JP2004290028A - 植物dna溶出試薬及び植物dna抽出キット - Google Patents
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Abstract
【課題】核酸を高精製度で植物体から分離することができる簡便な抽出方法を行い得る試薬及びキットを提供する。
【解決手段】植物組織からDNAを抽出する際に用いるDNA溶出試薬であって、pH7〜9に緩衝された液からなり、アニオン性界面活性剤及び/又は非イオン性界面活性剤からなる界面活性剤と、ポリエーテル系消泡剤とを含む植物DNA溶出試薬;及び植物組織からDNAを抽出する際に用いる植物DNA抽出キットであって、前記DNA溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含む植物DNA抽出キット。
【選択図】 なし
【解決手段】植物組織からDNAを抽出する際に用いるDNA溶出試薬であって、pH7〜9に緩衝された液からなり、アニオン性界面活性剤及び/又は非イオン性界面活性剤からなる界面活性剤と、ポリエーテル系消泡剤とを含む植物DNA溶出試薬;及び植物組織からDNAを抽出する際に用いる植物DNA抽出キットであって、前記DNA溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含む植物DNA抽出キット。
【選択図】 なし
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物材料から植物DNAを抽出、精製するための溶出試薬及び抽出キットに関する。
【0002】
【従来の技術】
植物からその核酸を抽出し精製することは、遺伝子工学等の研究において重要な工程の一つである。このような工程は、多くの場合、数多くの個体について行なわれることが求められるため、その工程はより単純なものであることが好ましい。さらに、このような工程は通常実験室において行なわれるものであるので、実験室において使い勝手がよいものが好ましい。
【0003】
植物の核酸の抽出方法としては、これまでに数多くのものが知られている。例えば、特許文献1及び2には、核酸を核酸結合性固相担体に結合させてから分離する方法が開示されており、これらの方法ではDNA及びRNAを効率的に抽出できる。しかしながらこれらの従来の核酸の抽出方法では、試料からの核酸の抽出割合が不充分であるため、さらに核酸の抽出割合が高い抽出方法が求められている。
【0004】
【特許文献1】
特開平2−289596号公報
【特許文献2】
特開平11−169170号公報
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、核酸を高精製度で植物体から分離することができる簡便な抽出方法を行い得る試薬及びキットを提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々検討をおこなったところ、植物組織から核酸を溶出させるための試薬の組成を特定のものとし、これを、核酸結合性固相担体を用いる抽出方法に適用することにより、効率的に核酸を抽出しうることを見出し、本発明を完成した。
【0007】
即ち、本発明によれば、植物組織からDNAを抽出する際に用いるDNA溶出試薬であって、pH7〜9に緩衝された液からなり、アニオン性界面活性剤及び/又は非イオン性界面活性剤からなる界面活性剤と、ポリエーテル系消泡剤とを含むことを特徴とする植物DNA溶出試薬が提供される。
【0008】
また、本発明によれば、植物組織からDNAを抽出する際に用いる植物DNA抽出キットであって、前記DNA溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含むことを特徴とする植物DNA抽出キットが提供される。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明の植物DNA溶出試薬は、pH7〜9、好ましくはpH7〜8に緩衝された液からなる。具体的にはトリス等の緩衝剤を含み、塩酸等によりこの範囲のpHに調整された液とすることができる。本発明の植物DNA溶出試薬中の前記緩衝剤の含有割合の下限値は、20mM以上、より好ましくは30mM以上とすることができる。上限値は特に限定されないが、通常は500mM以下とすることができる。
