刘玉方; 李晓晨; 孙克非
Original assignee: Tiangen Biotech Beijing Co Ltd
Current assignee: Tiangen Biotech Beijing Co Ltd
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种一种适用于三代测序的高分子量基因组DNA提取试剂盒。本发明提供一种DNA提取试剂盒，其中含有DEAE弱阴离子交换树脂、多糖助沉剂、多酚吸附片，利用该试剂盒可以对多糖多酚的生物样本进行基因组DNA的提取，获得的基因组DNA色素残留少，纯度高，符合三代测序对基因组DNA的要求。本发明还提供了一种通用性强的三代测序基因组DNA提取方法，利用上述试剂盒可以提取多糖多酚植物和大型真菌等样本，通用性强。该方法提取到的基因组DNA完整性大于30kb，得率高，OD260/280和OD260/230纯度好，能够满足三代测序基因组DNA的需求。

Description

一种适用于三代测序的高分子量基因组DNA提取试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种适用于三代测序的高分子量基因组DNA提取试剂盒。

背景技术

随着测序技术的发展，第三代测序即单分子测序技术，近几年发展迅速。其特点是可以基于基因组层面的de novo组装和重测序，可以实现对每一条DNA分子的单独测序。不依赖于PCR扩增的三代测序技术对基因组DNA的总量、纯度等要求很高，是测序成功的关键所在。

比较经典的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)方法需要搭配酚氯仿等有毒试剂进行杂质的去除，而硅胶吸附膜方法由于离心力的剪切作用，会损伤基因组的完整性。而分离细胞核的方法会去除掉大部分杂质，但是过程复杂，操作时间长。

尤其是针对一些多糖多酚的植物样本，次生代谢产物多，会干扰基因组DNA的分离并影响纯度。因此，开发出一款通用性强的三代测序基因组DNA提取试剂盒是非常迫切的需求。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种DNA提取试剂盒，其中含有DEAE弱阴离子交换树脂、多糖助沉剂、多酚吸附片，利用该试剂盒可以对多糖多酚的生物样本进行基因组DNA的提取，获得的基因组DNA色素残留少，纯度高，符合三代测序对基因组DNA的要求。

为此，本发明第一方面提供一种试剂盒。根据本发明的一些实施方案，所述试剂盒包括DEAE(二乙基氨基乙基)弱阴离子交换树脂、多糖助沉剂、多酚吸附片，

其中，所述多糖助沉剂包括醋酸盐和氯化铝或硫酸铝铵。

多糖多酚的生物样本，次生代谢产物多，会干扰基因组DNA的提取且影响纯度，使得采用现有的试剂盒不容易获取符合三代测序要求的多糖多酚的生物样本基因组DNA。为此，发明人发现利用上述含有DEAE弱阴离子交换树脂、多糖助沉剂、多酚吸附片的试剂盒，对多糖多酚的生物样本进行基因组DNA的提取，获得的基因组DNA色素残留少，纯度高，符合三代测序对基因组DNA的要求。该试剂盒通用性强，可针对尤其是植物样本中多糖、多酚等次生代谢产物，分别添加了多糖助沉剂以及多酚吸附片，高效去除杂质，并

有效释放出基因组DNA，提高基因组DNA的纯度。本发明提供的特殊组成的多糖助沉剂，5沉淀多糖效果较好，且可以和裂解液中的SDS形成不溶解的沉淀物，同时将裂解释放出的多糖物质一起沉淀下来，充分释放基因组DNA。

根据本发明的一些实施方案，所述醋酸盐浓度为1-3M，所述氯化铝或硫酸铝铵的浓度为50-100mM。

根据本发明的一些实施方案，所述醋酸盐包括选自醋酸钠、醋酸铵、醋酸钾中的至少0之一。

根据本发明的一些实施方案，所述DEAE弱阴离子交换树脂为二乙基氨基乙基弱阴离子修饰的多孔硅胶粉。本发明采用DEAE弱阴离子交换树脂，提升了DNA吸附效率。采用上述试剂盒，可有效的提取高分子量的基因组DNA，并满足三代测序的需求。

