JP2006238822A - 核酸の分離精製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む試料溶液を固相表面に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法において、迅速、高収量、高純度なプラスミドＤＮＡを得る方法を提供すること。
【解決手段】（１）核酸を含む試料溶液を固相に接触させて、該固相に核酸を吸着させる工程、（２）洗浄液を該固相に接触させて、核酸が吸着した状態で該固相を洗浄する工程、及び（３）回収液を該固相に接触させて、該固相から核酸を脱着させる工程を含有する核酸分離精製方法において、上記試料溶液を、異なる複数の酵素を添加する工程を含んで調製することを特徴とする核酸の分離精製方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、組換え核酸技術の領域で多用されるプラスミドＤＮＡを分離精製する方法に関する。

多くの場合、核酸は極めて少量でしか入手できず、単離および精製操作が煩雑で時間を要する。このしばしば時間を消費する煩雑な操作は核酸の損失に結びつきやすい。従来より、大腸菌プラスミドベクターに目的のＤＮＡを組み込んで培養し、目的のＤＮＡを大量に調製する方法は、組換え核酸技術の領域で頻繁に行われている操作の一つである。現在、大腸菌からのプラスミドＤＮＡの回収は、溶菌操作の後ゲノムＤＮＡと蛋白質等を取り除いてＲＮＡとプラスミドＤＮＡの混合物を、アルカリ−ＳＤＳ法などにより得、さらにＲＮＡとプラスミドＤＮＡの混合物から精製プラスミドＤＮＡを、一般的には、イオン交換樹脂を用いたカラム分離法、塩化セシウム密度勾配超遠心法などを用いることにより得ている。しかしながら、イオン交換樹脂を用いたカラム分離法では目的とするプラスミドＤＮＡが多量の溶離液で希釈されるため、溶離されたプラスミドＤＮＡの濃縮が必要であり、煩雑な操作が必要であった。また、塩化セシウム密度勾配超遠心法では、大がかりな装置で高い回転数で長時間遠心処理を行うため、細心の注意を要し、煩雑であり、また、経済的でなかった。

一方、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、固相に核酸を吸着させる溶液及び固相から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る固相に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を分離精製する方法が報告されている（特許文献１）。
特開２００３−１２８６９１号公報

しかしながら、特許文献１の技術では、大腸菌からのプラスミド精製においては混在するＲＮＡの除去を十分に行うことができず、回収されるプラスミドの純度は低くなっていた。以上のように、ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む溶液からプラスミドＤＮＡを分離精製する方法を実施する際、多くのサンプルについて目的のプラスミドＤＮＡを迅速に高収量でかつ高純度で回収することが望まれる。
本発明の目的は、ＲＮＡとプラスミドＤＮＡを含む試料溶液を固相表面に吸着させた後、洗浄等を経て脱着させて核酸を分離精製する方法において、迅速、高収量、高純度なプラスミドＤＮＡを得る方法を提供することである。

本発明者らは前記課題を解決するために鋭意検討した結果、異なる複数の酵素を添加する工程を含んで調製した試料溶液、すなわち、あらかじめ複数のヌクレアーゼを添加した試料溶液を固相に吸着させることで、目的の核酸（プラスミドＤＮＡ）が迅速、高収量、高精製度で回収できることを見出した。本発明においては特に、アセチルセルロ−スまたはアセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機高分子からなる固相を用いることで劇的に目的の核酸の収量と純度が向上することが判明した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

即ち、本発明によれば、上記の試料溶液の調製により、目的とする核酸（プラスミドＤＮＡ）を含む試料溶液中の目的の核酸を固相に吸着させる溶液とし、さらに固相から核酸
を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、目的とする核酸（プラスミドＤＮＡ）を分離精製する方法が提供される。