【0010】
本発明の植物DNA溶出試薬は、アニオン性界面活性剤及び/又は非イオン性界面活性剤からなる界面活性剤を含む。前記界面活性剤としては、具体的には例えばラウリル硫酸ナトリウム、N−ラウロイルサルコシンナトリウム、リン酸ラウリル、カプリレート塩、コレート塩、スルフォン酸デカン塩、及びこれらの混合物等を挙げることができる。前記界面活性剤の含有割合は、植物DNA溶出試薬全量に対して0.1〜10%とすることができる。
【0011】
本発明の植物DNA溶出試薬は、ポリエーテル系消泡剤を含む。前記ポリエーテル系化合物としては、例えばオキシエチレン、オキシプロピレン等の重合単位を持つ重合体又はその誘導体を挙げることができる。
【0012】
本発明の植物DNA溶出試薬は、必要に応じてキレート剤を含むことができる。前記キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコールビス四酢酸、8−ヒドロキシ−2−メチルキノリン、8−ヒドロキニリン−5−スルフォン酸、1,10−フェナントロリン、8−キノリノール、サリチル酸、これらの塩及びこれらの混合物等を挙げることができる。本発明の植物DNA溶出試薬中の前記キレート剤の含有割合は、10〜50mM、好ましくは20〜30mMとすることができる。
【0013】
本発明の植物DNA溶出試薬の調製方法は、特に限定されず、上記各成分を水に溶解することにより調製することができる。
【0014】
本発明の植物DNA抽出キットは、前記DNA溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含む。
【0015】
前記核酸吸着液は、カオトロピック物質として、グアニジンの塩(チオシアン酸塩、塩酸塩等)、並びにSCN−及びI−の塩(ナトリウム塩、カリウム塩等)等を含むことができる。前記核酸吸着液中の前記カオトロピック物質の含有割合は、1M〜20M、好ましくは5〜15Mとすることができる。
【0016】
前記核酸吸着液は、さらに、pHを一定とするための緩衝剤を含むことができる。当該緩衝剤としては、酢酸ナトリウム緩衝剤等を挙げることができる。
【0017】
前記核酸結合性担体は、通常固相の担体とすることができ、好ましくは細胞の溶解液を容易に接触させることができる磁性粒子等の粒子、フィルタ、反応容器等の形状とすることができる。前記担体の材質は、カオトロピック物質の存在下でDNAを吸着することができるものであれば特に限定されないが、核酸吸着能を有するものであれば特に限定されないが、シリカ、又は他の物質上にシリカを結合させたもの等を好ましく挙げることができる。
【0018】
本発明の植物DNA抽出キットは、前記試薬、吸着液及び担体に加え、任意に、リセート分離用フィルタ、核酸結合性担体の洗浄液、核酸結合性担体から核酸を分離させる分離液又はこれらの2種以上の組み合わせをさらに含むことができる。前記リセート分離用フィルタは特に限定されず、現在商業的に入手可能なリセートのクリーニング用のフィルタ等を挙げることができる。前記核酸結合性担体の洗浄液は、固相からのDNAの溶出を促進せずに他の物質を担体から洗い落とすことができる物質であれば特に限定されず、40〜80%、好ましくは約70%エタノール等のアルコール等を含む水溶液を挙げることができる。前記分離液は、前記核酸結合性担体に結合したDNAを核酸結合性担体から分離しうる液体であり、水又は適当なpHの緩衝液を適宜用いることができる。具体的には例えば、TE緩衝液(10mMトリス−塩酸緩衝液、含1mM EDTA、pH8.0)を挙げることができる。
【0019】
本発明の植物DNA溶出試薬又は本発明の植物DNA抽出キットによる植物DNAの抽出は、具体的には例えば、前記植物DNA溶出試薬を植物組織に混合して植物組織中の細胞を溶解させ、細胞溶解液を得る工程(a)と;前記細胞溶解液に、前記カオトロピック物質を含む核酸吸着液を混合し、混合液を得る工程(b)と;前記混合液を、必要に応じて前記リセート分離用フィルタに通す工程(b’)と;前記混合液を前記核酸結合性担体に接触させて、前記担体にDNAを結合させる工程(c)と;前記核酸結合性担体上のDNAを、前記洗浄液を用いて洗浄する工程(d)と;前記核酸結合性担体からDNAを分離する工程(e)とを含む方法により行なうことができる。
