WO2019131760A1 - 核酸の回収方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)体液試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程:
工程a)カオトロピック試薬、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体および核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、
工程b)工程a)において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程c)工程b)において分離した担体を、アニオン性界面活性剤を含む溶液と混合する工程、
工程d)工程c)において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程e)工程d)において分離した担体に、溶出液を加えて核酸を回収する工程、
を含む、核酸の回収方法。
(2)前記核酸が、マイクロRNAまたはセルフリーDNAであることを特徴とする(1)に記載の核酸の回収方法。
(3)前記体液試料が、全血、血清、血しょう、尿または唾液であることを特徴とする(1)または(2)に記載の核酸の回収方法。
(4)前記アニオン性界面活性剤が、カルボン酸型、スルホン酸型または硫酸エステル型である(1)から(3)のいずれかに記載の核酸の回収方法。
(5)前記カルボン酸型のアニオン性界面活性剤が、カプリル酸塩、ペラルゴン酸塩、カプリン酸塩、ラウリン酸塩、N-デカノイルサルコシン塩またはN-ラウロイルサルコシン塩である(4)に記載の核酸の回収方法。
(6)前記スルホン酸型のアニオン性界面活性剤が、オクチルベンゼンスルホン酸塩またはドデシルベンゼンスルホン酸塩である(4)に記載の核酸の回収方法。
(7)前記硫酸エステル型のアニオン性界面活性剤が、オクチル硫酸塩デシル硫酸塩またはドデシル硫酸塩である(4)に記載の核酸の回収方法。
(8)前記水溶性の中性ポリマーが、pH7の溶液中で-10mV以上+10mV以下のゼータ電位を有するポリマーであることを特徴とする(1)から(7)のいずれかに記載の核酸の回収方法。
(9)前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ(2-エチル-2-オキサゾリン)又はヒドロキシプロピルメチルセルロースであることを特徴とする(8)に記載の核酸の回収方法。
(10)前記溶出液が緩衝液であることを特徴とする請求項1から9のいずれかに記載の核酸の回収方法。
(11)水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体、カオトロピック試薬を含む溶液およびアニオン性界面活性剤を含む溶液を備えることを特徴とする核酸回収用のキット。
工程a)カオトロピック試薬、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体および核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、
工程b)工程a)において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程c)工程b)において分離した担体を、アニオン性界面活性剤を含む溶液と混合する工程、
工程d)工程c)において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程e)工程d)において分離した担体に、溶出液を加えて核酸を回収する工程、
を含む、核酸の回収方法である。
工程a)カオトロピック試薬、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体および核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、
工程b)工程a)において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程e)工程b)において分離した担体に、溶出液を加えて核酸を回収する工程。
ポリエチレングリコールはメルク株式会社より、ガンマ酸化アルミニウム(N613N)は日揮触媒化成株式会社より、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)は10%水溶液としてインビトロジェン株式会社より、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ラウリン酸ナトリウム、N-ラウロイルサルコシンナトリウムは東京化成株式会社より入手した。
アニオン製界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を用いて核酸の回収を行った。以下、工程毎に実験方法を説明する。
カオトロピック試薬として7Mグアニジンチオシアン酸塩(GTN)を用いた。核酸を含む溶液としてヒト血清を用いた。7M GTN、25mM HEPES(pH7)溶液450μl、ヒト血清100μl、上記で調製した酸化アルミニウムの担体とを混合し、15分間ミキサーで攪拌した。
工程a)において混合した溶液を遠心(10000G,1min)して上清を除き、当該核酸が吸着した担体を分離した。
工程b)で得られた核酸が吸着した担体に対して、25mM HEPES水溶液(pH7)(実施例1)または0.05% Tween20水溶液(実施例2)を400μl加え、ボルテックスした。溶液を遠心(10000G,1min)して上清を除き、担体を分離した。
分離した担体に、アニオン性界面活性剤を含む溶液として、0.5% SDS、25mM HEPES(pH7)を400μl加えボルテックスした。
工程c)で混合した溶液を遠心(10000G,1min)して上清を捨て、当該核酸が吸着した担体を分離した。
工程d)で得られた核酸が吸着した担体に対して25mM HEPES水溶液(pH7)(実施例1)または0.05% Tween20水溶液(実施例2)を400μl加え、ボルテックスした。溶液を遠心(10000G,1min)して上清を除き、担体を分離した。
分離した担体に、溶出液として10μlの125mMリン酸-125mMポリリン酸緩衝液(pH7)を加え、15分間ミキサーで攪拌した。次に、攪拌した溶液を遠心(10000G, 1min)して、上清を核酸溶液として回収した。
