JP2002542780A - 炭化ケイ素を使用した核酸精製法 - Google Patents

炭化ケイ素を使用した核酸精製法

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JP2002542780A JP2000614378A JP2000614378A JP2002542780A JP 2002542780 A JP2002542780 A JP 2002542780A JP 2000614378 A JP2000614378 A JP 2000614378A JP 2000614378 A JP2000614378 A JP 2000614378A JP 2002542780 A JP2002542780 A JP 2002542780A
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ハジ−アハマド ユーセフ
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ハジ−アハマド ユーセフ
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Abstract

(57)【要約】 開示の発明は特にＤＮＡ精製方法を対象とし、特に、生物学的に活性なプラスミドＤＮＡの分離に有用である。この方法は、カオトロピック剤の存在する条件、またはカオトロピック剤の存在しない条件で、炭化ケイ素粒子にＤＮＡを結合させることによって開始される。結合させたＤＮＡを続いて、低塩緩衝液または水の中で樹脂から溶離させる。その結果得られる精製されたＤＮＡはタンパク質を実質的に含まず、生物学的に活性であることが示された。本明細書にはこの方法の範囲および多様性が示されている。すなわちこの方法は、ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡの分離、ＰＣＲ生成物の精製、ならびにアガロースゲル薄片からのＤＮＡの分離に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は核酸精製法に関し、詳細には不活性担体に核酸を結合させることによ
って溶液から核酸を取り出す精製方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 科学および医学研究で使用されるＤＮＡおよびＲＮＡの純度がこのような研究
の成功にとって重要な因子であることはよく知られている。例えば、細胞培養に
おける遺伝子導入実験、ＤＮＡベースのワクチンを使用した免疫感作およびＤＮ
Ａ配列決定プロジェクトは、高純度のＤＮＡがプロジェクト成功の必須条件であ
る研究領域である。通常、十分に純粋なＤＮＡを伝統的なＤＮＡ分離法を使用し
て得ることはできない。さらに、ＤＮＡの分離、精製プロセスは分子生物学にお
ける主な速度制限段階となっている。純粋なＤＮＡを分離する伝統的な方法は一
般に、フェノール／クロロホルム抽出法などのように有毒な化学物質を含み、塩
化セシウムバンディング法などのように遠心分離に非常に長い時間がかかる。こ
のような手法は時間および費用がかかるだけでなく、実験スタッフに対する健康
リスクとなり、通常高価な有害化学物質の廃棄を伴う。さらに、注意深い調製に
もかかわらず、これらの方法を使用して調製したＤＮＡが常に、ＲＮＡ、タンパ
ク質および染色体ＤＮＡを含まないというわけではない。
【０００３】 その結果、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌内で増やした安全かつ高品質で、短時間で
得られるＤＮＡ製剤に対する要求が着実に高まっており、広範囲にわたるＤＮＡ
精製のニーズを満たすさまざまな市販キットが販売されている。しかし、これら
のキットのなかには、価格が高い、所望の品質および収量が得られないなどの欠
点を持つものもある。
【０００４】 ＤＮＡが、ガラススラリー、ケイ藻土などの含ケイ素材料に結合することは知
られている。実際、これらの含ケイ素物質を利用したＤＮＡ精製キットも売り出
されている。例えば、Ｂｉｏ１０１は、ガラススラリーおよびヨウ化ナトリウム
（結合緩衝剤）を利用したＧＥＮＥＣＬＥＡＮ（商標）キットであり、ＢｉｏＲ
ａｄ（商標）は、塩酸グアニジン緩衝液に懸濁させたケイ藻土（Ｃｅｌｉｔｅ（
商標））を使用したプラスミド精製キットである。
【０００５】 Ｗｏｏｄａｒｄ他の米国特許第５５０３８１６号、５５２５３１９号および５
６９３７８５号には、ＤＮＡ精製に対してケイ酸塩化合物を使用することが記載
されている。これらの材料の欠点は、必要となる適当な形態のケイ酸塩材料が購
入困難なこと、および一般に調製しなければならず、そのためＤＮＡ分離手法に
余分な時間が加わることである。
【０００６】 米国特許第５４３８１２９号および５６２５０５４号には、粉化Ｃｅｌｉｔｅ
