CN111518161A - 一种柱式法从细胞中分离蛋白质的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种柱式法从细胞中分离蛋白质的方法，包括以下步骤：利用细胞裂解缓冲液对收集到的细胞进行裂解，使蛋白质、DNA、RNA、脂质和其他细胞组分溶于细胞裂解液中，得到粘性细胞裂解物，细胞裂解缓冲液包含表面活性剂和金属螯合剂；将粘性细胞裂解物转移至过滤装置内，再通过施加正向力或负向力，使粘性细胞裂解物通过滤装置，过滤装置内的多孔过滤介质会截留粘性细胞裂解物包含的基因组DNA和未裂解的细胞碎片，而蛋白质会穿过过滤装置后到达收集管，即为滤液；所述滤液即是从粘性细胞裂解物中分离的蛋白质提取物。本发明，能够提高蛋白质提取速度，增加蛋白质产量，提升实验体验度，以最小化提取时间最大化蛋白质产量。

Description

一种柱式法从细胞中分离蛋白质的方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种柱式法从细胞中分离蛋白质的方法。

背景技术

从总细胞裂解物中提取蛋白质是生物医学研究中最常用的方法之一。第一步是通过化学或物理方法从细胞释放蛋白质。含有变性表面活性剂(例如SDS)和非变性表面活性剂(例如NP-40和Tween-100)的细胞裂解液经常用于商业提取蛋白质的试剂盒中。尽管强力表面活性剂(例如SDS)可以有效裂解细胞，但由于细胞裂解物中存在释放的基因组DNA，会使得裂解液变得非常粘稠，很难移液并可能干扰随后的蛋白质定量。

从总细胞裂解物中分离蛋白质的最广泛实验室方法之一是使用含表面活性剂的溶液裂解细胞提取蛋白质，然后采用物理方法，例如反复超声处理或将细胞裂解物通过细的注射针头反复针刺以将DNA剪切成较小的片段来降低溶液的粘度，但是上述实验方法过程繁琐且耗费时间。反复超声处理还会产生大量热量，可能会使蛋白质失活。

有鉴于此，急需对现有的从细胞中分离蛋白质的方法进行改进，以便于提高蛋白质提取速度，提高蛋白质产量，提高实验体验度，最小化提取时间最大化了蛋白质产量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有的从细胞中分离蛋白质的方法，提取蛋白质的时间长，产量低，实验体验度差的问题。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是提供一种柱式法从细胞中分离蛋白质的方法，包括以下步骤：

使细胞与细胞裂解缓冲液接触，细胞发生裂解从而产生粘性细胞裂解物，其中所述细胞裂解缓冲液包含表面活性剂和金属螯合剂；

将所述粘性细胞裂解物转移至内含多孔过滤介质的过滤装置内，再通过施加正向力或负向力，使所述粘性细胞裂解物通过滤装置，过滤装置内的多孔过滤介质会截留粘性细胞裂解物包含的基因组DNA和未裂解的细胞碎片，而蛋白质会穿过所述过滤装置后到达收集管，即为滤液；

所述滤液，即是从所述粘性细胞裂解物中分离的蛋白质提取物。

其中，所述过滤装置中使用的多孔过滤介质，孔径为20～60um，厚度为0.5mm～20mm，设置在所述过滤装置的内腔的底部，用于截留所述粘性细胞裂解物中的基因组DNA和未裂解的细胞碎片。

上述方法中，所述细胞裂解缓冲液不含有离液剂。

上述方法中，所述细胞裂解缓冲液含有一种或一种以上的表面活性剂。

上述方法中，所述表面活性剂包括SDS、Triton X-100、NP-40、Tween-20和洋地黄皂苷中的一种或一种以上。

上述方法中，所述过滤介质由疏水性材料制成，或者由亲水性材料制成。

上述方法中，所述细胞裂解缓冲液被缓冲在pH7.0至pH12之间。

上述方法中，所述细胞是脊椎动物细胞或者原核细胞。

上述方法中，所述脊椎动物细胞可以是培养的细胞，也可以是存在于脊椎动物组织中的细胞。

上述方法中，细胞裂解液接触细胞体积至少20ul。

上述方法中，通过离心的方式施加所述正向力，离心时间30秒。

与现有技术相比，本发明，首先使细胞与细胞裂解液接触发生裂解，使蛋白质完全释放得到粘性细胞裂解物；然后将所述粘性细胞裂解物转移到过滤装置内中，再通过施加离心力或真空吸力，使蛋白质从所述粘性细胞裂解物中的基因组DNA和碎片中分离出来，并进行收集，提高了蛋白质的提取速度，提高了蛋白质产量，提高了实验体验度，以最小化提取时间最大化了蛋白质产量。