根据本发明的一些实施方案，所述多孔硅胶粉的粒径为70-100μm。

5根据本发明的一些实施方案，每克硅胶粉偶联DEAE基团2-3μmol。

根据本发明的一些实施方案，所述多酚吸附片为由纤维素、硅胶、交联聚乙烯吡咯烷酮压制而成的片剂。

根据本发明的一些实施方案，所述多酚吸附片为由10-20％纤维素、20-30％硅胶、50-70％的交联聚乙烯吡咯烷酮压制而成的片剂。

0根据本发明的一些实施方案，所述试剂盒进一步包括裂解液、平衡液、漂洗液、洗脱液。

根据本发明的一些实施方案，所述裂解液中含有核酸保护剂，可防止生物样本中的核酸降解，抑制核酸酶，并保证得到更完整的基因组DNA。

根据本发明的一些实施方案，所述裂解液包括：1-3％ M/V SDS、50-100mM Tris-Cl、5 10-50mM EDTA、300-700mM NaCl、0.5-3.0％ M/V PEG8000、5-100mM DTT。

DTT作为核酸保护剂保护效果较好。DTT浓度为5-100mM是发明人探索出的较优浓度，对核酸的保护效果较佳。

根据本发明的一些实施方案，所述平衡液包括：300-700mM NaCl、50-100mM MOPS、

10-15％v/v异丙醇或者无水乙醇、0.05-0.15％v/v TritonX-100。

0根据本发明的一些实施方案，所述漂洗液包括：700-1200mM NaCl、50-100mMNaAc、

10-15％v/v异丙醇或者无水乙醇。

根据本发明的一些实施方案，所述洗脱液包括：1200-1700mM NaCl、50-100mMMOPS、10-15％v/v异丙醇或者无水乙醇。

本发明第二方面提供第一方面所述的试剂盒在提取DNA中的用途。

根据本发明的一些实施方案，所述DNA源自多糖多酚生物样本。

根据本发明的一些实施方案，所述多糖多酚生物样包括多糖多酚植物样本或多糖多酚真菌类样本。

本发明第三方面提供一种提取多糖多酚生物样本中基因组DNA的方法。根据本发明的一些实施方案，所述方法包括利用第一方面所述的试剂盒对多糖多酚生物样本进行基因组DNA的提取。

本发明提供了一种通用性强的三代测序基因组DNA提取方法，利用第一方面的试剂盒可以提取多糖多酚植物和大型真菌等样本，通用性强。该方法提取到的基因组DNA完整性大于30kb，得率高，OD260/280和OD260/230纯度好，能够满足三代测序基因组DNA的需求。

本发明第四方面提供一种提取多糖多酚生物样本中基因组DNA的方法。根据本发明的一些实施方案，所述方法包括

1)对所述多糖多酚生物样本进行粉碎处理，获得粉碎物；

2)采用裂解液和蛋白酶K的共同裂解所述粉碎物，并利用多糖助沉剂和多酚吸附片去除杂质，离心获得含有DNA的上清液，并将所述上清液经过过滤柱，去除漂浮的样本碎片，获得过滤液；