（商標）、粉化二酸化ケイ素、または粉化水酸化アルミニウムを利用したＤＮＡ
分離手法が記載されている。これらの発明では、ＤＮＡが結合する粉化表面を生
み出すのに有毒な化学物質の使用が必要となる。さらに、これらの手法には有毒
なカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）が依然として必要である。
【０００７】 米国特許第５５３４０５４および５７０５６２８号には、有毒なカオトロピッ
ク剤の使用を必要としないＤＮＡ分離方法が開示されている。前者の特許は、Ｄ
ＮＡ精製にシリコンテトラヒドラジドを使用することを開示しているが、この結
合材の調製には、吐き気、一時的な視覚喪失などの状態を引き起こす可能性があ
る有毒化学物質の使用が必要である。後者の特許は、磁性微粒子を使用したＤＮ
Ａ粒子の非特異的可逆結合に関する。
【０００８】 （発明の概要） 本発明の目的は、安価な市販材料を使用したＤＮＡの精製方法であって、カオ
トロピック剤の使用を必要とせず、高品質のＤＮＡ製剤を短時間に得ることがで
きる方法を提供することにある。
【０００９】 これに応じて本発明は、ヌクレオチドポリマーの結合に炭化ケイ素を使用する
。
【００１０】 本発明はさらに、サンプルから核酸を精製する方法を提供する。この方法は、 核酸を結合させるための炭化ケイ素担体を用意する段階、 核酸を含むサンプルを担体に加えて、サンプル中の核酸を炭化ケイ素に結合さ
せる段階、 この液体から炭化ケイ素を分離する段階、 炭化ケイ素に結合した核酸を炭化ケイ素から溶離させる段階 を含む。
【００１１】 本発明は、炭化ケイ素化合物、好ましくは工業用品質の市販炭化ケイ素を使用
した経済的な核酸精製法を提供する。精製に使用可能な一般的な工業用炭化ケイ
素（ＳｉＣ）製剤は、９７．８％の炭化ケイ素、ならびに小量の二酸化ケイ素、
ケイ素、鉄、アルミニウムおよび炭素から成る。この物質は価格が手頃であり、
ＤＮＡ結合材料として容易に入手可能である。炭化ケイ素は、さまざまな粒径ま
たはグレードのものが入手可能であり、それぞれのグレードは異なる核酸結合能
力を有する（これらは全てカナダ、オンタリオ州ＭｉｓｓｉｓｓａｕｇａのＲｉ
ｔｃｈｅｙ Ｓｕｐｐｌｙ社を通じて入手した）。本発明に基づく方法で使用す
るＳｉＣはどのグレードのものも１５％（ｗ／ｖ）スラリーとすることが好まし
く、蒸留水または塩酸グアニジン溶液に懸濁させたスラリーであることが好まし
い。
【００１２】 本発明の好ましい他の方法は、サンプルからのプラスミドＤＮＡの精製に使用
される。この方法は、 １．結合緩衝液の存在する条件、または結合緩衝液の存在しない条件で、サン
プル中のＤＮＡを炭化ケイ素１０００上に固定化する段階、 ２．炭化ケイ素を、炭化ケイ素上に固定化されたＤＮＡと一緒にサンプルから
分離する段階、 ３．炭化ケイ素に結合したＤＮＡをエタノールを含む緩衝液で洗浄する段階、 ４．エタノールを含む緩衝液を除去する段階、および ５．低塩緩衝液（ＴＥ）または水の中でＤＮＡを溶離させる段階 を含む。
【００１３】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 試験した全てのグレードの炭化ケイ素でプラスミドＤＮＡを精製することがで
きた。さらに、ＤＮＡを炭化ケイ素に結合させるのに対しては、全てのモル濃度
の塩酸グアニジン（０Ｍ、すなわち蒸留水を含む）が十分であるように見えた。
しかし、以下の２つの傾向が明らかであった。
【００１４】 １．より微細なグレードの炭化ケイ素（すなわちＳｉＣ１０００などの小粒径
の炭化ケイ素）ほど、結合したプラスミドＤＮＡの収量は高くなるようである。
【００１５】 ２．高濃度の塩酸グアニジン（５〜７Ｍ）のほうがプラスミドの収量は高かっ
た。したがって、この報告に例示したほとんどの例は、５〜７モルの塩酸グアニ
ジン溶液に懸濁させたＳｉＣ１０００の使用を含む。
【００１６】 実施した例示的な方法の主要な目的は、塩酸グアニジンなどの高塩結合緩衝液
の存在下でＤＮＡを炭化ケイ素１０００上に固定化することによって溶菌液から
プラスミドＤＮＡを精製することである。結合したＤＮＡは続いて、ＴＥ緩衝液
または水などの低塩緩衝液中で溶離させた。
【００１７】 一般に、本発明の好ましい方法を使用したプラスミドＤＮＡ分離の最初の段階
は、関心のプラスミドを含む宿主細胞から成る一夜培養菌を１〜３ｍｌのペレッ
トにする段階である。これに続いて、ＲＮアーゼＡ１００μｇ／ｍｌを含むトリ
スＨＣｌおよびＥＤＴＡ緩衝液にこの細菌ペレットを再懸濁させる。この緩衝液
にＲＮアーゼＡが存在すると、最終プラスミド製剤中に一般に見られるＲＮＡの
量が大幅に低減する。次いで、アルカリ条件（ＮａＯＨおよびドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ））下でこの細胞を、再懸濁させた細胞を含む試験管が概ね透明