本発明は、以下の構成により前記目的を達成したものである。
１．
（１）核酸を含む試料溶液を固相に接触させて、該固相に核酸を吸着させる工程、
（２）洗浄液を該固相に接触させて、核酸が吸着した状態で該固相を洗浄する工程、及び（３）回収液を該固相に接触させて、該固相から核酸を脱着させる工程
を含有する核酸分離精製方法において、
上記試料溶液を、異なる複数の酵素を添加する工程を含んで調製することを特徴とする核酸の分離精製方法。
２．
酵素が、核酸分解酵素であることを特徴とする上記１項に記載の核酸の分離精製方法。３．
核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素であることを特徴とする上記１項または２項に記載の核酸の分離精製方法。
４．
ＲＮＡ分解酵素が、ＲＮａｓｅＴ１およびＲＮａｓｅＡであることを特徴とする上記３項に記載の核酸の分離精製方法。
５．
試料溶液が、核酸を含む試料に、カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、核酸安定化剤、緩衝剤、酸およびアルカリ剤から選ばれる少なくとも１つを含む前処理液を添加し、さらに水溶性有機溶媒を添加して調製されることを特徴とする上記１項〜４項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
６．
固相が膜形状であることを特徴とする上記１項〜５項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
７．
水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールから選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする上記１項〜６項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
８．
固相が、シリカもしくはその誘導体、珪藻土、又はアルミナを含有することを特徴とする上記１項〜７項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
９．
固相が、有機高分子を含有することを特徴とする上記１項〜８項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
１０．
固相が、テフロン（登録商標）、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート共重合体、ポリウレタン、ポリベンズイミダゾール、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニルおよびポリ弗化ビニリデンから選ばれる少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする上記９項に記載の核酸の分離精製方法。
１１．
固相が、正もしくは負の荷電をもったナイロンを含むことを特徴とする上記９項に記載の核酸の分離精製方法。
１２．
有機高分子が、多糖構造を有することを特徴とする上記９項に記載の核酸の分離精製方法。
１３．
有機高分子が、セルロース、セルロース混合エステル、硝酸セルロース、酢酸セルロー
スおよびニトロセルロースから選ばれる少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする上記９項に記載の核酸の分離精製方法。
１４．
上記１項〜１３項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法における工程を自動で行う装置。
１５．
（ｉ）核酸分離精製カ−トリッジと、（ｉｉ）複数の酵素と、（ｉｉｉ）カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、核酸安定化剤、緩衝剤、酸およびアルカリ剤の少なくともいずれかを含む前処理液並びに水溶性有機溶媒と、（ｉｖ）洗浄液と、（ｖ）回収液の試薬とを含む上記１項〜１３項のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うためのキット。

本発明の方法により、細菌または細胞から調製した核酸を含む試料溶液から純度の高いプラスミドＤＮＡを効率良く分離することができる。

本発明の核酸の分離精製方法について具体的に説明する。
［試料溶液の調製］
本発明において、核酸を含む試料としては、細菌または細胞が挙げられる。

使用する細菌または細胞は、プラスミドＤＮＡが含まれているものならば、限定無く使用することができる。

本発明において、試料に含まれる「核酸」は環状または直鎖状のいずれでもよく、一本鎖または二本鎖のいずれでもよく、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれでもよく、また、分子量の制限も無い。また目的の核酸であるプラスミドＤＮＡとしては二本鎖（ｄｓ）プラスミドＤＮＡ、一本鎖（ｓｓ）ファージＤＮＡのいずれでもよく、また分子量の制限も無い。

試料とは、核酸を含む任意の試料を意味する。試料中の核酸の種類は１種類でも２種類以上の複数でもよい。個々の核酸の長さも特に限定されず、例えば、数ｂｐ〜数Ｍｂｐの任意長の核酸を使用することができる。取り扱い上の観点からは、核酸の長さは一般的には、数ｂｐ〜数百ｋｂｐ程度である。