3)将平衡液加入到DEAE弱阴离子交换树脂的gDNA吸附柱上，重力滴下平衡液；

4)将所述过滤液转移至平衡后的DEAE弱阴离子交换树脂的吸附柱上，通过重力流的方式杂质滴下弃掉，DNA吸附到DEAE弱阴离子交换树脂上；

5)将漂洗液加入吸附DNA后的DEAE弱阴离子交换树脂的吸附柱中，弃滤液；

6)利用洗脱液对漂洗后的吸附柱进行洗脱，并对洗脱后的基因组DNA进行异丙醇沉淀和进一步漂洗，以便获得基因组DNA。

根据本发明的一些实施方案，所述多糖助沉剂包括醋酸盐和氯化铝或硫酸铝铵。

根据本发明的一些实施方案，所述醋酸盐包括选自醋酸钠、醋酸铵、醋酸钾中的至少之一。

根据本发明的一些实施方案，所述DEAE弱阴离子交换树脂为二乙基氨基乙基弱阴离子修饰的多孔硅胶粉。

根据本发明的一些实施方案，每克硅胶粉偶联DEAE基团2-3μmol。

根据本发明的一些实施方案，所述裂解液包括：1-3％ M/V SDS、50-100mM Tris-Cl、10-50mM EDTA、300-700mM NaCl、0.5-3.0％ M/V PEG8000、5-100mM DTT。

根据本发明的一些实施方案，所述平衡液包括：300-700mM NaCl、50-100mM MOPS、10-15％v/v异丙醇或者无水乙醇、0.05-0.15％v/v TritonX-100。

根据本发明的一些实施方案，所述漂洗液包括：700-1200mM NaCl、50-100mMNaAc、10-15％v/v异丙醇或者无水乙醇。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了实施例2中未加多酚吸附片和加多酚吸附片，提取草莓叶片基因组DNA时获得的裂解液溶液，其中，左侧管为未加多酚吸附片的裂解液溶液，右侧管为加多酚吸附片的裂解液溶液；

图2显示了实施例3中不同裂解液组成，提取的梨叶片基因组DNA的电泳结果，其中1-1和1-2泳道是裂解液未加PEG8000和核酸保护剂的组，2-1和2-2泳道是采用本发明试剂的组；

图3显示了实施例4中采用本发明方法分别提取月季叶、松针、山楂叶、梨叶、樱桃叶、土豆叶样本(由左至右依次排列)的基因组DNA，获得的DNA电泳图；

图4显示了实施例5中采用本发明方法提取樟芝基因组DNA，获得的DNA电泳图；

图5显示了实施例6中分别采用本发明和厂家M的提取基因组DNA方法，提取得到的山楂叶片基因组DNA电泳图。

图6显示了实施例7中分别采用本发明和厂家T的填料提取基因组DNA方法，提取得到的菊花叶片基因组DNA电泳图，其中1-1和1-2泳道是本发明1g填料的提取结果，2-1和2-2泳道是是本发明0.5g填料的提取结果，3-1和3-2泳道是是厂家T填料的提取结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。

根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种提取多糖多酚生物样本中基因组DNA的方法，包括：

1)对所述多糖多酚生物样本进行粉碎处理，获得粉碎物；

2)采用裂解液和蛋白酶K的共同裂解所述粉碎物，并利用多糖助沉剂和多酚吸附片去除杂质，离心获得含有DNA的上清液，进一步经过HMW过滤柱离心去除漂浮的样本碎片；

3)将平衡液加入到DEAE弱阴离子交换树脂的gDNA吸附柱上，重力滴下所有液体；

4)将步骤2)中的DNA上清液加入到平衡后的DEAE弱阴离子交换树脂上，通过重力流的方式杂质滴下弃掉，DNA吸附到DEAE弱阴离子交换树脂上；

5)将漂洗液加入所述吸附DNA后的DEAE弱阴离子交换树脂的吸附柱中，弃滤液；

6)利用洗脱液对漂洗后的吸附柱进行洗脱；

7)洗脱下来的基因组DNA经过异丙醇沉淀，70％乙醇漂洗、晾干后获得纯净的基因组DNA。

根据本发明一个具体的实施方案，所述多糖多酚生物样包括多糖多酚植物样本或多糖多酚真菌类样本。

根据本发明一个具体的实施方案，所述多糖助沉剂包括醋酸盐和氯化铝或硫酸铝铵；所述醋酸盐浓度为1-3M，所述氯化铝或硫酸铝铵的浓度为50-100mM；所述醋酸盐包括选自醋酸钠、醋酸铵、醋酸钾中的至少之一。