【0020】
前記工程(a)における前記DNA溶出試薬と植物組織との添加割合は、特に限定されないが、例えば50mgの植物組織に対し、50〜250μlの割合とすることができる。
【0021】
前記工程(a)は、適当なチューブ等の容器に、前記DNA溶出試薬と植物組織とを入れ、さらに破砕球を入れて振とうすることにより行なうことができる。前記破砕球としては、セラミック、タングステン、ステンレス、ジルコニア等の球状又は歪んだ球状のビーズ等を用いることができる。破砕球の寸法は特に限定されないが、例えば内径5mm程度のチューブ中で破砕を行なう場合、直径4mm程度の破砕球1個を入れて行なうことができる。
【0022】
特に前記工程(a)は、添加するDNA溶出試薬の一部を先に植物組織と混合し、破砕球等により破砕し、それからDNA溶出試薬の残りを添加することにより行なうことができる。具体的には例えば、約100μlのDNA溶出試薬と植物組織とをチューブ等の容器に入れ、振とうを行なってから、さらに約100μlのDNA溶出試薬を混合することができる。このように、先に比較的少量の溶出試薬によって、より短時間の破砕操作で、DNAに物理的な切断をもたらさずに、効率的に破砕を行なうことができる。
【0023】
前記工程(b)において、前記核酸吸着液の添加量は、特に限定されないが植物組織50mgに対し、150〜250μlの割合とすることができる。前記工程(b)終了後、得られた混合液は、一旦遠心分離し上澄のみを取ってから次の操作に供することが好ましい。
【0024】
前記工程(b’)において、前記混合液をリセート分離用フィルタに通す操作は、特に限定されないが、底部がフィルタとなったウェルの形状を有するものなどの通常のフィルタに前記混合液を入れ、遠心することにより行なうことができる。
【0025】
また、前記工程(c)において、前記混合液を前記核酸結合性担体に接触させる操作は、特に限定されないが、前記分離用フィルタを通過した前記混合液をそのまま、核酸結合性担体のフィルタに通過させることにより行うことができる。
【0026】
前記工程(d)において、前記核酸結合性担体上のDNAを、前記洗浄液を用いて洗浄する操作は、特に限定されないが、例えば前記洗浄液を、50mgの植物組織に対し50〜250μl程度核酸結合性担体のフィルタに通過させることにより行うことができる。
【0027】
前記工程(e)において、前記核酸結合性担体から前記DNAを分離する操作は、前記分離液を前記核酸結合性担体のフィルタに通し、通過した液をDNA溶液として回収することにより行なうことができる。ここで得られたDNA溶液は、そのまま、PCRテンプレート等として用いることができる。
【0028】
【発明の効果】
本発明の植物DNA溶出試薬、植物DNA抽出キット及び植物DNAの抽出方法は、特定の組成の溶出試薬を採用することにより、DNAを簡便且つ効率的に抽出することができる。
【0029】
【実施例】
以下、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【0030】
【実施例1及び比較例1】
表1に示す組成の植物DNA溶出試薬1(実施例1)及び2(比較例1)、並びに表2に示す核酸吸着液1を、各成分を蒸留水に溶解することにより調製した。
【0031】
【表1】
【0032】
【表2】
【0033】
【実施例2】
実施例1にて調製した溶出試薬1及び核酸吸着液1を用いて、以下の手順(a)〜(e)により、表3及び表4に示す各種の植物試料について、DNAの抽出を行なった。
【0034】
(a)シロイヌナズナ(コロンビア野生型)成熟植物個体普通葉 50mgとジルコニアビーズ(直径4mm)一つを、Collection Microtubes (Qiagen社製、商品番号19560)の各チューブに入れた。200μlの溶出試薬1を、各チューブに加え、Collection Microtube Caps (Qiagen社製、商品番号19566)で蓋をし、ミキサーミル(Qiagen社製、商品名MM300、商品番号85100)で、30 1/sにて1.5分間撹拌した。植物試料が完全に粉砕されるまで、この撹拌を最大4回繰返し、細胞溶解液を得た。
【0035】
(b)工程(a)で得られた細胞溶解液に、核酸吸着液1を200μl添加し、手で激しく撹拌し、遠心機(商品名CF16RX、日立製作所製、スイングバケットローターT5S32を備える)を用い、4800rpmで10分間遠心し、上澄みを得、混合液とした。