附图说明

图1为本发明中用于从细胞中分离蛋白质的过滤装置的结构示意图；

图2为本发明柱式法从细胞中分离蛋白质的方法的流程图；

图3为使用本发明中变性细胞裂解缓冲液从小鼠细胞中提取蛋白质与传统反复超声处理提取蛋白质跑SDS-PAGE胶染考马斯亮蓝图；

图4为本发明中使用天然细胞裂解缓冲液从293T细胞中提取蛋白质跑SDS-PAGE胶染考马斯亮蓝图；

图5为本发明中使用细胞质提取缓冲液和核提取缓冲液从293T细胞中提取蛋白质跑SDS-PAGE胶染考马斯亮蓝图；

图6为本发明中使用细菌细胞裂解缓冲液从大肠杆菌中提取的蛋白质跑SDS-PAGE胶染考马斯亮蓝图；

图7为本发明与传统超声处理提取蛋白质跑12％SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色结果。蛋白质在12％SDS-PAGE中分离转移到硝酸纤维素膜上，并用抗小鼠MDM2，HDAC1和ACTIN抗体检测。泳道1，通过反复超声处理制备的NIH3T3细胞裂解物；在泳道2和3中，使用本发明中的变性细胞裂解缓冲液分离的蛋白质；

图8为与图7对应的蛋白质WB结果图；

图9为使用市售试剂盒分离的蛋白质跑12％SDS-PAGE胶考马斯亮蓝染色图。第1、2和3道为市售试剂盒A；泳道4、5和6为试剂盒B。

具体实施方式

目前的分子生物学领域，核酸提取发生了很大的变革，摆脱了传统溶液法，而采用硅胶膜法，利用硅胶膜高盐结合低盐洗脱来分离核酸俗称柱膜法，还有后面出现的便于机械自动化核酸提取的磁珠法。但是蛋白质提取，近30年没有大的发展，大家依旧延用各种溶液法来分离蛋白质。蛋白质研究随着各种基因组测序的完成，大量有趣的基因被发现，基因发挥功能才是关键，后续就是功能研究，也就是功能的执行者蛋白质，这就是蛋白质研究目前火热的原因。蛋白质研究就不得不提取蛋白质，而且是高质量的蛋白，但是传统的溶液法抽提蛋白，需反复超声处理，过程繁琐且耗费时间，还可能会使蛋白质失活，急需对改革现有蛋白提取方法。

本发明提供了一种柱式法从细胞中分离蛋白质的方法，能够大大提高蛋白质提取速度，提高蛋白质产量，提高实验体验度，以最小化提取时间最大化蛋白质产量。

本发明提供的方法，能够从真核和原核细胞中快速提取蛋白质，其中，真核细胞包括脊椎动物细胞，例如鼠类细胞(小鼠和大鼠等)、人细胞和任何其他哺乳动物细胞，可以是培养细胞，可以是存在于脊椎动物组织的细胞。原核细胞包括单细胞细菌和古细菌等。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做出详细说明。

具体实施例1。

如图2所示，本发明提供的柱式法从细胞中分离蛋白质的方法包括以下步骤：

步骤S10，通过细胞裂解缓冲液裂解细胞，该过程中利用细胞与细胞裂解缓冲液的接触，使细胞完全裂解，蛋白质完全释放，蛋白质、DNA、RNA、脂质和其他细胞组分释放溶于总细胞裂解物形成的溶液中，从而得到粘性细胞裂解物。