根据本发明一个具体的实施方案，所述多酚吸附片为由纤维素、硅胶、交联聚乙烯吡咯烷酮压制而成的片剂。

根据本发明一个具体的实施方案，所述多酚吸附片为由10-20％纤维素、20-30％硅胶、50-70％的交联聚乙烯吡咯烷酮压制而成的片剂。

根据本发明一个具体的实施方案，所述DEAE弱阴离子交换树脂为二乙基氨基乙基弱阴离子修饰的多孔硅胶粉；所述多孔硅胶粉的粒径为70-100μm；每克硅胶粉偶联DEAE基团2-3μmol。

根据本发明一个具体的实施方案，裂解液中可以含有核酸保护剂，所述核酸保护剂包括选自巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦盐酸盐中的至少之一。发明人经过大量实验发现，采用上述试剂对核酸的保护效果较好，且核酸保护剂优选为二硫苏糖醇DTT。所述核酸保护剂的终浓度为5-100mM。发明人经过大量实验得到上述较优添加量，由此，对核酸的保护效果较佳。需要说明的是，“核酸保护剂的终浓度”是指核酸保护剂加入生物样本后，在生物样本中的终浓度。

根据本发明一个具体的实施方案，所述裂解液包括：1-3％ M/V SDS、50-100mMTris-Cl、10-50mM EDTA、300-700mM NaCl、0.5-3.0％ M/V PEG8000、5-100mM DTT。

根据本发明一个具体的实施方案，所述平衡液包括：300-700mM NaCl、50-100mMMOPS、10-15％v/v异丙醇或者无水乙醇、0.05-0.15％v/v TritonX-100。

根据本发明一个具体的实施方案，所述漂洗液包括：700-1200mM NaCl、50-100mMNaAc、10-15％v/v异丙醇或者无水乙醇。

根据本发明一个具体的实施方案，所述洗脱液包括：1200-1700mM NaCl、50-100mMMOPS、10-15％v/v异丙醇或者无水乙醇。

根据本发明一个具体的实施方案，本发明提供一种提取多糖多酚生物样本中基因组DNA的方法：

1)采用裂解液和蛋白酶K的共同裂解，结合多糖助沉剂和多酚吸附片去除杂质；2)在适当盐离子及pH值缓冲液结合液的条件下，利用重力流条件，释放出来的基因组DNA结合于DEAE弱阴离子交换树脂的吸附柱上，其余废液流出；3)在吸附柱上加入漂洗液进一步去除杂质；4)改变盐离子浓度及pH值范围，将基因组DNA从离子交换填料上将洗脱下来；5)在流出液中加入0.7倍体积的异丙醇，离心后得到DNA沉淀，经过70％乙醇漂洗，晾干后溶解于TB缓冲液中。该方法提取到的基因组DNA完整性高，纯度好，能够满足三代测序基因组DNA的需求。

根据本发明一个具体的实施方案，所述多酚吸附片是指包含纤维素、硅胶、交联聚乙烯吡咯烷酮等复合物压制成的片剂。交联聚乙烯吡咯烷酮是不溶于水的交联聚合物，在水溶液中崩解后形成三维结构，与多酚、蛋白质等物质均具有较强的络合能力。对于植物、动物组织中的多酚、蛋白等杂质具有吸附作用，随离心后被有效去除，保证上柱结合前的基因组DNA含杂质过少，避免得到的DNA洗脱液含有色素、酚类干扰，不影响下游实验。

根据本发明一个具体的实施方案，HMW过滤柱为上下两层为80μm孔径的疏水筛板，中间为4层无纺过滤布，可以进一步过滤未离心去除的植物样本的碎片杂质。

根据本发明一个具体的实施方案，DEAE弱阴离子交换树脂的吸附柱为DEAE(二乙基氨基乙基)修饰的离子交换硅胶粉，填充到合适的耗材中制作成DNA吸附柱，通过重力流的方式结合和洗脱基因组DNA。没有剪切力，可以最大程度保留基因组DNA的完整性。