【0036】
(c)リセートのクリーニング用のフィルタ(Millipore社製、商品名MultiScreen NA)を、核酸結合性担体フィルタ(Millipore社製、商品名MutiScreen FB)上に、遠心分離用アダプタ(Millipore社製、商品番号MACF 096 04)を用いてセットし、フロースルーコレクションプレート上に置いた。(b)で得た上澄み200μlをクリーニング用フィルタの各ウェル上に置き、2分間100rpmで遠心し、リセートをフィルタに通した。
【0037】
(d)クリーニング用フィルタを取り除き、核酸結合性担体フィルタの各ウェル上に200μlの70%エタノール水溶液を加え、1500rpmで2分間遠心し、フィルタを通過した液を廃棄した。
【0038】
(e)核酸結合性担体フィルタの各ウェルに、60℃に加温した50μlのTE緩衝液(10mM Tris−HCl buffer, 1mM EDTA pH 8.0)を加え、1分間放置した。核酸結合性担体フィルタを96ウェルVボトムプレートに、遠心アダプタを用いて取り付け、2000rpmで1分間遠心し、Vボトムプレート中に、植物DNA抽出物溶液を得た。
【0039】
得られた植物DNA抽出物溶液について、DNA濃度(μg/ml)を測定し、収量(μg)を求め、また、核酸の純度の指標であるOD260/280を測定した。測定はそれぞれ4検体について行ない、平均を求めた。結果を表3に示す。
【0040】
【比較例2】
溶出試薬として比較例1にて調製した溶出試薬2を用いた他は、実施例2と同様にして、DNAの抽出を行なった。結果を表3に示す。
【0041】
【表3】
【0042】
表3に示す通り、DNAの収量、品質ともに実施例2の方が比較例2より好成績であり、収量は約34%向上した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物材料から植物DNAを抽出、精製するための溶出試薬及び抽出キットに関する。
【0002】
【従来の技術】
植物からその核酸を抽出し精製することは、遺伝子工学等の研究において重要な工程の一つである。このような工程は、多くの場合、数多くの個体について行なわれることが求められるため、その工程はより単純なものであることが好ましい。さらに、このような工程は通常実験室において行なわれるものであるので、実験室において使い勝手がよいものが好ましい。
【0003】
植物の核酸の抽出方法としては、これまでに数多くのものが知られている。例えば、特許文献1及び2には、核酸を核酸結合性固相担体に結合させてから分離する方法が開示されており、これらの方法ではDNA及びRNAを効率的に抽出できる。しかしながらこれらの従来の核酸の抽出方法では、試料からの核酸の抽出割合が不充分であるため、さらに核酸の抽出割合が高い抽出方法が求められている。
【0004】
【特許文献1】
特開平2−289596号公報
【特許文献2】
特開平11−169170号公報
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、核酸を高精製度で植物体から分離することができる簡便な抽出方法を行い得る試薬及びキットを提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために種々検討をおこなったところ、植物組織から核酸を溶出させるための試薬の組成を特定のものとし、これを、核酸結合性固相担体を用いる抽出方法に適用することにより、効率的に核酸を抽出しうることを見出し、本発明を完成した。
【0007】
即ち、本発明によれば、植物組織からDNAを抽出する際に用いるDNA溶出試薬であって、pH7〜9に緩衝された液からなり、アニオン性界面活性剤及び/又は非イオン性界面活性剤からなる界面活性剤と、ポリエーテル系消泡剤とを含むことを特徴とする植物DNA溶出試薬が提供される。
【0008】