になるまで（一般に５分以上はかからない）溶解させる。次いで、２Ｍ酢酸カリ
ウムを使用してこの溶液を中和し、少なくとも１０分間、遠心分離する。この段
階の後、プラスミドＤＮＡを含む溶液を炭化ケイ素と接触させる。プラスミドは
ＳｉＣに結合するが、タンパク質および他の巨大分子は一般に結合しない。次段
の洗浄段階の間、プラスミドＤＮＡはＳｉＣとの結合を維持するが、洗液を吸引
除去するか、またはスピンカラムフィルターに通すとタンパク質は除去される。
一般に２回の洗浄の後、（スピンフィルターカラム内の）樹脂床または（遠心分
離管内の）樹脂ペレットを、一般に６５℃に温めた低塩緩衝液（ＴＥ）または水
を用いて洗浄して、プラスミドＤＮＡを溶離させる。溶離緩衝液の量が多いほど
炭化ケイ素からより多くのＤＮＡが放出される傾向があるが、溶離緩衝液の量が
多いほど最終ＤＮＡ製剤の濃度が大幅に低くなる傾向もある。また、小量の溶離
液を２回使用したほうが大量の溶離液を１回使用するよりも多くのＤＮＡが溶離
する傾向がある。例えば、１００μｌの溶離液で１回溶離させるよりも各回５０
μｌで２回溶離させたほうが、多くのプラスミドＤＮＡが得られる傾向がある。
【００１８】 プラスミドＤＮＡの分離方法およびその他の核酸の分離を以下の例で詳細に説
明する。これらの例は、本発明の範囲および多様性を示すように設計されたもの
であり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。実際、可能な全
ての例を本明細書に示したわけではない。
【００１９】 炭化ケイ素は、水、酸およびアルカリに不溶の濃灰色の結晶性物質である。商
用炭化ケイ素製剤が入手可能であり、これらの製剤は一般に９８％超のＳｉＣか
ら成り、さらに、小量の炭素（Ｃ）、ケイ素（Ｓｉ）、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2
）および鉄（Ｆｅ）を含む。炭化ケイ素も、さまざまな粒径ないしグレードのも
のが入手可能である。本発明の好ましい一実施形態では、１０００グレードとし
て知られる平均粒径４．５ミクロンの炭化ケイ素を利用する。使用した炭化ケイ
素は、ＥＸＯＬＯＮ ＥＳＫ社（米ニューヨーク州Ｔｏｎａｗａｎｄａ）によっ
て製造され、Ｒｉｔｃｈｅｙ Ｓｕｐｐｌｙ社（カナダ、オンタリオ州Ｍｉｓｓ
ｉｓｓａｕｇａ）を通じて配給されたものである。
【００２０】 実施例１ 炭化ケイ素１０００スラリーの調製 本発明の好ましい実施形態では、蒸留水または塩酸グアニジン結合緩衝液に懸
濁させた１０００グレードの炭化ケイ素（炭化ケイ素１０００）の１５％（重量
／体積、ｗ／ｖ）スラリーを調整する。この調製の際には、オートクレーブを使
用して炭化ケイ素を滅菌し、続いて、市販の炭化ケイ素製剤を一切洗浄または精
製せずに計量する。次いで、この炭化ケイ素樹脂を懸濁用の液体に加える。この
液体は一般に蒸留水または７Ｍ塩酸グアニジン溶液である。大きなスケールの実
験では一般に、滅菌した炭化ケイ素１５グラムを溶液１００ｍｌに加えることに
よって１５％（ｗ／ｖ）炭化ケイ素懸濁液を調製し、小さなスケールの実験では
、炭化ケイ素１．５グラムを溶液１０ｍｌに加えることによって１５％炭化ケイ
素懸濁液を調製した。このように作成したスラリーは、精製プロトコルで使用す
る前によく混合し、使用しないときには室温で保管した。
【００２１】 実施例２ プラスミドＤＮＡ精製プロトコル 本発明に基づく精製方法を使用し、本明細書に記載のスラリーを結合剤として
使用してプラスミドＤＮＡを精製するのに使用することができるさまざまなプロ
トコルがある。これらのプロトコルは、ペレット化段階またはスピンカラムの使
用を含むことができる。本発明の好ましい実施形態の研究で使用した緩衝液の組
成は以下のとおりである。
【００２２】 １．細胞再懸濁用溶液： ５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５ １０ｍＭ ＥＤＴＡ １００μｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡ（リボヌクレアーゼＡ、ＤＮアーゼを含ま
ない） ２．溶菌用溶液： ０．２Ｍ ＮａＯＨ １％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム） ３．中和用溶液： ２Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ ４．８ ４．洗浄用溶液 ２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５ ５ｍＭ ＥＤＴＡ ５０％ＥｔＯＨ（エタノール） ５．ＴＥ緩衝液 １０ｍＭトリスＨＣｌ １ｍＭ ＥＤＴＡ
【００２３】 Ｅ．ｃｏｌｉのプラスミドＤＮＡを精製する最初の段階は、一般に１．０〜３
ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ培養菌から透明な溶菌液を作り出すことである。１４，００
０ｒｐｍ、１分間の遠心分離によって培養菌をペレット化し、次いで上澄みを除
去する。細胞再懸濁用溶液約２５０μｌをペレットに加え、次いで、激しく渦攪
拌することによって再懸濁させる。細胞を再懸濁させた後、溶菌用溶液２５０μ
ｌを懸濁液に加え、次いで、渦攪拌することなく穏やかに数回、倒置することに
よって混合する。次いで、得られた混合液を３７℃で最長５分間、溶液が透明に
なるまでインキュベートする。５分しないうちに溶液が透明になったら、中和用
溶液３５０μｌを加え、穏やかに数回、倒置することによって再び混合する。次
いで、得られた混合液を１４，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離して、ペレッ
ト状の白い沈降物を得る。溶菌液である上澄みを注意深く新しいエッペンドルフ
（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管に移す。先の記載のとおりに調製した炭化ケイ素１０
００スラリー２００μｌを管に加え、倒置または渦攪拌によって混合する。
【００２４】 ペレット化技法を使用してプラスミドＤＮＡを分離する場合には次いで、この
管を１４，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離する。次いで、炭化ケイ素ペレット
を乱さないように注意しながら、上澄みを吸引除去する。洗浄用溶液５００μｌ
をペレットに加え、よく渦攪拌する。得られた懸濁液を再び１４，０００ｒｐｍ
で１分間、遠心分離する。上澄みを完全に吸引除去する。次いで、新たな洗浄用
溶液５００μｌを使用してこの洗浄および遠心分離段階を繰り返す。再び上澄み
を完全に吸引除去する。ペレットが湿っているようであれば、エッペンドルフ管
を３７℃のオーブンの中、またはベンチトップの上に数分間、置くことによって
乾燥することができる。
【００２５】 次いで、６５〜７０℃に温めたＴＥ緩衝液または蒸留水１００μｌをエッペン
ドルフ管中の乾燥ペレットに加え、６５〜７０℃で１分間、インキュベートする
。次いで、このエッペンドルフ管を１４，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離する
。樹脂ペレットから溶離したＤＮＡを含む上澄みを注意深くピペットで新しいエ
ッペンドルフ管に移す。樹脂を最終製剤中にできるだけ移さないようにすること
が重要である。
【００２６】 スピンカラム技法を使用してプラスミドＤＮＡを分離する場合には、溶菌液と
炭化ケイ素スラリーをピペット操作によって混合し、予め新しいエッペンドルフ
管に入れておいたスピンカラムフィルターに移す。スピンカラムフィルターの孔
径は一般に、０．２２ミクロンから０．４５ミクロンの範囲でなければならない
が、炭化ケイ素１０００の平均粒径は４．５ミクロンなので、わずかならこの範
囲よりも大きくともよい。次いで、スピンカラムを入れたエッペンドルフ管を１
４，０００ｒｐｍで３０から６０秒、遠心分離する。フィルターを通過した液は
捨て、スピンカラムに洗浄用溶液５００μｌを加える。スピンカラムを再び、１
４，０００ｒｐｍで３０から６０秒、遠心分離する。再びフィルターを通過した
液は捨て、新たな洗浄用溶液５００μｌを加える。スピンカラムを１４，０００
ｒｐｍで１〜２分、遠心分離して、洗浄液が全てスピンカラムから除去されるよ
うにする。フィルターを通過した液を捨て、次いで、スピンカラムを新しいエッ
ペンドルフ管の中に入れる。６５〜７０℃に温めたＴＥ緩衝液または蒸留水１０
０μｌをスピンカラムに加え、１分間、インキュベートする。スピンカラムを１
４，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離する。ＴＥ緩衝液によってＤＮＡは溶離し
、そのため遠心分離すると、溶離したＤＮＡがフィルターを通して洗浄されてエ
ッペンドルフ管に入り、使用可能となる。
【００２７】 実施例３ ＤＮＡ結合物質として使用する前に炭化ケイ素１０００を洗浄する効果 好ましい実施形態を決定するため、１５％（ｗ／ｖ）スラリーを作成する前に
炭化ケイ素樹脂を洗浄する効果を、ペレット形態に精製したＤＮＡの可消化性（
ｄｉｇｅｓｔａｂｉｌｉｔｙ）に対して調べた。炭化ケイ素１０００を、以下の
プロトコルに概説するような方法で、室温のｌＭ塩酸グアニジン、室温の蒸留水
または８０℃の蒸留水で０、１、２または３回、洗浄した。
【００２８】 １．炭化ケイ素１０００樹脂１．５グラムを１５ｍｌ試験管に入れる。 ２．望ましい溶液（蒸留水または１Ｍ塩酸グアニジン）１０ｍｌに炭化ケイ素