根据本发明的一个具体的实施例，所述吸附柱为装有1-2g离子交换填料的60ml柱体积的预装柱。

发明人经过大量实验发现，上述DNA预装柱在适当盐离子浓度及pH值缓冲液结合液的条件下，利用重力流条件，释放出来的基因组DNA结合于DEAE弱阴离子交换树脂的吸附柱上。提高盐离子浓度，可以将结合在柱子上的蛋白等杂质漂洗掉，然后继续改变盐离子浓度及pH值范围，基因组DNA从预装柱上洗脱下来。整个操作流程具有方便、快速等优点。

根据本发明一个具体的实施方案，上述方法中裂解液包含：

1-3％(M/V)SDS；

50-100mM Tris-Cl(pH8.5)；

10-50mM EDTA；

300-700mM NaCl；

0.5-3.0％(M/V)PEG8000；

5-100mM DTT。

根据本发明一个具体的实施方案，上述方法中多糖助沉剂包含：

1-3M NaAc(pH 5.5)；

50-100mM AlCl₃。

根据本发明一个具体的实施方案，上述方法中平衡液包含：

300-700mM NaCl；

50-100mM MOPS,pH 7.0；

10-15％(v/v)异丙醇或者无水乙醇；

0.05-0.15％(v/v)TritonX-100。

根据本发明一个具体的实施方案，上述方法中漂洗液包含：

700-1200mM NaCl；

50-100mM NaAc(pH 5.0)；

10-15％(v/v)异丙醇或者无水乙醇。

根据本发明一个具体的实施方案，上述方法中洗脱液包含：

1200-1700mM NaCl；

50-100mM MOPS(pH 8.5)；

10-15％(v/v)异丙醇或者无水乙醇。

下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本公开，而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：基因组DNA提取方法

S1、样本前处理：

取0.5g-2g植物组织加入液氮充分研磨，转移到50ml收集管中。

注意：1)尽量选用幼嫩的叶片组织进行提取；

2)针对多糖多酚含量高的样本，可以适量减少样本上样量；

3)大型真菌类样本可参照植物样本的前处理方法。

S2、基因组DNA吸附和纯化：

(1)向上述处理好的样本中，加入8ml缓冲液(裂解液)HMW1，100μl核酸保护剂ST，200μl Proteinase K和一个多酚吸附片NKY tablets，迅速振荡混匀后，将离心管放在50℃水浴30min，水浴过程中颠倒离心管数次以混合样品；

(2)加入200μl RNase A (10mg/ml)，充分混匀，室温静置5min；

(3)加入2ml多糖助沉剂HMW2，充分混匀后，将离心管置于冰上静置5min；

(4)4℃下6,000rpm离心10min，转移上清至含HMW过滤柱(HMW Filter，TIANGENRK136)的离心管中；

(5)4℃下2,000rpm离心30s，弃HMW过滤柱(HMW Filter)，向滤液中加入滤液体积两倍的平衡结合液HMW3(大约为11-13ml的体积)，颠倒混匀30s；

