JP2012502632A - スモールrnaの単離法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、米国仮特許出願番号61/097,604、2008年9月17日出願、および61/148,126、2009年1月29日出願に基づく優先権を主張する;それらの開示内容全体を本明細書に援用する。
本発明は、核酸の単離法に関する。より詳細には、本発明はスモールRNA(small RNA)および総RNA(total RNA)を抽出および精製するための簡単かつ迅速な方法に関する。
さらに、第2無機物支持体から出る濾液は試料からの総タンパク質を含有する。したがって、タンパク質単離のためのいずれか一般的な方法で、総タンパク質を濾液から単離することができる。
本発明の上記および他の特徴および利点は、以下の詳細な記述および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
試薬およびプロトコル
表1:使用する試薬およびキット
培養細胞の破砕およびホモジナイゼーション:
a.1x106個の培養細胞を1.5mlマイクロ遠心チューブ内で8000×g、1分間の遠心によりペレット化する;
b.上清を吸引によって完全に除去する;
c.350μlの細胞溶解緩衝液(β−MEを含有)を添加する;
d.ボルテックス攪拌して細胞ペレットを再懸濁する;
e.細胞溶解物を、RNaseおよびDNaseを含まない注射器に取り付けた20ゲージの針に少なくとも5回通すことによりホモジナイズする;
f.次の工程へ進む。
a.10mgの組織を適切なサイズのチューブに入れる;
b.350μlの細胞溶解緩衝液(β−MEを含有)を添加する;
c.組織をPOLYTRON(登録商標)利用者マニュアルに従ってホモジナイズする;
d.調製したホモジェネートを目視検査し、ホモジナイゼーションが十分なことを確認する;
e.段階2もしくは3(フェノール/クロロホルム工程あり)または4もしくは5(フェノール/クロロホルム工程なし)へ進む。
2.1 RNAの結合
a.350μlの酸性フェノール:クロロホルムを、1.5mlマイクロ遠心チューブ内の350μlのホモジェネートに添加し、15秒間激しく振とうする;
b.12,000×gで15分間、+4℃において遠心する;
c.水層(上層)を新たな1.5mlマイクロ遠心チューブへ移す;
d.350μlの70%アセトンを添加する。数回の上下ピペッティングによって十分に混合する;
e.新たなスピンカラムを新たなコレクションチューブに入れる;
f.混合物全体をこのカラムへ移す;
g.8000×gで30秒間、遠心する;
h.スモールRNA単離のためにフロースルーを取っておく;
i.カラムを新たな2mlコレクションチューブへ移す。
a.500μlの洗浄緩衝液をカラムに添加する;
b.11,000×gで1分間、遠心する;
c.フロースルーを廃棄する;
d.カラムを、RNaseを含まない1.5mlマイクロ遠心チューブへ移す。
a.100μlの溶離緩衝液をカラムの中心に添加する;
b.11,000×gで1分間、遠心する;
c.カラムを廃棄し、純粋なRNAを収容したチューブを必要になるまで−80℃で保存する。
a.新たなスピンカラムを新たなコレクションチューブに入れる;
b.工程2.1.hからのフロースルーに、450μlの100%アセトンを添加し、十分に混合する;
c.数回の上下ピペッティングによって十分に混合する。混合物全体をカラムへ移す;
d.8000×gで30秒間、遠心する;
e.フロースルーを廃棄する;
f.500μlの洗浄緩衝液を添加し、8000×gで30秒間、遠心する;
g.500μlの80%アセトンを添加し、8000×gで2分間、遠心する;
h.カラムを、RNaseを含まない1.5mlマイクロ遠心チューブへ移す。
a.ヌクレアーゼを含まない水15μlを添加する;
b.8000×gで1分間、遠心する;
c.スモールRNAを含有するフロースルーを採集する。
このプロトコルは前記のワークフロー−1についてのプロトコルと同様である。唯一の例外は、工程2.1.i、2.2および2.3を実施しないことである。
4.1 RNAの結合
a.350μlの70%アセトンを1.5mlマイクロ遠心チューブ内の350μlの細胞溶解ホモジェネートに添加する。数回の上下ピペッティングによって十分に混合する;
b.新たなスピンカラムを新たなコレクションチューブに入れる;
c.混合物全体をこのカラムへ移す;
d.8000×gで30秒間、遠心する;
e.スモールRNA単離のためにフロースルーを取っておく;
f.カラムを新たな2mlコレクションチューブへ移す。
a.500μlの洗浄緩衝液をカラムに添加する;
b.11,000×gで1分間、遠心する;
c.フロースルーを廃棄する;
d.カラムを、RNaseを含まない1.5mlマイクロ遠心チューブへ移す。
a.100μlの溶離緩衝液をカラムの中心に添加する;
b.11,000×gで1分間、遠心する;
c.カラムを廃棄し、純粋なRNAを収容したチューブを必要になるまで−80℃で保存する。
a.新たなスピンカラムを新たなコレクションチューブに入れる;
b.工程4.1.eからのフロースルーに、450μlの100%アセトンを添加し、数回の上下ピペッティングによって十分に混合する;
c.混合物全体をカラムへ移す;
d.8000×gで30秒間、遠心する;
e.フロースルーを廃棄する;
f.500μlの洗浄緩衝液をスピンカラムに添加し、8000×gで30秒間、遠心する;