樹脂を懸濁させ、渦攪拌する。 ３．アリコートミキサーに５分間かける。 ４．３７００ｒｐｍで５分間、遠心分離して、樹脂をペレット状に圧密する。 ５．上澄み液を捨て、段階２からを繰り返して反復洗浄する。 ６．所望の回数だけ洗浄した後、オートクレーブ処理した蒸留水１０ｍｌに炭
化ケイ素樹脂を再懸濁させる。 ７．先に概説したプロトコルを使用してプラスミドＤＮＡを分離する。
【００２９】 実施例２で概説したプロトコルを使用して１２サンプルのｐＵＣ１９ＤＮＡを
精製した。ＤＮＡの結合に使用した炭化ケイ素樹脂は、使用前に処理した洗浄回
数の異なるものを使用した。１２の異なる洗浄によって調製した樹脂を使用して
精製したＤＮＡは、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩでの消化を証明した（図１）。
【００３０】 実施例４ 精製プロトコルのスケールアップ より多くの量のプラスミドＤＮＡに適合するように本発明に開示の分離方法を
スケールアップすることができる。下記のプロトコル例では、プラスミドｐＵＣ
１９（２６８６ｂｐ）およびｐＣＭＶｂｅｔａ（７１６４ｂｐ）を使用した。使
用した炭化ケイ素スラリーは、蒸留水または７Ｍ塩酸グアニジン５０ｍｌに炭化
ケイ素１０００ ７．５グラムを懸濁させたものである。このプロトコルは、先
に説明した小スケールプロトコルで概説した段階と同じ段階に従ったが、構成要
素の量は表Ａに示したものを使用した。
【００３１】
【表１】
【００３２】 表Ａに例示したプロトコルなどのスケールアッププロトコルを使用して精製し
たＤＮＡの品質は、先に記載した小スケール調製に匹敵することが分かった。し
かし、スケールアップ目的に対して最適な単純な構成要素比は見つからなかった
。そのため、大スケール調製の最適化は使用する培養菌量に依存する。
【００３３】 実施例５ アガロースゲル薄片からのＤＮＡの分離 この実施例では、炭化ケイ素１０００に結合させることによる、アガロースゲ
ルからのＤＮＡフラグメントの分離を例示する。この実施例で使用した炭化ケイ
素スラリーは、炭化ケイ素１０００ ７．５グラムを７Ｍ塩酸グアニジン５０ｍ
ｌに懸濁させたものである。２サンプルのプラスミドｐＣＭＶｂｅｔａ（７１６
４ｂｐ）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、アガロースゲル（アガロー
スゲルを１％（ｗ／ｖ）含むＴＡＥ緩衝液）に載せた。電気泳動の後、ゲルをＳ
ＹＢＲ Ｇｏｌｄで染色し、撮影した（図２。左側の写真）。ｐＣＭＶｂｅｔａ
の７１６４ｂｐバンドをカミソリを使用してゲルからできるだけ正確に切り取り
、このアガロース薄片からＤＮＡを、実施例２を修正した以下の方法を使用して
分離した。
【００３４】 １．切り取ったバンドを新しいエッペンドルフ管に入れた。 ２．ゲル薄片に、７Ｍ塩酸グアニジン溶液４００μｌ（無樹脂）を加えた。 ３．完全に溶けるまでアガロース薄片を６５℃で熱した。 ４．炭化ケイ素１０００スラリー（先に記載した実施例１で調製したもの）５
０μｌを溶けたアガロースに加えた。 ５．管をよく渦攪拌して混合し、室温で５分間、インキュベートした。 ６．次いでこの混合液を、１４，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離した。 ７．上澄みを注意深く吸引除去した。 ８．洗浄用溶液５００μｌを加え、管をよく渦攪拌した。 ９．管を、１４，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離した。 １０．洗浄液を注意深く吸引除去した。 １１．洗浄段階を繰り返し、前と同様に吸引除去した。 １２．樹脂を数分間、放置して乾燥させた。 １３．６５℃に温めたＴＥ緩衝液５０μｌを加えることによってＤＮＡフラグ
メントを樹脂から溶離させた。 １４．管を、１４，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離した。 １５．溶離したＤＮＡをピペットで樹脂から分離し、アガロースゲル上で泳動
させた（図２。右側の写真）。
【００３５】 実施例６ ＰＣＲによって増幅させたＤＮＡの精製 この実施例では、ＰＣＲによって増幅させたＤＮＡの精製での炭化ケイ素１０
００スラリー（実施例１で調製したもの）の使用を例示する。この精製プロトコ
ルは、ＰＣＲ管内でＰＣＲ反応を完了させることから始まる。鉱油を使用して反
応体にふたをする場合には、水相（下層）を新しいエッペンドルフ管に注意深く
取り出されなければならない。この水相に対して、以下のプロトコルを使用した
本発明の方法を適用した。
【００３６】 １．７Ｍ塩酸グアニジン溶液を加えて、管内の体積を約１００μｌにする。 ２．炭化ケイ素１０００スラリー（実施例１で調製したもの）５０μｌを加え
