JP2011505139A - 単一試料からのゲノムdna、rnaおよびタンパク質の単離方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、ゲノムDNA、RNAおよびタンパク質より選択される少なくとも二つの細胞性成分の分離および/または精製のためのシステム、方法およびキットを提供する。該方法は、最初に、生物学的試料を溶解させて、該細胞性成分を含有する水溶液を生成し;次に、該水溶液を、ゲノムDNAが結合する条件下において第一鉱物支持体に加え;そして未結合の全RNAおよびタンパク質を含有するフロースルーを集めることを包含する。該方法は、更に、該フロースルーを、RNAが結合する条件下において第二鉱物支持体に加え、そしてタンパク質を含有するフロースルーを集めることを包含する。結合したゲノムDNAおよび全RNAは、溶離することができるし、フロースルー中のタンパク質は、更に精製することができる。更に、単離された全RNAは、マイクロRNAなどの低分子RNAを単離するのに用いうると考えられる。
【選択図】図1
Description
本出願は、2007年11月30日出願の米国予備特許出願第60/991,337号および2008年9月17日出願の同第61/097,604号に優先権を主張し;それらの開示は、本明細書中にそのまま援用される。
特定の用途において、ゲノムDNAおよびRNA双方を、同じ鉱物カラムに一緒に結合させることは好都合であろうと考えられる。これは、第一カラムの充填前の、双極性非プロトン性溶媒などの有機溶媒の添加によって達成することができる。DNAおよびRNAの分離は、溶離条件を制御することによるなどの慣用的な技法によって実現することができる。或いは、一方の核酸を、酵素反応によって除去することができる。
溶液およびプロトコル
1.実施例に用いられる溶液およびカラム
2.1 細胞破壊および均一化:
a.1x106個の培養細胞を、1.5mlミクロ遠心分離管中において8000xgで1分間の遠心分離によってペレットにする。
c.350μlの溶解緩衝液(β−ME含有)を加える。
d.細胞ペレットを旋回させて再懸濁させる。
f.工程3へ進める。
a.10mgの組織を、適当なサイズの試験管に入れる。
c.POLYTRONTMの使用者手引書にしたがって組織を均一化する。
d.調製されたホモジネートを目視検査し、そして完全な均一化を確かめる。
2.3 乳鉢および乳棒を用いた組織破壊後、針およびシリンジを用いた均一化:
a.秤量済み組織を直ちに液体窒素中に入れ、そして乳鉢および乳棒で完全に粉砕する。
c.液体窒素を蒸発させるが、組織を融解させない。
3.gDNA精製
3.1 gDNA結合
a.新しいスピンカラムを新しい採集管中に入れる。
c.11000xgで1分間遠心分離する。
d.そのフロースルーを、RNAおよびタンパク質の精製用に蓄える。
3.2 カラム洗浄
a.500μlの溶解緩衝液をカラムに加える。
c.カラムを同じ採集管中に戻し入れる。
d.500μlの洗浄緩衝液をカラムに加える。
f.カラムを、DNアーゼ不含の1.5mlミクロ遠心分離管に移す。
3.3 gDNA溶離
a.100μlのgDNA溶離緩衝液を、カラムの中央に加える。
c.カラムを捨て、そして純粋なgDNAが入っている管を−20℃で貯蔵する。
4.全RNA精製
4.1 RNA結合
a.新しいスピンカラムを新しい採集管中に入れる。
c.11000xgで1分間遠心分離する。
e.カラムを、新しい2ml採集管に移す。
4.2 カラム洗浄
a.500μlの洗浄緩衝液をカラムに加える。
c.カラムを、RNアーゼ不含の1.5mlミクロ遠心分離管に移す。
4.3 RNA溶離
a.100μlの溶離緩衝液を、カラムの中央に加える。
c.カラムを捨て、そして純粋なRNAが入っている管を−80℃で、必要とされるまで貯蔵する。
注記:全ての工程を、特に断らない限り、氷上で行うべきである。
5.1 タンパク質精製
a.工程4.1によるフロースルーを、タンパク質沈殿のための出発点として用いる。十分に混合し、そして100μlのフロースルーを、新しい1.5mlミクロ遠心分離管に移す。
c.300μlの共沈殿剤を混合物に加える。短時間混合する。
e.上澄みを、ピペットで取るまたは傾瀉することによってできるだけ完全に除去する。
g.管を、最大速度で5分間遠心分離する。上澄みを注意深く取り出し且つ捨てる。
a.25μlの脱イオン水をペレットにピペットで加える。管を5分間旋回させる。
b.1mlの予備冷却された洗浄緩衝液および5μlの洗浄添加剤を、各々の管に加える。激しく旋回させる。(注記:ペレットは、洗浄緩衝液中に溶解しないであろう。)
c.管を、−20℃で30分間インキュベートし、10分毎に20〜30秒1回旋回させる。
e.上澄みを注意深く取り出し且つ捨てる。白色ペレットは、この工程で目に見えるはずである。
5.3 タンパク質ペレット再懸濁