本発明では、細菌または細胞から調製した核酸を含む試料溶液を固相に接触させることにより試料溶液中の核酸を固相に吸着させ、次いで、固相に吸着させた核酸を、固相から脱着させる。
上記したように、本発明においては、試料溶液を、異なる複数の酵素を添加する工程を含んで調製し、あらかじめ複数のヌクレアーゼを添加した試料溶液として固相に吸着させることで、目的の核酸（プラスミドＤＮＡ）が分離精製される。
さらには、試料溶液が、核酸を含む試料に、カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、核酸安定化剤、緩衝剤、酸、アルカリ剤から選ばれる少なくとも１つを含む前処理液を添加し、さらに水溶性有機溶媒を添加して調製されることが好ましい。
試料溶液は、さらに好ましくは、
・細菌または細胞を分散液で分散し、
・アルカリ溶液を添加することで細菌または細胞を溶解し、
・中和液を添加し、
・沈殿成分を取り除き、該沈殿上清に溶解液を添加し、
・さらに水溶性有機溶媒を添加して調製された溶液である。
分散液は、核酸安定化剤、緩衝剤から選ばれる化合物を少なくとも一種を含むことができる。
アルカリ溶液は、アルカリ剤と、界面活性剤、消泡剤および緩衝剤から選ばれる少なくとも一種とを含む。アルカリ溶液を添加することで、分散液で分散した溶液中の細菌または細胞と核酸とを可溶化する事ができ、細胞を構成する構造体が溶解されて、核酸を試料溶液中に分散することができる。使用されるアルカリ剤としては、水酸化イオン濃度０．１〜５ｍｏｌ／Ｌのアルカリ金属類縁体水溶液が挙げられる。一方、アルカリ溶液の替わりに、タンパク質が熱に弱いがＤＮＡ等の核酸は比較的強い性質を利用して熱変性を用いることもできる。熱変性を用いる場合、加熱条件は８０〜１００℃で、５分〜２０分が好ましい。アルカリ溶液の添加、熱変性は単独又は組み合わせて採用することができる。
中和液は、酸と、カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、核酸安定化剤、緩衝剤およびアルカリ金属類縁体から選ばれる少なくとも一種とを含む。中和液は、前記アルカリ溶液を添加した後に得られたアルカリ性ライセートを好ましくは鉱酸及び無機塩の添加により酸性化するもので、酸として好ましくは酢酸である。酸の濃度は本発明にとって重要ではなく、変化しうる。酸の種類としては水中に溶解するあらゆる無機塩を使用しうるが、好ましい無機塩としては、そのアニオンが前記酸のそれと同じものである。例えば、酢酸を使用するとき、好ましい鉱物塩は、酢酸アルカリ金属又はアルカリ土類金属、特に酢酸カリウムである。酸性域に、酸性域として好ましくは、ｐＨ４．０〜ｐＨ６．５の範囲に、最も好ましくはｐＨ４．５〜ｐＨ６．０の範囲内に、ｐＨを下げるのに十分な酸を使用する。前記塩濃度は、酸と同様に変化しうるが、高濃度であることが好ましい。なぜなら、得られた溶液が高いイオン濃度を有することにより染色体ＤＮＡ及び他の不純物の沈殿を補助することとなり、これによりプラスミドＤＮＡとこれらの不純物を分離することが容易になる。最も好ましくは、１．０〜１０ｍｏｌ／Ｌ（１塩基塩に基づく）の範囲内の塩濃度である。
溶解液は、カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、核酸安定化剤、緩衝剤、アルカリ金属類縁体および水溶性有機溶媒の中から選ばれる化合物を少なくとも一種含む。

分散液で分散して得られた溶液に、未分散の細胞が残らないようにすることが望ましい。ボルテックス、タッピング、転倒混和などにより分散時によく細菌または細胞をよく分散させておくことが好ましい。

｛酵素｝
異なる複数の酵素の添加時期は、いつでもよく、例えば、上記のいずれかの溶液中に添加されていても良い。また、上記の溶液とは別に試料溶液調製のいずれかの時点で添加してもよい。

例えば、溶解液を添加して得られた溶液に、ＲＮＡ分解酵素溶液を添加することで、予め不要なＲＮＡを分解することも出来る。

また、溶解液を添加して得られた溶液に、特定のＤＮＡ分解酵素溶液を添加することで、染色体ゲノムＤＮＡなどの不要なＤＮＡを分解することも出来る。回収された目的とする核酸を含む溶液へ特定のＤＮＡ分解酵素溶液を添加することによっても染色体ゲノムＤＮＡなどの不要なＤＮＡを分解することも出来る。