g.500μlの80%アセトンを添加し、8000×gで2分間、遠心する;
h.カラムを、RNaseを含まない1.5mlマイクロ遠心チューブへ移す。
a.ヌクレアーゼを含まない水15μlを添加する;
b.8000×gで1分間、遠心する;
c.スモールRNAを含有するフロースルーを採集する。
このプロトコルは前記のワークフロー−3についてのプロトコルと同様である。唯一の例外は、工程4.1.f、4.2および4.3を実施しないことである。
miRNAの精製にアセトンを使用できるかどうかを調べ、総RNAおよびmiRNAの精製に最適なアセトン濃度を確認するために、実験を行なった。
前記のワークフロー−1を用いてラット肝試料につき予備調査実験を行なった。エタノールまたは市販のRNA単離キット(総RNA単離用Mini RNeasy(登録商標)KitおよびスモールRNA(マイクロRNA)単離用miRNeasy Mini Kit;両方ともQiagenから)を用いて対照実験を行なった。
より大きいRNAを含まないスモールRNAの単離により、総工程数が少なくなる(ワークフロー−2をワークフロー−1と比較)。試料(ラット肝)を細胞溶解緩衝液中で細胞溶解した後、スモールRNA(マイクロRNA)精製のためにワークフロー−2のプロトコルを用いて溶解物を処理し、市販のRNA単離キット(miRNeasy Mini kit,Qiagen)を用いて対照実験を同様に行なった。
単離したスモールRNAがマイクロRNAを含有することを証明するために、種々のコピー数の4種類の異なるマイクロRNAを用いて、マイクロRNA特異的qRT−PCRアッセイを行なった。
Claims (16)
- 水性試料溶液からスモールRNAを単離するための方法であって、
a)水性試料を第1双極性非プロトン溶媒と混合して、より低いパーセントの第1溶媒を含有する混合物を調製し;
b)200ntより大きいラージRNAが第1無機物支持体に結合する条件下で、混合物を第1無機物支持体に適用し;
c)スモールRNAを含有するフロースルーを採集し;
d)工程(d)からのフロースルーを第2双極性非プロトン溶媒と混合して、より高いパーセントの第2溶媒を含有する第2混合物を調製し;
e)スモールRNAを結合させるために混合物を第2無機物支持体に適用し;
f)第2無機物支持体を洗浄緩衝液で洗浄し;そして
g)スモールRNAを第2無機物支持体から溶離する
ことを含む方法。 - 水性試料が、生物試料を細胞溶解溶液で細胞溶解することにより生成する、請求項1に記載の方法。
- 細胞溶解溶液が、カオトロピック塩、非イオン界面活性剤、および還元剤を含有する、請求項2に記載の方法。
- カオトロピック塩が塩酸グアニジンである、請求項3に記載の方法。
- 非イオン界面活性剤が、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル、(オクチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール、ソルビタリモノラウレート、T−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60およびポリソルベート80、またはその組合わせから選択される、請求項3に記載の方法。
- 非イオン界面活性剤またはその組合わせが0.1〜10%の範囲である、請求項5に記載の方法。
- 細胞溶解溶液が、1〜10Mの塩酸グアニジン、0.1〜10%のTWEEN(商標)20、および0.1〜10%のNP−40を含有する、請求項2に記載の方法。
- 混合工程b)の前に、さらに水性溶液のフェノール−クロロホルム抽出工程を含む、請求項2に記載の方法。
- 第1無機物支持体および第2無機物支持体が多孔質または非孔質であり、金属酸化物または混合金属酸化物、シリカゲル、シリカ膜、ガラス粒子、粉末ガラス、石英、アルミナ、ゼオライト、二酸化チタン、または二酸化ジルコニウムからなる、請求項1に記載の方法。
- 第1無機物支持体および第2無機物支持体が、それぞれシリカ膜である、請求項1に記載の方法。
- 第1または第2双極性非プロトン溶媒が、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン(THF)、メチルエチルケトン、N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、およびジメチルスルホキシドから選択される、請求項1に記載の方法。
- 第1および第2双極性非プロトン溶媒が両方ともアセトンである、請求項1または2に記載の方法。
- 工程a)において、より低いパーセントのアセトンが約35%であり、一方、工程d)において、より高いパーセントのアセトンが約50%である、請求項12に記載の方法。
- スモールRNAの収率が、アセトンの代わりにエタノールを用いて得られる収率より少なくとも10%高い、請求項12に記載の方法。
- 生物試料が、培養細胞、微生物、植物および動物から選択される、請求項2に記載の方法。
- 同一試料からラージRNAおよびスモールRNAの両方を分離および単離するための方法であって、
i)スモールRNAを請求項1の工程に従って単離し;
ii)場合により、ラージRNAを含有する請求項1の工程b)からの第1無機物支持体を洗浄し;そして
iii)ラージRNAを第1無機物支持体から溶離する
ことを含む方法。
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