また、本発明によれば、植物組織からDNAを抽出する際に用いる植物DNA抽出キットであって、前記DNA溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含むことを特徴とする植物DNA抽出キットが提供される。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明の植物DNA溶出試薬は、pH7〜9、好ましくはpH7〜8に緩衝された液からなる。具体的にはトリス等の緩衝剤を含み、塩酸等によりこの範囲のpHに調整された液とすることができる。本発明の植物DNA溶出試薬中の前記緩衝剤の含有割合の下限値は、20mM以上、より好ましくは30mM以上とすることができる。上限値は特に限定されないが、通常は500mM以下とすることができる。
【0010】
本発明の植物DNA溶出試薬は、アニオン性界面活性剤及び/又は非イオン性界面活性剤からなる界面活性剤を含む。前記界面活性剤としては、具体的には例えばラウリル硫酸ナトリウム、N−ラウロイルサルコシンナトリウム、リン酸ラウリル、カプリレート塩、コレート塩、スルフォン酸デカン塩、及びこれらの混合物等を挙げることができる。前記界面活性剤の含有割合は、植物DNA溶出試薬全量に対して0.1〜10%とすることができる。
【0011】
本発明の植物DNA溶出試薬は、ポリエーテル系消泡剤を含む。前記ポリエーテル系化合物としては、例えばオキシエチレン、オキシプロピレン等の重合単位を持つ重合体又はその誘導体を挙げることができる。
【0012】
本発明の植物DNA溶出試薬は、必要に応じてキレート剤を含むことができる。前記キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコールビス四酢酸、8−ヒドロキシ−2−メチルキノリン、8−ヒドロキニリン−5−スルフォン酸、1,10−フェナントロリン、8−キノリノール、サリチル酸、これらの塩及びこれらの混合物等を挙げることができる。本発明の植物DNA溶出試薬中の前記キレート剤の含有割合は、10〜50mM、好ましくは20〜30mMとすることができる。
【0013】
本発明の植物DNA溶出試薬の調製方法は、特に限定されず、上記各成分を水に溶解することにより調製することができる。
【0014】
本発明の植物DNA抽出キットは、前記DNA溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含む。
【0015】
前記核酸吸着液は、カオトロピック物質として、グアニジンの塩(チオシアン酸塩、塩酸塩等)、並びにSCN−及びI−の塩(ナトリウム塩、カリウム塩等)等を含むことができる。前記核酸吸着液中の前記カオトロピック物質の含有割合は、1M〜20M、好ましくは5〜15Mとすることができる。
【0016】
前記核酸吸着液は、さらに、pHを一定とするための緩衝剤を含むことができる。当該緩衝剤としては、酢酸ナトリウム緩衝剤等を挙げることができる。
【0017】
前記核酸結合性担体は、通常固相の担体とすることができ、好ましくは細胞の溶解液を容易に接触させることができる磁性粒子等の粒子、フィルタ、反応容器等の形状とすることができる。前記担体の材質は、カオトロピック物質の存在下でDNAを吸着することができるものであれば特に限定されないが、核酸吸着能を有するものであれば特に限定されないが、シリカ、又は他の物質上にシリカを結合させたもの等を好ましく挙げることができる。
【0018】
本発明の植物DNA抽出キットは、前記試薬、吸着液及び担体に加え、任意に、リセート分離用フィルタ、核酸結合性担体の洗浄液、核酸結合性担体から核酸を分離させる分離液又はこれらの2種以上の組み合わせをさらに含むことができる。前記リセート分離用フィルタは特に限定されず、現在商業的に入手可能なリセートのクリーニング用のフィルタ等を挙げることができる。前記核酸結合性担体の洗浄液は、固相からのDNAの溶出を促進せずに他の物質を担体から洗い落とすことができる物質であれば特に限定されず、40〜80%、好ましくは約70%エタノール等のアルコール等を含む水溶液を挙げることができる。前記分離液は、前記核酸結合性担体に結合したDNAを核酸結合性担体から分離しうる液体であり、水又は適当なpHの緩衝液を適宜用いることができる。具体的には例えば、TE緩衝液(10mMトリス−塩酸緩衝液、含1mM EDTA、pH8.0)を挙げることができる。
【0019】