本発明で用いる酵素としては、タンパク質分解酵素、核酸分解酵素、ムラミダーゼが挙げられる。
タンパク質分解酵素としては特に限定されず、例えばアルカリプロテアーゼなどを好ましく用いることができる。
核酸分解酵素としては、特に限定されず、例えばＲＮＡ分解酵素などを好ましく用いることができる。
ＲＮＡ分解酵素としては、特に限定されず、酵素活性、安定性などの点から、例えばＲＮａｓｅＡ，ＲＮａｓｅＴ１などを好ましく用いることができる。
ＤＮＡ分解酵素としては、例えばＡＴＰ依存性エキソヌクレアーゼ｛商品名Plasmid-Safe（Epicenter Technologies, Madison, Wisconsin, USA）｝、一本鎖特異的なエンドヌクレアーゼ等を好ましく用いることができる。これらの酵素は線状DNA（例えばゲノムDNA）を特異的に切断するが、スーパーコイル状のプラスミドDNAは切断されずに残す。
ムラミダーゼとしては特に限定されず、例えばリゾチームなどを好ましく用いることができる。
本発明においては、異なる複数の酵素を用いる。使用する酵素としては、核酸分解酵素が好ましく、より好ましくは、核酸分解酵素がＲＮＡ分解酵素である。異なる複数の酵素として、ＲＮＡ分解酵素であるＲＮａｓｅＡとＲＮａｓｅＴ１とを用いることが特に好ましい。
また、異なる複数の酵素は、別個にも、複数種以上の混合物としても用いることができる。
酵素の試料溶液中における濃度は、添加時の全容積１ｍｌあたり好ましくは０．００１ＩＵ〜１０ＩＵ、より好ましくは０．０１ＩＵ〜１ＩＵで用いることができる。あるいは、作用濃度として０．０５〜２０ｍｇ/ｍｌで用いることができる。
安定的に酵素の作用を維持するために、試料溶液に緩衝剤を加えることもできる。この場合は、例えばＴｒｉｓＨＣｌを１〜２００mmol/L含有させることができる。

また、核酸分解酵素を含まないタンパク質分解酵素やムラミダーゼも、好ましく用いることができる。
さらにまた、タンパク質分解酵素の安定化剤を含んだ酵素を好ましく用いることができる。安定化剤としては、金属イオンを好ましく用いることができる。具体的には、マグネシウムイオンやカルシウムイオンが好ましく、例えば塩化マグネシウムや酢酸カルシュウムなどの形で添加することができる。タンパク質分解酵素の安定化剤を含ませることにより、核酸の回収に必要なタンパク質分解酵素の微量化が可能となり、核酸の回収に必要なコストを低減することができる。タンパク質分解酵素の溶液に緩衝液を含有させたり、多価アルコールを加えたりすることができる。例えば、緩衝液としてＴｒｉｓＨＣｌを０．１〜２００mmol/L含有させたり、多価アルコールとしてグリセロールを１〜７０％含有させたりすることができる。これらは単独でも組み合わせて用いることができる。

｛界面活性剤｝
本発明で用いる界面活性剤の具体例としては、ノニオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤が挙げられる。
本発明においてはアニオン系界面活性剤およびノニオン系界面活性剤を好ましく用いることができる。
アニオン系界面活性剤としては、硫酸エステル系界面活性剤、スルホン酸系界面活性剤、カルボン酸系界面活性剤、りん酸系界面活性剤である。好ましくは、アルキル硫酸エステル塩が好ましい。特にドデシル硫酸ナトリウムが好ましい。好ましくはアルカリ溶液に含有され細菌または細胞の溶解に作用させることができる。

ノニオン系界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤、脂肪酸アルカノールアミドが挙げられ、好ましくは、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系界面活性剤である。ポリオキシエチレン（ＰＯＥと略して言うこともある。）アルキルエーテル系界面活性剤のなかでも、ＰＯＥデシルエ−テル、ＰＯＥラウリルエ−テル、ＰＯＥトリデシルエ−テル、ＰＯＥアルキレンデシルエ−テル、ＰＯＥソルビタンモノラウレ−ト、ＰＯＥソルビタンモノオレエ−ト、ＰＯＥソルビタンモノステアレ−ト、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ＰＯＥアルキルアミン、ＰＯＥアセチレングリコ−ルがさらに好ましい。
これらの界面活性剤は、単独または複数組み合わせて用いてもよい。界面活性剤の前記
アルカリ溶液、中和液および溶解液における濃度は０．１〜３０質量％であることが好ましい。