、渦攪拌して混合する。 ３．室温で５分間、インキュベートする。 ４．１４，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離する。 ５．上澄みを注意深く吸引除去する。 ６．洗浄用溶液５００μｌを用いて洗浄し、渦攪拌して混合する。 ７．１４，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離する。 ８．洗浄液を注意深く吸引除去し、この洗浄段階を繰り返す。 ９．ペレットを数分間、乾燥させる。 １０．６５℃に温めたＴＥ緩衝液を用いてＰＣＲ生成物を溶離させる。 １１．１４，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離し、溶離したＰＣＲ生成物をピ
ペットで新しいエッペンドルフ管に注意深く移す。
【００３７】 ＰＣＲを実施し、生成物のサンプルをアガロースゲル電気泳動によって分析し
た（図３。左側の写真）。残った反応体に上記のプロトコルを適用し、続いて、
分離されたＰＣＲ生成物をアガロースゲル上で電気泳動して、回収を観察した（
図３。右側の写真）。その結果によれば、最初の試験ゲル上で観察されたＰＣＲ
生成物が、炭化ケイ素１０００法によって分離されていることが観察された。こ
れらの結果は、増幅プライマー、プライマー二量体および酵素からのＰＣＲ生成
物の分離におけるこのプロトコルの有用性を証明している。
【００３８】 実施例７ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αからのゲノムＤＮＡの分離 この実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αのゲノムＤＮＡの結合および分離に
おける本発明の使用を例示する。
【００３９】 １．Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αの一夜培養菌１．５ｍｌを１０，０００ｒｐｍ、
２分間の遠心処理でペレット化した。 ２．このペレットをＴＥ緩衝液５５０μｌに再懸濁させた。 ３．１０％ＳＤＳ３０μｌおよび２０ｍｇ／ｍｌプロナーゼ３０μｌを加えた ４．管を倒置によって穏やかに混合し、３７℃で１時間、インキュベートした
。 ５．５ＭＮａＣｌ溶液１００μｌを加え、数秒間、混合した。 ６．同量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：
１）を加え、穏やかに混合した。 ７．管を、１１，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。 ８．上部の相を採集し、同量のフェノール：クロロホルム（１：１）をそれぞ
れの管に加え、穏やかに混合した。 ９．管を、１１，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、上部の相を新しいエッ
ペンドルフ管に集めた。 １０．炭化ケイ素１０００スラリー２００μｌをそれぞれの管に加え、よく混
合した。 １１．管を、１４，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離した。 １２．それぞれの樹脂ペレットから上澄みを吸引除去した。 １３．洗浄用溶液５００μｌをそれぞれの管に加え、よく渦攪拌して混合した
。 １４．管を、１４，０００ｒｐｍで１分間、遠心分離した。 １５．洗浄液を吸引除去し、洗浄をもう一度繰り返した。 １６．樹脂ペレットを３７℃で５分間、乾燥させた。 １７．６５℃に温めたＴＥ緩衝液を加えて２００μｌとし、ゲノムＤＮＡを溶
離させた。
【００４０】 上記の方法で、４サンプルのＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αゲノムＤＮＡを分離し、
アガロースゲル上で泳動させた（図４。レーン１〜４）。さらに、本発明の炭化
ケイ素法ではなしにイソプロパノール沈殿法を使用して、２サンプルのＥ．ｃｏ
ｌｉ ＤＨ５αゲノムＤＮＡを分離した。これらの２つのサンプルを図４のレー
ン５および６に示す。これらの結果は、炭化ケイ素を使用してゲノムＤＮＡを分
離できること、および本発明の方法を使用して分離されたゲノムＤＮＡは従来の
ゲノム分離法を使用したＤＮＡよりもタンパク質混入の程度が低くなる可能性が
ある（ウェル１〜４に比べてウェル５および６のタンパク質の量が多いことに留
意されたい）ことを指示している。
【００４１】 実施例８ 炭化ケイ素１０００を使用したＲＮＡの分離 この実施例では、リボ核酸（ＲＮＡ）を結合させる炭化ケイ素１０００の能力
を例示する。炭化ケイ素１０００がＲＮＡを結合させることを証明するため、細
胞再懸濁用溶液に１００ｕｇ／ｍｌ ＲＮアーゼＡを含めずに、実施例２で概説
したプロトコルを実施した。こうすることによってＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αから
遊離したＲＮＡは分解せず、プラスミドＤＮＡと同じ方式で分離された。図５で
はこのＲＮＡをはっきりと見ることができる。