步骤S20，使用例如移液装置，将所述粘性细胞裂解物转移至过滤装置内(内含多孔过滤介质)，再通过施加正向力(例如离心)或负向力(例如真空负压)，使所述粘性细胞裂解物通过滤装置，过滤装置内的多孔过滤介质会截留粘性细胞裂解物包含的基因组DNA和未裂解的细胞碎片，而蛋白质会穿过所述过滤装置后到达收集管，即为滤液；

其中，所述过滤装置中使用的多孔过滤介质，孔径为20～60um，厚度为0.5mm～20mm，设置在所述过滤装置的内腔的底部，用于截留所述粘性细胞裂解物中的基因组DNA和未裂解的细胞碎片。

步骤S30，在收集管中收集所述滤液，即是从所述粘性细胞裂解物中分离的蛋白质提取物。

本发明提供了目前可用于从原核和真核细胞总蛋白质提取的快速方法，使用本发明方法分离得到的蛋白质可以是天然状态或变性状态，其适合于蛋白质电泳、免疫印迹、ELISA、凝胶阻滞、免疫沉淀和其他测定的应用。蛋白质提取体积的动态范围为20-500μl，特别适用于蛋白质提取的细胞量是限制因素的样品。

本发明中，术语“蛋白质”广泛地是指通过肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的聚合物。术语“蛋白质”还包括分子，该分子包含一个以上通过二硫键、离子键或疏水性相互作用连接的蛋白质，或以多聚体(例如，二聚体、四聚体)共价或非共价结合在一起的蛋白质复合物。因此，术语“肽”、“寡肽”和“蛋白质”都包括在蛋白质的定义之内，并且这些术语可互换使用。

术语“和/或”是指所列要素中的一个或全部，或所列要素中的任何两个或多个的组合。

术语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的本发明的实施例。然而，在相同或其他情况下，其他实施例也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施例的叙述并不意味着其他实施例没有用，并且不旨在将其他实施例排除在本发明的范围之外。

术语“包括”及其变型，在说明书和权利要求书中出现这些术语时不具有限制意义。

除非另有说明，否则“一个”、“一种”、“该”和“至少一个”可互换使用，表示一个或多个。

同样在本文中，端点对数值范围的列举包括该范围内的所有数字(例如1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。

对于本文公开的包括离散步骤的任何方法，这些步骤可以以任何可行的顺序进行。并且，适当地，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。

为了对本发明的技术方案和实现方式做出更清楚地解释和说明，通过以下实施例说明本发明。应该理解的是，具体的例子，材料，数量和步骤将根据本文所述的本发明的范围和精神来广义地解释。以下所描述的具体实施例仅为本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，细胞裂解缓冲液被缓冲在7.0至12之间，包含有表面活性剂和金属螯合剂，但不包含离液剂，例如尿素、硫脲、高氯酸锂或盐酸胍化合物等(例如硫氰酸胍、异硫氰酸胍和氯化胍等)。

表面活性剂可以是SDS、Triton X-100、NP-40、Tween-20和洋地黄皂苷中的任意一种或多种。

本发明中的多孔过滤介质，可由疏水性材料制成，包括但不限于聚乙二醇、聚偏二氟乙烯等。尽管疏水性材料是本发明中多孔过滤介质优选的材料，但是，在一些实施方案中，也可以使用亲水性材料或具有疏水性涂层的亲水性材料。除了上述材料之外，还可以使用其他材料，例如陶瓷、橡胶和二氧化硅等。

多孔过滤介质的孔径为20～60μm，平均孔径为30μm，但是20、40、50和60μm的孔径不会不利地影响蛋白质的回收。多孔过滤介质的厚度为0.5mm～20mm，例如0.5、1、2、4、6、8、10、15、18和20mm，一个优选的实施方案是使用厚度为6mm的多孔过滤介质，其提供了基因组的截留作用和令人满意的提取蛋白质的体积。

与本发明的装置配合使用的用于提取蛋白质的溶液试剂，包括溶液A(变性细胞裂解缓冲液)、溶液B(天然细胞裂解液)、溶液C(细胞质提取缓冲液)、溶液D(细菌细胞裂解缓冲液)和溶液E。