｛緩衝剤｝
本発明で用いる緩衝剤の具体例としては、通常用いられるｐＨ緩衝剤(buffer)を挙げることができる。好ましくは、生化学用のｐＨ緩衝剤が挙げられる。このような緩衝剤としては、クエン酸塩、リン酸塩または酢酸塩から成る緩衝剤、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ/ＥＤＴＡ）、ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ/ＥＤＴＡ）、ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ/ＥＤＴＡ）、グッド緩衝剤が挙げられる。グッド緩衝剤としては、
ＭＥＳ(2-Morpholinoethanesulfonic acid)、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ(Bis(2-hydoroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane)、ＨＥＰＥＳ(2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic asid)、ＰＩＰＥＳ(Piperaxine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid))、ＡＣＥＳ(N-(2-Acetamino)-2-aminoethanesulfonic acid)、ＣＡＰＳ(N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid)、ＴＥＳ(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid) が挙げられる。
これらの緩衝剤は、前記分散液、アルカリ溶液、中和液、溶解液、洗浄液、回収液中の濃度は１〜３００mmol/Lであることが好ましい。

｛核酸安定化剤｝
本発明で用いる核酸安定化剤の具体例としては、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有するものが挙げられる。試料によっては、核酸を分解するヌクレアーゼ等が含まれていることがあり、核酸をホモジナイズするとこのヌクレアーゼが核酸に作用し、収量が激減することがある。前記核酸安定化剤は、試料中の核酸を安定に存在させることができ、好ましい。

ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤としては、一般的に還元剤として使用される化合物を用いることができる。還元剤としては、水素、ヨウ化水素、硫化水素、水素化アルミニウムリチウム、水素化ホウ素ナトリウム等の水素化化合物、アルカリ金属、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム、亜鉛等の電気的陽性の大きい金属、またはそれのアマルガム、アルデヒド類、糖類、ギ酸、シュウ酸などの有機酸化物、メルカプト化合物等が挙げられる。中でもメルカプト化合物が好ましい。メルカプト化合物としては、Ｎ−アセチルシステイン、メルカプトエタノールや、アルキルメルカプタン等が挙げられる。特に、β−メルカプトエタノールが好ましい。メルカプト化合物は単独または複数組み合わせて用いてもよい。
核酸安定化剤は、前処理液における濃度は０．１〜２０質量％であることが好ましく、より好ましくは、０．３〜１５質量％で、用いることができる。

また、ヌクレアーゼの活性を不活性化させる作用を有する核酸安定化剤として、キレート剤を用いることができる。キレート剤としては、例えば、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＥＧＴＡ等を挙げることができる。キレート剤は単独または複数組み合わせて用いてもよい。例えば、ＥＤＴＡを１〜３００mmol/Lの作用濃度範囲で用いることができる。好ましくは分散液に含有し、内因性のヌクレアーゼ活性の不活化に作用させることができる。

｛アルカリ金属類縁体｝
本発明で用いるアルカリ金属類縁体の具体例としては、塩化物または酢化物が好ましく、さらに好ましくはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、であることが望ましい。アルカリ金属類縁体は、前記分散液、アルカリ溶液、中和液、溶解液および洗浄液、回収液における濃度は０．０１mol/L以上、より好ましくは０．０１〜５mol/Lで、用いることができる。

｛消泡剤｝
本発明で用いる消泡剤の具体例としては、シリコン系消泡剤（例えば、シリコーンオイル、ジメチルポリシロキサン、シリコーンエマルジョン、変性ポリシロキサン、シリコーンコンパウンドなど）、アルコール系消泡剤（例えば、アセチレングリコール、ヘプタノール、エチルエキサノール、高級アルコール、ポリオキシアルキレングリコールなど）、エーテル系消泡剤（例えば、ヘプチルセロソルブ、ノニルセロソルブ−３−ヘプチルコルビトールなど）、油脂系消泡剤（例えば、動植物油など）、脂肪酸系消泡剤（例えば、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸など）、金属セッケン系消泡剤（例えば、ステアリン酸アルミ、ステアリン酸カルシウムなど）、脂肪酸エステル系消泡剤（例えば、天然ワックス、トリブチルホスフェートなど）、リン燐酸エステル系消泡剤（例えば、オクチルリン酸ナトリウムなど）、アミン系消泡剤（例えば、ジアミルアミンなど）、アミド系消泡剤（例えば、ステアリン酸アミドなど）、その他の消泡剤（例えば、硫酸第二鉄、ボーキサイトなど）などが挙げられる。特に好ましくは、消泡剤として、シリコン系消泡剤とアルコール系消泡剤の２つの成分を組み合わせて使用することができる。また、アルコール系消泡剤としては、アセチレングリコール系界面活性剤を使用することも好ましい。前記アルカリ溶液、中和液および溶解液、並びに試料溶液中の消泡剤濃度は、０〜１０質量％であることが好ましく、より好ましくは０．０１〜５質量％である。