上記の工程を経て血清から回収した核酸に対して、3D-Gene(登録商標) miRNA Labeling kit(東レ株式会社)を用いて同社が定めるプロトコールに基づいてmiRNAを蛍光標識した。オリゴDNAチップとして、miRBase release 21に登録されているmiRNAの中で、2565種のmiRNAと相補的な配列を有するプローブを搭載した3D?Gene(登録商標) Human miRNA Oligo chip(東レ株式会社)を用い、同社が定めるプロトコールに基づいてストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション後の洗浄を行った。DNAチップを3D-Gene(登録商標)スキャナー(東レ株式会社)を用いてスキャンし、画像を取得して3D-Gene(登録商標)Extraction(東レ株式会社)にてそれぞれのmiRNA量の蛍光シグナル強度を数値化した。数値化されたそれぞれの蛍光シグナル強度をブランク値で割り、この値をS/N値とした。S/N値が1.5以上の蛍光シグナル強度に関して総和を取った(蛍光シグナル総和値)。実施例1、2の結果を表1に示す。
実施例1の回収工程から洗浄工程1を除いた工程で核酸の回収を行った。その他の条件・操作は実施例1と同様に行い、DNAチップを使って血液中のmiRNA蛍光強度の総和を取った。結果を表1に示す。
本比較例1、2では、工程c)と工程d)を除いた以外は、実施例1、2と同様の条件および操作で核酸を回収した。つまり、本比較例は、特許文献1に記載の核酸の回収方法に対応する。結果を表1に示す。
実施例1の工程a)において、カオトロピック試薬を用いない条件で核酸の回収を行った。工程a)では、核酸を含む溶液としてヒト血清100μlと25mM HEPES(pH7)溶液450μlの混合液を用いた。その他の条件・操作は、実施例1と同様に行い、DNAチップを使って血液中のmiRNA蛍光強度の総和を取った。結果を表2に示す。
大腸菌、酵母、細胞などが体液試料に含まれている場合、核酸の回収効率を高めるために、核酸の遊離処理を行っている場合がある。このようなとき、工程a)においてSDS等のアニオン性界面活性剤が核酸を含む溶液に含まれることになる。そこで、工程a)でアニオン性界面活性剤を用い、工程c)でカオトロピック試薬を用いて以下のように核酸の回収を行った。
実施例1の工程a)において、カオトロピック試薬とアニオン性界面活性剤の両方を用いて核酸を本発明の担体に吸着させ、さらに工程c)と工程d)を除いて核酸の回収を行った。工程a)においては、7Mグアニジンチオシアン酸塩(GTN)と0.5% SDS、25mM HEPES(pH7)を混合した溶液を用いた。その他の条件・操作は、比較例1と同様に行った。結果を表2に示す。
実施例1における工程c)の0.5% SDSを、アニオン性界面活性剤である、0.5%ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム(実施例4)、0.5% N-ラウロイルサルコシンナトリウム(実施例5)、0.25%ラウリン酸ナトリウム(実施例6)にそれぞれ置換しこれ以外の条件・操作は実施例1と同様にして、核酸の回収を行った。結果を表3に示す。
実施例1における工程c)のSDS濃度を、1%(実施例7)、0.1%(実施例8)、0.075%(実施例9)とし、それぞれ核酸の回収を行った。その他の条件・操作は実施例1と同様に行った。結果を表4に示す。
実施例1における工程a)において、7Mグアニジンチオシアン酸塩の代わりに、7Mグアニジン塩酸塩(実施例10)または8M尿素(実施例11)をそれぞれ用い、これ以外の条件・操作は、実施例1と同様にして、核酸の回収を行った。結果を表5に示す。
実施例1の工程a)で用いたカオトロピック試薬のグアニジンチオシアン酸塩濃度を、4M(実施例12)、2M(実施例13)、1M(実施例14)、0.5M(実施例15)とし、これ以外の条件・操作は、実施例1と同様にして、それぞれ核酸を回収した。結果を表6に示す。
体液試料として300μlの血漿を用い、カオトロピック試薬として450μlの7Mグアニジンチオシアン酸塩(GTN)を用い、溶出液として50μlの0.5Mリン酸緩衝液(pH7)を用いた以外は、実施例2と同様の条件及び操作で核酸を回収した。続いて回収した核酸にセルフリーDNAが含まれているかを、以下の方法で確認した。
工程c)および工程d)を除いた以外は、実施例2と同様の条件および操作で核酸を回収し、実施例16と同様の方法でセルフリーDNAの回収量をリアルタイムPCRのCq値として解析した。
Claims (11)
- 体液試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程:
工程a)カオトロピック試薬、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体および核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程、
工程b)工程a)において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程c)工程b)において分離した担体を、アニオン性界面活性剤を含む溶液と混合する工程、
工程d)工程c)において混合した溶液から、前記核酸が吸着した担体を分離する工程、
工程e)工程d)において分離した担体に、溶出液を加えて核酸を回収する工程、
を含む、核酸の回収方法。 - 前記核酸が、マイクロRNAまたはセルフリーDNAであることを特徴とする請求項1に記載の核酸の回収方法。
- 前記体液試料が、全血、血清、血しょう、尿または唾液であることを特徴とする請求項1または2に記載の核酸の回収方法。
- 前記アニオン性界面活性剤が、カルボン酸型、スルホン酸型または硫酸エステル型である請求項1から3のいずれかに記載の核酸の回収方法。
- 前記カルボン酸型のアニオン性界面活性剤が、カプリル酸塩、ペラルゴン酸塩、カプリン酸塩、ラウリン酸塩、N-デカノイルサルコシン塩またはN-ラウロイルサルコシン塩である請求項4に記載の核酸の回収方法。
- 前記スルホン酸型のアニオン性界面活性剤が、オクチルベンゼンスルホン酸塩またはドデシルベンゼンスルホン酸塩である請求項4に記載の核酸の回収方法。
- 前記硫酸エステル型のアニオン性界面活性剤が、オクチル硫酸塩、デシル硫酸塩またはドデシル硫酸塩である請求項4に記載の核酸の回収方法。
- 前記水溶性の中性ポリマーが、pH7の溶液中で-10mV以上+10mV以下のゼータ電位を有するポリマーであることを特徴とする請求項1から7のいずれかに記載の核酸の回収方法。
- 前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ(2-エチル-2-オキサゾリン)又はヒドロキシプロピルメチルセルロースであることを特徴とする請求項8に記載の核酸の回収方法。
- 前記溶出液が緩衝液であることを特徴とする請求項1から9のいずれかに記載の核酸の回収方法。
- 水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体、カオトロピック試薬を含む溶液およびアニオン性界面活性剤を含む溶液を備えることを特徴とする核酸回収用のキット。
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