(6)将步骤(5)的混合液小心倒入平衡后的HMW gDNA吸附柱(HMW gDNA Tip)中，至所有溶液流过吸附柱，弃流出液；

(7)取10ml漂洗液HMW4加入至HMW gDNA吸附柱(HMW gDNA Tip)中，至所有溶液流过吸附柱，弃流出液；

(8)取一个干净的50ml离心管用于收集洗脱液，向HMW gDNA吸附柱(HMW gDNATip)中加入7.5ml洗脱液HMW5至所有溶液流过吸附柱；

(9)弃HMW gDNA吸附柱(HMW gDNA Tip)，向步骤8的溶液中加入5ml的异丙醇，充分混匀；于4℃下8,000rpm离心10min，小心倒掉上清；

(10)向含有沉淀的离心管中加入2ml 70％的乙醇漂洗沉淀，并于4℃下8,000rpm离心5min，小心弃掉一半上清；

(11)用剪过的蓝枪头转移剩余上清及沉淀，至1.5ml的离心管中，并于4℃下8,000rpm离心5min；

(12)用枪头弃去管底残留液体，室温干燥5-10min；

(13)加入100-300μl的洗脱缓冲液TB溶解基因组DNA，50℃加热10min，以充分溶解DNA并于适当条件保存。

缓冲液HMW1包含：2％(M/V)SDS，75mM Tris-Cl(pH8.5)，20mM EDTA，300mM NaCl，2％(M/V)PEG8000，50mM DTT

多酚吸附片NKY tablets为10％纤维素、20％硅胶、70％的交联聚乙烯吡咯烷酮等复合物压制成的片剂；

多糖助沉剂HMW2包含：2M NaAc(pH 5.5)，50mM AlCl₃；

平衡结合液HMW3包含：700mM NaCl，100mM MOPS,pH 7.0，15％(v/v)异丙醇或者无水乙醇，0.05％(v/v)TritonX-100；

漂洗液HMW4包含：1100mM NaCl，75mM NaAc(pH 5.0)，12％(v/v)异丙醇或者无水乙醇；

洗脱液HMW5包含：1700mM NaCl，100mM MOPS(pH 8.5)，15％(v/v)异丙醇或者无水乙醇。

实施例2：多酚吸附片在草莓叶片提取中的效果

按照实施例1步骤提取500mg草莓叶片，一组是未加多酚吸附片，一组是加多酚吸附片，所用的多酚吸附片NKY tablets为15％纤维素、20％硅胶、65％的交联聚乙烯吡咯烷酮等复合物压制成的片剂。图1中左侧管为未加多酚吸附片的裂解液溶液，颜色较深，右侧管为加多酚吸附片的裂解液溶液，颜色明显较浅。

利用实施例1中方法，分别对两组样品提取基因组DNA，结果如表1：

表1多酚吸附片在草莓叶片提取中的对比结果

从提取的NanoDrop 2000测值结果看，不加多酚吸附片的组提取的基因组DNA比值很差。而加入多酚吸附片后核酸的比值变好，DNA无颜色残留，主带大于48kb，可以满足三代测序对核酸的纯度要求。

实施例3：梨叶片样本裂解液优化

按照实施例1步骤提取1g梨叶片，一组是裂解液组分1.5％(M/V)SDS，50mM Tris-Cl(pH8.5)，20mM EDTA，500mM NaCl，为未加核酸保护剂。实验组为1.5％(M/V)SDS，50mMTris-Cl(pH8.5)，20mM EDTA，500mM NaCl，2％ PEG8000，并加入100微升500mM的DTT。

在提取过程中发现，梨叶片裂解后的溶液粘稠，加入多糖助沉剂后，样本不再粘稠。

基因组DNA结果如表2：

表2多糖助沉剂在梨叶片提取中的对比结果

从提取的NanoDrop 2000测值结果看，提取的基因组DNA比值均较好，加入PEG8000和核酸保护剂的裂解液后，得率提升明显，电泳结果见图2。

实施例4：不同多糖多酚植物样本提取的普适性

选取6种常见多糖多酚样本，月季、松树、山楂、梨、樱桃、土豆，取500mg的样本进行提取，按照实施例1中方法进行基因组DNA提取。

提取得到的基因组DNA测值结果如表3，电泳图见图3，其中1-1，1-2为月季叶样本；2-1，2-2为松针样本；3-1，3-2为山楂叶样本；4-1，4-2为梨叶样本；5-1，5-2为樱桃叶样本；6-1，6-2为土豆叶样本。