溶液A用于从真核细胞和组织中提取变性的总蛋白。该溶液A中包含有一种或多种表面活性剂以及金属螯合剂，将溶液中的第一种表面活性剂称为第一表面活性剂。第一表面活性剂可以是阴离子表面活性剂，例如十二烷基硫磺酸钠(SDS)。SDS的浓度可以在0.01％(重量/体积)至5.0％(重量/体积)之间，包括例如0.01％，0.05％，0.1％，0.15％，0.2％，0.25％，0.3％，0.35％，0.4％，0.45％，0.5％，0.8％，1.0％和5.0％。

任选地，该溶液A在包含有第一表面活性剂的基础上，还包含第二表面活性剂，第二表面活性剂包括但不限于聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(以商品名TritonX-100出售)，辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(商品名NP-40)，聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯(商品名Tween-20)，或洋地黄皂苷。第二表面活性剂可有效防止SDS在4℃沉淀。第二表面活性剂的浓度可介于0.05％(体积/体积)至2.0％(体积/体积)之间，例如0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.0％和2.0％。

金属螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸盐(EDTA)，其浓度可以在0.1mM和10mM之间，例如0.1mM、2mM、5mM和10mM。

可以使用任何缓冲系统(例如磷酸盐缓冲盐水(PBS))在pH6.5至8.0之间(例如pH7.5)缓冲该溶液。PBS的一个实例是将0.2g KCl、0.2g KH₂PO₄、8g NaCl和2.16g的Na₂HPO₄·7H₂O溶解在1000ml水中制成。

溶液A中还可以添加其他组分，例如0.1-2.0％的脱氧胆酸钠，只要其他组分不会不利地影响缓冲液的功效。

溶液A的使用，与细胞沉淀混合即可，所述混合体积在10μl和30μl之间，例如20μl。

溶液B天然细胞裂解液，用于从真核细胞和组织中提取天然总蛋白，溶液B包含有一种或多种表面活性剂以及金属螯合剂和盐。

表面活性剂包括但不限于Triton X-100，浓度可以在0.05％(体积/体积)至2.0％(体积/体积)之间，包括例如0.05％，0.1％，0.2％，0.4％，0.8％，1.0％和2.0％。

金属螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸盐(EDTA)，其浓度可以在0.1mM和10mM之间，例如0.1mM、2mM、5mM和10mM。

盐包括但不限于氯化钠(NaCl)，并且可以在200mM和500mM之间，包括例如200、300、400和500mM。

同样可以使用任何缓冲系统进行缓冲，例如pH介于6.5和8.0之间(例如pH7.5)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

溶液B的使用，与细胞沉淀混合即可，所述沉淀的体积在10μl和30μl之间，例如20μl。

溶液C细胞质提取缓冲液，用于从真核细胞和组织中提取细胞质组分，它包含一种或多种表面活性剂以及金属螯合剂。表面活性剂可以是Nonidet P-40(NP-40)。表面活性剂的浓度可以在0.02％(体积/体积)和1.0％(体积/体积)之间，例如0.2％，0.4％，0.8％和1.0％。表面活性剂用于破坏细胞膜以释放细胞质蛋白而对核膜没有显著影响。根据所涉及的细胞类型，可以使用NP-40浓度范围为0.02-1.0％。

金属螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸盐(EDTA)，其浓度可以在0.1mM和10mM之间，例如0.1mM、2mM、5mM和10mM。

可以使用例如三-(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)缓冲液，缓冲液的浓度可以在1mM至100mM之间，例如1mM、2mM、5mM和10mM。

pH可以在6.0至9.0之间，例如8.0。

溶液C的使用，与细胞沉淀混合即可，所述沉淀的体积在10μl和30μl之间，例如20μl。

溶液D细菌细胞裂解缓冲液，包含有一种或多种表面活性剂以及氢氧化物和金属螯合剂，将溶液中的第一种表面活性剂称为第一表面活性剂。

第一表面活性剂选用的是SDS，其浓度可以在0.1％(重量/体积)至2.0％(重量/体积)之间，包括例如0.1％，0.2％，0.4％，0.6％，0.8％，1.0％和2.0％。