a.100μlまでの5%SDSまたは7M尿素を加え、そして激しく混合して、タンパク質ペレットを溶解させる。ピペットの先端を用いてペレットを分散させる。
c.11000xgで1分間遠心分離して、残留する不溶性材料を全てペレットにする。上澄みを、下流の用途、すなわち、SDS−PAGEおよびウェスタンブロッティングに用いる。試料は、−20℃で数ヶ月間または4℃で数日間貯蔵することができる。
6.1 タンパク質沈殿
a.工程4.1.dによるフロースルーを、タンパク質沈殿のための出発点として用いる。
c.激しく混合し、そして室温で10分間インキュベートして、タンパク質を沈殿させる。
e.上澄みをピペットで取るまたは傾瀉することによって注意深く除去する。
6.2 タンパク質ペレット洗浄
a.500μlの50%エタノールをタンパク質ペレットに加える。
c.上澄みを、ピペットを用いることによってまたはできるだけの液体を傾瀉することによって除去する。
6.3 タンパク質ペレット再懸濁
a.SDS−PAGE前のタンパク質定量化のために、最低100μlの5%SDS(または7M尿素)を加え、そして激しく混合して、タンパク質ペレットを溶解させる。ピペットの先端を用いてペレットを分散させる。
c.95℃で5分間インキュベートして、タンパク質を完全に溶解させ且つ変性させる。激しく旋回させる。
e.16000xgで1分間遠心分離する。
f.上澄みを、新しい1.5mlミクロ遠心分離管に移す。
h.試料を、−20℃で数ヶ月間または4℃で数日間貯蔵する。
実施例1:作業の流れの最適化
最適の作業の流れを見出そうとして、本発明者は、HeLa細胞培養物からのゲノムDNA、全RNAおよび全タンパク質の抽出および精製についていろいろな溶液および添加剤を調べた。
培養細胞を、作業の流れの性能について更に調べた。本発明者は、更に、作業の流れを、市販製品、すなわち、AllPrep キット(Qiagen Inc., Valencia, CA)およびNUCLEOSPINTMRNA/Protein キット(DNA溶離緩衝液セット付加、MACHEREY−NAGELGmbH & Co. KG. Germany)と比較して調べた。多重試料を処理して、プロトコルの一貫性を評価した。製品の純度は、UV分光光度法でおよびゲル分析で評価した。得られた試料は、更に、リアルタイムPCR、RT−PCRおよびウェスタンブロッティング実験などの下流の用途において評価した。本発明者の結果は、上記のプロトコルが、培養細胞について一貫して且つ十分に作用するということを示している。
ゲノムDNA鋳型を、水中20ng/μlに希釈する。
実施例3:組織試料からのゲノムDNA、RNAおよびタンパク質の単離
本発明者は、作業の流れの性能について、ラット肝、脾臓および肺を含めたいろいろな組織源を調べた。本発明者は、更に、作業の流れを、市販製品、すなわち、AllPrep キットおよびNUCLEOSPINTMRNA/Protein キット(DNA溶離緩衝液セット付加)と比較して調べた。多重試料を処理して、プロトコルの一貫性を評価した。製品の純度は、UV分光光度法でおよびゲル分析で測定した。得られたゲノムDNAは、更に、リアルタイムPCR、RT−PCRおよびウェスタンブロッティング実験などの下流の用途において評価した。本発明者の結果は、上記のプロトコルが、組織試料について一貫して且つ十分に作用するということを示している。
精製されたゲノムDNA、RNAおよびタンパク質の分析は、作業の流れが、組織試料について十分に作用するということを明らかに示している。
実施例2および実施例3で詳しく説明されたように、2%TWEENTM20を含む本発明者の標準溶解緩衝液は、十分に作用する。しかしながら、本発明者は、増加量の非イオン性洗剤が、第一の場合のシリカメンブランへのゲノムDNAの結合を改善し、それによって、ゲノムDNAおよび全RNA双方の回収率を増加させるということを発見した。したがって、実施例1を、溶解緩衝液中の5%TWEENTM20で行った。増加した洗剤レベルでの追加の利点は、少なくとも一部分は、第一の場合のシリカメンブランへのゲノムDNAの改善された結合ゆえの、単離された全RNA中のゲノムDNA交差混入の減少である。
単離された全RNA中において、本発明者は、高濃度の低分子RNA分子を認めた(図14および図15を参照されたい)。ここで、本発明者は、上のプロトコルより精製された全RNA試料からの低分子RNA(200nt未満長さ)の豊富化および単離を示すデータを示し、そしてその単離された低分子RNAを、市販のマイクロRNA単離キットを用いて単離されたものと比較する。
Claims (19)
- ゲノムDNA、全RNAおよびタンパク質より選択される少なくとも二つの細胞性成分の分離および/または精製方法であって、
(a)生物学的試料を溶解溶液で溶解することによって、該細胞性成分を含有する水溶液を生成し;
(b)該水溶液を、ゲノムDNAが第一鉱物支持体に結合するような条件下において第一鉱物支持体に加え;