【００４２】 実施例９ プラスミドサイズの分離 この実施例では、炭化ケイ素１０００を使用してあるサイズ範囲のプラスミド
を分離することができることを例示する。Ｅ．ｃｏｌｉの一夜培養菌から３つの
プラスミド（表Ｂ）を分離した。
【００４３】
【表２】
【００４４】 これらの分離に続いて、制限酵素を用いてプラスミドを消化し、アガロースゲ
ル上で泳動させた（図６）。
【００４５】 実施例１０ 炭化ケイ素を使用したＤＮＡの分離は市販ＤＮＡ精製キットに匹敵する品質を
与える この実施例では、実施例２で説明したプロトコルを使用して精製したプラスミ
ドＤＮＡの品質が市販の３つのプラスミド精製キットを使用して分離したプラス
ミドに匹敵することを簡潔に例示する。これらの実験に使用したプラスミドはｐ
ＣＭＶｂｅｔａ（７１６４ｂｐ）である。分離手順に続き、それぞれのプラスミ
ド製剤を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化し、消化していないサンプルとと
もにアガロースゲル上で泳動させた（図７）。炭化ケイ素１０００を使用して分
離したプラスミドＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩでの完全な消化を示し、比較のために
使用した３つの市販キットを使用して分離したプラスミドに匹敵するように見受
けられた。
【００４６】 実施例１１ 炭化ケイ素で精製したプラスミドＤＮＡを用いたＥ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換 この実施例では、実施例２で紹介した方法を使用して精製したＤＮＡを用いた
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の形質転換を例示する。この形質転換法には２つのプラスミド
、ｐＵＣ１９およびｐＣＭＶｂｅｔａを使用した。結果の詳細を表Ｃに示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】 炭化ケイ素１０００を使用して精製したプラスミドＤＮＡが、以前にはアンピ
シリン抵抗性の遺伝子型を欠いていたＥ．ｃｏｌｉ細胞にアンピシリン抵抗性を
授けることができることが分かった。
【００４９】 本発明の特定の実施形態だけを説明してきたが、これらにさまざまな追加およ
び修正を実施できること、およびさまざまな代替形態を選択できることは明らか
である。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲に含まれるこ
のような追加、修正および代替形態の全てをカバーする。
【００５０】 以上に説明した本発明の好ましい精製法では１０００グレードのＳｉＣを使用
したが、他の粒径のものも使用することができる。６００から１０００グレード
のものが好ましい。粒径の小さなＳｉＣ粒子ほど核酸を結合する表面が全体とし
て大きいことは容易に理解できる。しかし、粒径が極めて小さいとＳｉＣの圧密
が過剰となり、サンプルまたは洗浄および溶離媒質との混合が不十分となる。
【００５１】 本発明は、ヌクレオチドポリマーが１本鎖であるか、または２本鎖であるかに
関わらず、ＤＮＡなどの広範囲にわたるサイズのヌクレオチドポリマーの分離に
有用である。本発明は、ＲＮＡの分離にも、ＤＮＡの分離にも使用することがで
きる。この単純な方法は以下の基本段階を含む。
【００５２】 １．サンプル中のヌクレオチドポリマーを炭化ケイ素中に固定化する段階 ２．炭化ケイ素を、固定化されたヌクレオチドポリマーと一緒にサンプルから
分離する段階 ３．炭化ケイ素に結合したヌクレオチドポリマーをエタノールを含む緩衝液で
洗浄する段階 ４．エタノールを含む緩衝液を除去する段階 ５．より低塩の緩衝液または水の中でヌクレオチドポリマーを溶離させる段階
【図面の簡単な説明】
【図１】 炭化ケイ素を予洗する効果を例示するアガロースゲルを示す図である。
【図２】 ＤＮＡフラグメントのアガロースゲル薄片からの分離に本発明を使用した結果
を示す図である。
【図３】 本発明を使用したＰＣＲ生成物の回収を示すアガロースゲルの写真である。
【図４】 炭化ケイ素を使用したＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αゲノムＤＮＡ分離の改善を示す
アガロースゲル写真である。
【図５】 本発明の方法を使用したＲＮＡの分離を指示するアガロースゲルを示す図であ
る。
【図６】 本発明を使用して分離されたさまざまなサイズのプラスミドを示すアガロース
ゲルである。
【図７】 本発明の実施形態を使用して分離したＤＮＡの品質を比較したアガロースゲル
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヌクレオチドポリマーの結合に対する炭化ケイ素の使用。