本発明の植物DNA溶出試薬又は本発明の植物DNA抽出キットによる植物DNAの抽出は、具体的には例えば、前記植物DNA溶出試薬を植物組織に混合して植物組織中の細胞を溶解させ、細胞溶解液を得る工程(a)と;前記細胞溶解液に、前記カオトロピック物質を含む核酸吸着液を混合し、混合液を得る工程(b)と;前記混合液を、必要に応じて前記リセート分離用フィルタに通す工程(b’)と;前記混合液を前記核酸結合性担体に接触させて、前記担体にDNAを結合させる工程(c)と;前記核酸結合性担体上のDNAを、前記洗浄液を用いて洗浄する工程(d)と;前記核酸結合性担体からDNAを分離する工程(e)とを含む方法により行なうことができる。
【0020】
前記工程(a)における前記DNA溶出試薬と植物組織との添加割合は、特に限定されないが、例えば50mgの植物組織に対し、50〜250μlの割合とすることができる。
【0021】
前記工程(a)は、適当なチューブ等の容器に、前記DNA溶出試薬と植物組織とを入れ、さらに破砕球を入れて振とうすることにより行なうことができる。前記破砕球としては、セラミック、タングステン、ステンレス、ジルコニア等の球状又は歪んだ球状のビーズ等を用いることができる。破砕球の寸法は特に限定されないが、例えば内径5mm程度のチューブ中で破砕を行なう場合、直径4mm程度の破砕球1個を入れて行なうことができる。
【0022】
特に前記工程(a)は、添加するDNA溶出試薬の一部を先に植物組織と混合し、破砕球等により破砕し、それからDNA溶出試薬の残りを添加することにより行なうことができる。具体的には例えば、約100μlのDNA溶出試薬と植物組織とをチューブ等の容器に入れ、振とうを行なってから、さらに約100μlのDNA溶出試薬を混合することができる。このように、先に比較的少量の溶出試薬によって、より短時間の破砕操作で、DNAに物理的な切断をもたらさずに、効率的に破砕を行なうことができる。
【0023】
前記工程(b)において、前記核酸吸着液の添加量は、特に限定されないが植物組織50mgに対し、150〜250μlの割合とすることができる。前記工程(b)終了後、得られた混合液は、一旦遠心分離し上澄のみを取ってから次の操作に供することが好ましい。
【0024】
前記工程(b’)において、前記混合液をリセート分離用フィルタに通す操作は、特に限定されないが、底部がフィルタとなったウェルの形状を有するものなどの通常のフィルタに前記混合液を入れ、遠心することにより行なうことができる。
【0025】
また、前記工程(c)において、前記混合液を前記核酸結合性担体に接触させる操作は、特に限定されないが、前記分離用フィルタを通過した前記混合液をそのまま、核酸結合性担体のフィルタに通過させることにより行うことができる。
【0026】
前記工程(d)において、前記核酸結合性担体上のDNAを、前記洗浄液を用いて洗浄する操作は、特に限定されないが、例えば前記洗浄液を、50mgの植物組織に対し50〜250μl程度核酸結合性担体のフィルタに通過させることにより行うことができる。
【0027】
前記工程(e)において、前記核酸結合性担体から前記DNAを分離する操作は、前記分離液を前記核酸結合性担体のフィルタに通し、通過した液をDNA溶液として回収することにより行なうことができる。ここで得られたDNA溶液は、そのまま、PCRテンプレート等として用いることができる。
【0028】
【発明の効果】
本発明の植物DNA溶出試薬、植物DNA抽出キット及び植物DNAの抽出方法は、特定の組成の溶出試薬を採用することにより、DNAを簡便且つ効率的に抽出することができる。
【0029】
【実施例】
以下、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【0030】
【実施例1及び比較例1】
表1に示す組成の植物DNA溶出試薬1(実施例1)及び2(比較例1)、並びに表2に示す核酸吸着液1を、各成分を蒸留水に溶解することにより調製した。
【0031】
【表1】
【0032】
【表2】
【0033】
【実施例2】
実施例1にて調製した溶出試薬1及び核酸吸着液1を用いて、以下の手順(a)〜(e)により、表3及び表4に示す各種の植物試料について、DNAの抽出を行なった。
【0034】
(a)シロイヌナズナ(コロンビア野生型)成熟植物個体普通葉 50mgとジルコニアビーズ(直径4mm)一つを、Collection Microtubes (Qiagen社製、商品番号19560)の各チューブに入れた。200μlの溶出試薬1を、各チューブに加え、Collection Microtube Caps (Qiagen社製、商品番号19566)で蓋をし、ミキサーミル(Qiagen社製、商品名MM300、商品番号85100)で、30 1/sにて1.5分間撹拌した。植物試料が完全に粉砕されるまで、この撹拌を最大4回繰返し、細胞溶解液を得た。