表3 6种多糖多酚植物样本基因组DNA提取结果

图3和表3结果表明，采用本发明的试剂以及提取方法，对常见多糖多酚样本月季、松树、山楂、梨、樱桃、土豆提取基因组DNA，获得的基因组DNA比值较好，可以满足三代测序对核酸的纯度要求。并且在提取过程中，没有出现样本粘稠堵柱子的情况，DNA洗脱液无色素残留，提取得率和纯度均能达到三代测序基因组DNA的要求，说明本发明的提取试剂和提取方法具有较广的样本适用性。

实施例5：真菌组织基因组提取

按照实施例1中方法提取5g樟芝培养物，裂解液组分3％(M/V)SDS，50mM Tris-Cl(pH8.5)，20mM EDTA，500mM NaCl，3％ PEG8000，20mM DTT。

基因组DNA结果NanoDrop 2000测值结果如表4，电泳结果见图4。

表4樟芝基因组DNA提取结果

图4和表4结果表明，采用本发明的试剂以及提取方法，同样适用于真菌类的样本基因组DNA提取，提取得到的基因组DNA比值较好，可以满足三代测序对核酸的纯度要求。

实施例6：山楂叶片对比数据

选取1g山楂样本进行提取，和其他厂家产品进行对比实验。

本发明方法使用试剂如下，按照提取步骤进行提取。

裂解液HMW1组分包含：1％(M/V)SDS；50mM Tris-Cl(pH8.5)；20mM EDTA；400mMNaCl；2％(M/V)PEG8000；50mM DTT。

多糖助沉剂HMW2包含：3M NaAc(pH 5.5)；75mM AlCl₃。

平衡结合液HMW3包含：700mM NaCl；100mM MOPS,pH 7.0；15％(v/v)异丙醇或者无水乙醇；0.15％(v/v)TritonX-100。

漂洗液HMW4包含：900mM NaCl；50mM NaAc(pH 5.0)；15％(v/v)异丙醇或者无水乙醇。

洗脱液HMW5包含：1500mM NaCl；100mM MOPS(pH 8.5)；15％(v/v)异丙醇或者无水乙醇。

其他厂家按照产品操作说明书进行。

分别利用本发明试剂盒和其他厂家(厂家MN和QIAGEN，以下分别缩写为厂家M和Q)的DNA提取试剂盒提取的基因组DNA结果，NanoDrop 2000测值结果如表5，电泳结果见图5。

表5山楂叶片基因组DNA提取对比结果

从提取的NanoDrop 2000测值结果看，采用本发明的试剂以及提取方法，提取的基因组DNA得率高，比值较好，可以满足三代测序对核酸的纯度要求，而厂家M和Q的试剂盒不太适用于多糖多酚类植物的基因组DNA提取，获得的基因组DNA质量也不高，不符合三代测序对核酸的纯度要求。并且采用本发明的试剂以及提取方法，没有出现样本粘稠堵柱子的情况，DNA洗脱液无色素残留；而其他厂家产品提取得率较低，纯度较差，厂家Q因为样本过于粘稠，柱子出现堵塞现象，无法完成提取流程，没有得到实验结果。

实施例7：不同填料对比数据

选取1g菊花样本进行提取，和其他类型填料产品进行对比实验。

本发明方法使用试剂如下，按照实施例1中提取步骤进行提取。

裂解液HMW1组分包含：2％(M/V)SDS；750mM Tris-Cl(pH8.5)；50mM EDTA；300mMNaCl；0.5％(M/V)PEG8000；30mM DTT。

多糖助沉剂HMW2包含：2M NaAc(pH 5.5)；50mM AlCl₃。

平衡结合液HMW3包含：750mM NaCl；50mM MOPS,pH 7.0；15％(v/v)异丙醇或者无水乙醇；0.15％(v/v)TritonX-100。

漂洗液HMW4包含：1000mM NaCl；50mM NaAc(pH 5.0)；15％(v/v)异丙醇或者无水乙醇。

洗脱液HMW5包含：1400mM NaCl；50mM MOPS(pH 8.5)；15％(v/v)异丙醇或者无水乙醇。

分别利用本发明和厂家阿拉丁(以下缩写为T)的离子交换填料(DEAE琼脂糖微球)提取基因组DNA结果的效果，NanoDrop 2000测值结果如表6，电泳结果见图6。