  2. 【請求項２】 ヌクレオチドポリマーが、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＤＮ
    Ａポリヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡポリヌクレオチド
    から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の炭化ケイ素
    の使用。
  3. 【請求項３】 ヌクレオチドポリマーが１本鎖であることを特徴とする請求
    項１または２に記載の炭化ケイ素の使用。
  4. 【請求項４】 ヌクレオチドポリマーが２本鎖であることを特徴とする請求
    項１または２に記載の炭化ケイ素の使用。
  5. 【請求項５】 ヌクレオチドポリマーが線状ポリマーであることを特徴とす
    る請求項１から４のいずれか一項に記載の炭化ケイ素の使用。
  6. 【請求項６】 ヌクレオチドポリマーが環状ポリマーであることを特徴とす
    る請求項１から４のいずれか一項に記載の炭化ケイ素の使用。
  7. 【請求項７】 炭化ケイ素の平均粒径が４．５ミクロンであることを特徴と
    する請求項１から６のいずれか一項に記載の炭化ケイ素の使用。
  8. 【請求項８】 炭化ケイ素の平均粒径が３ミクロンであることを特徴とする
    請求項１から６のいずれか一項に記載の炭化ケイ素の使用。
  9. 【請求項９】 炭化ケイ素の平均粒径が６．５ミクロンであることを特徴と
    する請求項１から６のいずれか一項に記載の炭化ケイ素の使用。
  10. 【請求項１０】 サンプルからヌクレオチドポリマーを分離する方法であっ
    て、 サンプルに炭化ケイ素を加え、混合して、ヌクレオチドポリマーを炭化ケイ素
    に結合させる段階と、 得られた混合物から、結合したヌクレオチドポリマーと一緒に炭化ケイ素を分
    離する段階と、 炭化ケイ素からヌクレオチドポリマーを溶離させる段階 を含むことを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】 混合物から炭化ケイ素を分離するのにスピンカラムフィル
    ターを使用することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 スピンカラムフィルターの孔径が０．２２ミクロンから０
    ．４５ミクロンであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 混合物から炭化ケイ素を分離するのに遠心分離を使用する
    ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 アガロースゲルからヌクレオチドポリマーを分離する方法
    であって、 ヌクレオチドポリマーを含むバンドを溶液中でアガロースゲルから切り取る段
    階と、 切り取ったバンドを溶液に入れる段階と、 溶液を熱して、切り取ったアガロースバンドを溶かす段階と、 溶液に炭化ケイ素を加え、混合して、炭化ケイ素にヌクレオチドポリマーを結
    合させる段階と、 炭化ケイ素および結合したヌクレオチドポリマーを混合物から分離する段階と
    、 炭化ケイ素からヌクレオチドポリマーを溶離させる段階 を含むことを特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】 切り取ったバンドを含む溶液を６５℃まで熱することを特
    徴とする請求項１４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 アガロースゲルから切り取ったＤＮＡを含むバンドを塩酸
    グアニジン溶液の中に入れることを特徴とする請求項１３または１４に記載の方
    法。
  17. 【請求項１７】 水、低塩緩衝液およびＴＥ緩衝液のうちの１つを用いてヌ
    クレオチドポリマーを溶離させることを特徴とする請求項１０から１６のいずれ
    か一項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 結合したヌクレオチドポリマーを溶離させる前に炭化ケイ
    素を数回、洗浄することを特徴とする請求項１０から１７のいずれか一項に記載
    の方法。
  19. 【請求項１９】 炭化ケイ素をスラリーとしてサンプルに加えることを特徴
    とする請求項１０に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 炭化ケイ素スラリーが、水または塩酸グアニジンに炭化ケ
    イ素を１５％ｗ／ｖ混合した混合物であることを特徴とする請求項１９に記載の
    方法。
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