【0035】
(b)工程(a)で得られた細胞溶解液に、核酸吸着液1を200μl添加し、手で激しく撹拌し、遠心機(商品名CF16RX、日立製作所製、スイングバケットローターT5S32を備える)を用い、4800rpmで10分間遠心し、上澄みを得、混合液とした。
【0036】
(c)リセートのクリーニング用のフィルタ(Millipore社製、商品名MultiScreen NA)を、核酸結合性担体フィルタ(Millipore社製、商品名MutiScreen FB)上に、遠心分離用アダプタ(Millipore社製、商品番号MACF 096 04)を用いてセットし、フロースルーコレクションプレート上に置いた。(b)で得た上澄み200μlをクリーニング用フィルタの各ウェル上に置き、2分間100rpmで遠心し、リセートをフィルタに通した。
【0037】
(d)クリーニング用フィルタを取り除き、核酸結合性担体フィルタの各ウェル上に200μlの70%エタノール水溶液を加え、1500rpmで2分間遠心し、フィルタを通過した液を廃棄した。
【0038】
(e)核酸結合性担体フィルタの各ウェルに、60℃に加温した50μlのTE緩衝液(10mM Tris−HCl buffer, 1mM EDTA pH 8.0)を加え、1分間放置した。核酸結合性担体フィルタを96ウェルVボトムプレートに、遠心アダプタを用いて取り付け、2000rpmで1分間遠心し、Vボトムプレート中に、植物DNA抽出物溶液を得た。
【0039】
得られた植物DNA抽出物溶液について、DNA濃度(μg/ml)を測定し、収量(μg)を求め、また、核酸の純度の指標であるOD260/280を測定した。測定はそれぞれ4検体について行ない、平均を求めた。結果を表3に示す。
【0040】
【比較例2】
溶出試薬として比較例1にて調製した溶出試薬2を用いた他は、実施例2と同様にして、DNAの抽出を行なった。結果を表3に示す。
【0041】
【表3】
【0042】
表3に示す通り、DNAの収量、品質ともに実施例2の方が比較例2より好成績であり、収量は約34%向上した。
Claims (4)
- 植物組織からDNAを抽出する際に用いるDNA溶出試薬であって、pH7〜9に緩衝された液からなり、アニオン性界面活性剤及び/又は非イオン性界面活性剤からなる界面活性剤と、ポリエーテル系消泡剤とを含むことを特徴とする植物DNA溶出試薬。
- 前記界面活性剤が、ラウリル硫酸ナトリウム、N−ラウロイルサルコシンナトリウム、リン酸ラウリル、カプリレート塩、コレート塩、スルフォン酸デカン塩及びこれらの混合物からなる群より選択されるアニオン性界面活性剤であり、前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコールビス四酢酸、8−ヒドロキシ−2−メチルキノリン、8−ヒドロキニリン−5−スルフォン酸、1,10−フェナントロリン、8−キノリノール、サリチル酸、これらの塩及びこれらの混合物からなる群より選択されるキレート剤であることを特徴とする請求項1記載のDNA溶出試薬。
- 植物組織からDNAを抽出する際に用いる植物DNA抽出キットであって、請求項1又は2記載のDNA溶出試薬と、カオトロピック物質を含む核酸吸着液と、核酸結合性担体とを含むことを特徴とする植物DNA抽出キット。
- リセート分離用フィルタ、核酸結合性担体の洗浄液、核酸結合性担体から核酸を分離させる分離液、又はこれらの2種以上の組み合わせをさらに含むことを特徴とする請求項3記載の植物DNA抽出キット。
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Family Applications (1)
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- 2003-03-26 JP JP2003084164A patent/JP2004290028A/ja active Pending
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