该溶液D中还包括第二表面活性剂，例如但不限于Triton X-100。第二种表面活性剂可帮助碱性裂解和随后的中和后的蛋白质聚集最小化。第二表面活性剂的浓度可以在0.05％(体积/体积)至2.0％(体积/体积)之间，包括例如0.05％，0.1％，0.2％，0.4％，0.8％，1.0％和2.0％。

氢氧化物(例如氢氧化钠或氢氧化钾)的浓度在0.05N至0.5N之间，例如0.05N、0.1N、0.2N和0.5N。

金属螯合剂包括但不限于EDTA，其浓度可以在1mM和20mM之间，例如0.1mM、2mM、5mM和10mM。

可以使用pH值在10.0和12.0之间的任何缓冲液缓冲溶液D，例如PBS、20mM Tris-HCl或20mM HEPES缓冲液。

溶液E包括适合于将溶液D中和至pH约8.0的化合物，例如可以使用浓度在0.5N至1.5N之间的盐酸盐(HCl)，例如0.5N，0.7N，0.9N，1.1N，1.3N或1.5N。在另一个实施方案中，使用浓度为0.8M至1.6M的2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)，例如0.8M，1.0M，1.2M，1.4M，或使用1.6。

可以根据溶液D中使用的NaOH浓度调节溶液E的浓度。

以下示例性地列举了本明的几个典型的具体应用实例。

具体应用实例1。

从哺乳动物细胞中提取变性总蛋白。

在蛋白质提取之前，首先将本发明中带有收集管的蛋白质提取过滤装置在冰上预冷。

再通过低速离心收集细胞，并用预冷PBS洗涤一次。

将细胞转移至1.5ml微量离心管后，3000rpm离心2-3分钟，完全吸出上清液，获得用于蛋白质提取的细胞。

将200ul的溶液A添加到20ul细胞沉淀中，并通过上下吹打几次将细胞重悬以裂解细胞，形成粘性细胞裂解物。

将粘性细胞裂解物转移至预冷的过滤装置内，再将收集管的盖子关上，然后在台式微量离心机中于4℃以12,000-16,000rpm离心30秒。

立即将收集管放在冰上，丢弃过滤装置，收集管内的非粘性蛋白提取物即为从哺乳动物细胞中分离提取到的细胞总蛋白，可用于下游应用。

该方案的蛋白质产量取决于细胞类型，约为2.0-2.8mg/ml。

图3展示了反复超声处理提取的蛋白质与使用结合有本发明的蛋白质提取的溶液A提取的蛋白质的比较结果。泳道1通过反复超声处理制备的蛋白质，泳道2和泳道3是利用溶液A和本发明方法提取的蛋白质。

具体应用实例2。

从哺乳动物细胞中提取天然总蛋白。

如实施例1所述方式制备用于蛋白质提取的细胞。

用PBS洗涤细胞沉淀物(收集细胞湿体积20μl至样品管)后，将200μl溶液B添加至细胞沉淀上并剧烈涡旋15秒。

将该样品管置于冰中一分钟，并将该过程重复四次。

将粘性细胞裂解液从样品管中转移至预冷的过滤装置中，再将收集管的盖子关闭，然后在台式微量离心机中于4℃以12,000-16,000rpm离心30秒。

立即将收集管置于冰上，并将过滤装置丢弃，收集管内得到的非粘性蛋白提取物即为从哺乳动物细胞中分离提取到的天然总蛋白。

根据使用的细胞类型，该方案的蛋白质产量约为2.0-2.8mg/ml。图4展示了采用本发明方法，利用溶液A和溶液B提取的蛋白质的比较。第1道，溶液A提取的293T细胞蛋白质。第2和第3道，溶液B提取的293T细胞蛋白质。

具体应用实例3。

从哺乳动物细胞中提取细胞质和核蛋白。

如实施例1所述制备用于蛋白质提取的细胞。

用PBS洗涤收集湿体积20μl的293T细胞后，将细胞重悬于200μl溶液C中，再将样品管剧烈涡旋15秒，之后在冰上孵育5分钟，最后再将样品管在4℃的微量离心机中以最高速度离心5分钟。