(c)未結合RNAおよびタンパク質を含有するフロースルーを集め;
(d)工程(c)からの該フロースルーを、双極性非プロトン性溶媒と混合して混合物を形成させた後、該混合物を、RNAが第二鉱物支持体に結合するような条件下において第二鉱物支持体に加え;
(e)タンパク質を含有するフロースルーを集めること
を含む方法。 - 前記第一鉱物支持体を洗浄し、そして該第一鉱物支持体からゲノムDNAを溶離することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第二鉱物支持体を洗浄し、そして該第二鉱物支持体からRNAを溶離することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)のフロースルーからタンパク質を精製することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記タンパク質を、沈殿、ゲル濾過または疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって精製する、請求項4に記載の方法。
- 前記溶解溶液が、カオトロピック塩、非イオン性洗剤および還元剤を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記カオトロピック塩が、グアニジンHClである、請求項6に記載の方法。
- 前記非イオン性洗剤が、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル、(オクチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール、ソルビタリモノラウレート(Sorbitari Monolaurate)、T−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60およびポリソルベート80またはその組合せより選択される、請求項6に記載の方法。
- 前記非イオン性洗剤またはその組合せが、0.1〜10%の範囲内である、請求項8に記載の方法。
- 前記溶解溶液が、1〜10MグアニジンHCl、0.1〜10%TWEENTM20および0.1〜10%NP−40を包含する、請求項1に記載の方法。
- 第一鉱物支持体および第二鉱物支持体が、多孔質または非多孔質であり、そして金属酸化物または混合金属酸化物、シリカゲル、シリカメンブラン、ガラス粒子、粉末ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタンまたは二酸化ジルコニウムを含んで成る、請求項1に記載の方法。
- 第一鉱物支持体および第二鉱物支持体が各々、シリカメンブランである、請求項1に記載の方法。
- 前記双極性非プロトン性溶媒が、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン(THF)、メチルエチルケトン、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)およびジメチルスルホキシドより選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記生物学的試料が、培養細胞、微生物、植物、動物、または酵素反応による混合物より選択される、請求項1に記載の方法。
- マイクロRNAを単離する方法であって、請求項3に記載の方法により溶離された全RNAに、一つまたはそれを超える追加の分離工程を施して、マイクロRNAを精製することを含む方法。
- 単一生物学的試料からのゲノムDNA、全RNAおよびタンパク質の分離および/または精製のためのキットであって、
(a)生物学的試料を溶解するための溶解溶液;
(b)ゲノムDNAを結合するための第一鉱物支持体;
(c)RNAを結合するための第二鉱物支持体;
(d)第一鉱物支持体からゲノムDNAを溶離するための溶離溶液;
(e)第二鉱物支持体からRNAを溶離するための溶離溶液
を含み;場合により、該キットが、更に、
ゲノムDNAおよびRNAが、それぞれの鉱物支持体に結合後に、フロースルーからタンパク質を単離するための手段を包含するキット。 - 前記溶解溶液が、カオトロピック塩、非イオン性洗剤および還元剤を包含する、請求項16に記載のキット。
- 第一鉱物支持体および第二鉱物支持体が各々、シリカメンブランである、請求項16に記載のキット。
- アセトン、テトラヒドロフラン(THF)、メチルエチルケトン、アセトニトリル、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)およびジメチルスルホキシドより選択される双極性非プロトン性溶媒を更に含む、請求項16に記載のキット。
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