表6菊花叶片基因组DNA提取对比结果

从提取的NanoDrop 2000测值结果看，采用本发明的试剂盒中DEAE阴离子交换树脂的基因组DNA提取方法，1g填料的结合能力优于0.5g填料的结果，提取的基因组DNA得率高，比值较好，可以满足三代测序对核酸的纯度要求。而厂家T的DEAE琼脂糖微球不太适用于多糖多酚类植物的基因组DNA提取，未获得基因组DNA。所以从结果看，DEAE阴离子交换硅胶粉树脂结合本发明特定的溶液体系更适合植物三代基因组DNA的提取。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种试剂盒，其特征在于，包括DEAE弱阴离子交换树脂、多糖助沉剂、多酚吸附片，

其中，所述多糖助沉剂包括醋酸盐和氯化铝或硫酸铝铵。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述醋酸盐浓度为1-3M，所述氯化铝或硫酸铝铵的浓度为50-100mM；

任选地，所述醋酸盐包括选自醋酸钠、醋酸铵、醋酸钾中的至少之一；

任选地，所述DEAE弱阴离子交换树脂为二乙基氨基乙基弱阴离子修饰的多孔硅胶粉；

任选地，所述多孔硅胶粉的粒径为70-100μm；

任选地，每克硅胶粉偶联DEAE基团2-3μmol；

任选地，所述多酚吸附片为由纤维素、硅胶、交联聚乙烯吡咯烷酮压制而成的片剂；

任选地，所述多酚吸附片为由10-20％纤维素、20-30％硅胶、50-70％的交联聚乙烯吡咯烷酮压制而成的片剂。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括裂解液、平衡液、漂洗液、洗脱液；

任选地，所述裂解液包括：1-3％M/V SDS、50-100mM Tris-Cl、10-50mM EDTA、300-700mM NaCl、0.5-3.0％M/V PEG8000、5-100mM DTT；

任选地，所述平衡液包括：300-700mM NaCl、50-100mM MOPS、10-15％v/v异丙醇或者无水乙醇、0.05-0.15％v/v TritonX-100；

任选地，所述漂洗液包括：700-1200mM NaCl、50-100mM NaAc、10-15％v/v异丙醇或者无水乙醇；

任选地，所述洗脱液包括：1200-1700mM NaCl、50-100mM MOPS、10-15％v/v异丙醇或者无水乙醇。

4.权利要求1-3中任一项所述的试剂盒在提取DNA中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述DNA源自多糖多酚生物样本；

任选地，所述多糖多酚生物样包括多糖多酚植物样本或多糖多酚真菌类样本。

6.一种提取多糖多酚生物样本中基因组DNA的方法，其特征在于，包括利用权利要求1-3中任意一项所述的试剂盒对多糖多酚生物样本进行基因组DNA的提取。

7.一种提取多糖多酚生物样本中基因组DNA的方法，其特征在于，包括：

1)对所述多糖多酚生物样本进行粉碎处理，获得粉碎物；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多糖多酚生物样包括多糖多酚植物样本或多糖多酚真菌类样本；

任选地，所述多糖助沉剂包括醋酸盐和氯化铝或硫酸铝铵；

任选地，所述醋酸盐浓度为1-3M，所述氯化铝或硫酸铝铵的浓度为50-100mM；

任选地，所述多酚吸附片为由10-20％纤维素、20-30％硅胶、50-70％的交联聚乙烯吡咯烷酮压制而成的片剂；

任选地，所述多孔硅胶粉的粒径为70-100μm；

任选地，每克硅胶粉偶联DEAE基团2-3μmol。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，

所述裂解液包括：1-3％M/V SDS、50-100mM Tris-Cl、10-50mM EDTA、300-700mM NaCl、0.5-3.0％M/V PEG8000、5-100mM DTT；