将上清液(细胞胞质组分)转移至新的预冷的1.5ml样品管中。将100ul缓冲液B加入沉淀中，剧烈涡旋15秒，然后冰上温育。

将15秒涡旋和1分钟孵育步骤重复4次，最终得到粘性细胞裂解物。

将粘性细胞裂解物立即转移到预冷的过滤装置内，并在4℃的微量离心机中以12,000至16,000rpm离心30秒。

立即将收集管(包含核提取物)放在冰上，弃去过滤装置，收集管内得到的非粘性蛋白提取物即为从哺乳动物细胞中分离提取到的细胞核蛋白。可以储存在-80℃下直到使用。

图5展示了用市售试剂盒(泳道1和2)与实施例3的方法(泳道3和4)提取细胞质和细胞核的比较结果。泳道1，细胞质组分(市售试剂盒)，泳道2，细胞核组分(市售试剂盒)。泳道3，细胞质组分(实例3的方法)，泳道4，细胞核组分(实例3的方法)。

具体应用实例4。

从细菌中提取变性总蛋白。

在蛋白质提取之前，将带有收集管的蛋白质提取过滤装置在冰上预冷。

台式微量离心机1-2分钟最高速度收集细菌培养物中的细菌。除去上清液，并将细菌沉淀在冷PBS中洗涤一次。

完全吸出上清液。将200ul溶液D添加至细胞沉淀，并通过上下吸移几次以使细菌溶解而使沉淀重悬。

将20ul溶液E加入到细胞沉淀中，并剧烈涡旋15秒。再将粘性裂解物转移至预冷的过滤装置中，将收集管的盖子关闭，并在台式微量离心机中于4℃以12,000-16,000rpm离心30秒。

立即将收集管放在冰上，丢弃过滤装置，收集管内得到的非粘性蛋白提取物即为从细菌中提取变性总蛋白，可用于下游应用。

蛋白质产量为约1.5-1.8mg/ml。图6展示了通过反复超声处理提取的细菌蛋白与本发明的细菌蛋白的比较。泳道1代表通过重复超声处理从大肠杆菌分离的总蛋白。泳道2和3代表用本发明从大肠杆菌中分离总蛋白的两个分开的实验。

具体应用实例5。

如图1所示，本发明还提供了一种从细胞中分离蛋白质的装置，包括用于过滤蛋白质的过滤器10和用于存储蛋白质的收集管20，过滤器10设置在收集管20内，过滤器10的内腔的底部设有多孔过滤介质13。

上述方案中，过滤器10的顶部设有入口11，底部设有出口12，内部中空形成腔室，腔室底部的出口12处设有过滤介质13。

优选的，过滤介质13厚度为0.5-20mm，优先采用厚度为6mm的具有疏水性或亲水性的材料，过滤介质13上设有多个过滤孔，过滤孔呈无方向性的细丝状或不规则颗粒状的网络组成，过滤孔的直径小于基因组DNA的尺寸，大致为10～60μm，优选为30μm，但其他孔径例如10、20、40、60μm的孔径也不会影响蛋白质的回收，使蛋白质过滤出去同时截取保留基因组DNA和碎片。

上述方案中，收集管20的上部呈圆柱体，下部呈椎体，圆柱体的顶部设有开口22，开口22处一端铰接盖帽21。过滤器10置于收集管20内，过滤器10的底部与收集管20的底部之间设有间隔，方便蛋白质穿过过滤介质13从过滤器10的底部的出口12进入收集管20中。

本发明的使用方法如下：

利用细胞裂解缓冲液对收集到的细胞进行裂解，获得粘性细胞裂解物；

通过移液装置将粘性细胞裂解物转移到过滤器的过滤器10中，对过滤器10施加离心力或真空吸力，提取出蛋白质，并将基因组DNA和碎片分离出去；粘性细胞裂解物穿过过滤器10内部的过滤介质13过滤，通过过滤器10底部的出口12进入收集管20内，粘性细胞裂解物中存在的蛋白质穿过过滤介质13沉淀于收集管20的底部；基因组DNA和碎片被过滤介质13截留在过滤器10中，完成分离。

本发明方法与采用现有市售分离试剂盒方法比较：

市场上有几种分离试剂盒，用于提取蛋白质，然后提取核酸，其外观可能与本文介绍的方法相似；但是，仔细研究市售的过滤装置会发现明显的差异。根据制造商的说法，分离试剂盒采用离心柱，可以从单个样品中顺序提取DNA、RNA和蛋白质。市售试剂盒使用核酸结合树脂或基于膜的试剂盒，用细胞裂解缓冲液裂解样品，将细胞裂解液转移到过滤装置中，然后离心。DNA和RNA结合在基质上，流过的物质含有蛋白质。离心后，依次用洗涤缓冲液洗涤过滤装置，并用洗脱缓冲液从过滤装置中洗脱DNA/RNA。为了使核酸酶(DNA酶或RNA酶)失活，细胞裂解缓冲液包含高浓度的离液剂，如硫氰酸胍和/或异氰酸胍以及核酸结合到基质上的其他盐。这些离液剂是强变性剂，可能导致蛋白质降解。为了使RNA与基质结合，必须将酒精加入细胞裂解缓冲液中，这可能会使细胞裂解物中的某些蛋白质沉淀出来。由于裂解缓冲液中存在强变性剂，因此使用市售试剂盒提取天然蛋白质会更加困难，而且通常是不可能的。市售试剂盒中的缓冲液系统与从细菌样品中提取蛋白质不兼容。因此，收集液中的蛋白质浓度非常低(100-200μg/ml)。实际上，由于市售试剂盒的细胞裂解缓冲液中存在高盐和离液剂，因此制造商通常建议使用前将得到的蛋白质沉淀/浓缩。

本发明与现有与市售试剂盒之间的主要差异在于以下几个方面：

	本发明	市售试剂盒
			过滤介质材料	厚孔过滤介质	薄膜/树脂
作用机理	保留/剪切DNA	结合的DNA/RNA
			裂解缓冲液	蛋白质友好	离液剂
提取蛋白浓度	2-4mg/ml	100-200ug/ml
			提取细菌蛋白	可以	不能
SDS-PAGE蛋白条带	条带正常	条带不正常

使用本发明方法和市售试剂盒提取的哺乳动物细胞的蛋白条带比较(图7与图9)可以看到使用市售试剂盒会导致部分蛋白质变化和蛋白质条带的改变。市售试剂盒不使用过滤装置从总细胞裂解物中分离蛋白质，并且它们不能提供本发明提供的期望的回收率、以及速度和分离的便捷。

本发明并不局限于上述最佳实施方式，任何人应该得知在本发明的启示下做出的结构变化，凡是与本发明具有相同或相近的技术方案，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种柱式法从细胞中分离蛋白质的方法，其特征在于，包括：

使细胞与细胞裂解缓冲液接触，细胞发生裂解从而产生粘性细胞裂解物，其中所述细胞裂解缓冲液包含表面活性剂和金属螯合剂；

将所述粘性细胞裂解物转移至内含多孔过滤介质的过滤装置内，再通过施加正向力或负向力，使所述粘性细胞裂解物通过滤装置，过滤装置内的多孔过滤介质会截留粘性细胞裂解物包含的基因组DNA和未裂解的细胞碎片，而蛋白质会穿过所述过滤装置后到达收集管，即为滤液；

所述滤液，即是从所述粘性细胞裂解物中分离的蛋白质提取物。

其中，所述过滤装置中使用的多孔过滤介质，孔径为20～60um，厚度为0.5mm～20mm，设置在所述过滤装置的内腔的底部，用于截留所述粘性细胞裂解物中的基因组DNA和未裂解的细胞碎片。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解缓冲液不含有离液剂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解缓冲液含有一种或一种以上的表面活性剂。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述表面活性剂包括SDS、Triton X-100、NP-40、Tween-20和洋地黄皂苷中的一种或一种以上。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述过滤介质由疏水性材料制成，或者由亲水性材料制成。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述细胞裂解缓冲液被缓冲在pH7.0至pH12之间。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述细胞是脊椎动物细胞或者原核细胞。

8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述脊椎动物细胞是培养的细胞，或者存在于组织中的细胞。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，细胞裂解液接触细胞体积至少20ul。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，其中通过离心的方式施加所述正向力，离心时间30秒。

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