｛カオトロピック塩｝
本発明で用いるカオトロピック塩の具体例としては、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム等を使用することができる。中でもグアニジン塩が好ましい。グアニジン塩としては、塩酸グアニジン、イソチオシアン酸グアニジン、チオシアン酸グアニジンが挙げられ、中でも塩酸グアニジンが好ましい。これらの塩は単独でも、複数組み合わせて用いてもよい。前記中和液または溶解液や試料溶液中のカオトロピック塩濃度は、０．５mol/L以上であることが好ましく、より好ましくは０．５mol/L〜４mol/L、さらに好ましくは、１mol/L〜３mol/Lである。
カオトロピック塩の代わりに、カオトロピック物質として尿素を用いることもできる。

｛水溶性有機溶媒｝
前述したように、試料溶液は、前処理液を添加した後に、さらに水溶性有機溶媒を添加して調製される。該水溶性有機溶媒を添加する工程を含んで調製された試料溶液を、固相と接触させる。以上の操作により、試料溶液中の核酸が固相に吸着される。本明細書中前記した操作で可溶化された核酸を、固相に吸着させるためには、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することが必要であり、得られた試料溶液中に塩が存在することが必要である。

即ち、核酸の周りに存在する水分子の水和構造を破壊することにより、核酸は不安定な状態で可溶化することになる。この状態の核酸を、固相と接触させると、核酸表面上の極性基と固相表面、好ましくは後述する固相表面の極性基間で相互作用し、核酸は固相表面上に吸着するものと考えられる。本発明の方法では、可溶化した核酸混合液に水溶性有機溶媒を混合することと、得られた試料溶液中に塩が存在することによって、核酸を不安定な状態にさせることができる。

この水溶性有機溶媒としては、アルコール類、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド等上げられる。これらの中でも、アルコール類が好ましい。アルコール類としては、１級アルコール、２級アルコール、３級アルコールのいずれでも良い。中でもメタノール、エタノール、プロパノール及びその異性体、ブタノール及びその異性体が好ましい。

また、これら水溶性有機溶媒の核酸を含む試料溶液における最終濃度は、５〜９０質量％であることが好ましい。さらに好ましくは２０質量％〜６０質量％である。水溶性有機溶媒の添加濃度は、凝集物を生じない程度でできるだけ高くすることが特に好ましい。

得られた試料溶液中に存在する塩としては、各種カオトロピック物質（グアニジウム塩、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム）や塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、臭化ナトリウム、臭化カリウム、臭化カルシウム、臭化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム、酢酸アンモニウム等が好ましい。

前記試料溶液は、好ましくはｐＨ３〜１０、より好ましくはｐＨ４〜９、さらに好ましくはｐＨ５〜８のものが用いられる。

また、得られた試料溶液は、表面張力は０．０５Ｊ／ｍ²以下、粘度は１〜１００００ｍＰａ、比重は ０．８〜１．２の範囲であることが好ましい。この範囲の溶液にすることで、次の工程において、核酸を含む試料溶液を前記固相に通過させて、核酸を吸着させた後に残った溶液を除去しやすくする。

［固相］
固相は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する固相が好ましい。これは、固相側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と固相が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。これは、親水基を有する固相であり、環境の極性を変化させることで、核酸と固相の親水基同士が引きあるようになると推定される。

親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基などを挙げることができる。好ましくは水酸基である。

ここで、親水基を有する固相とは、固相を形成する材料自体が親水性基を有すること、または固相を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入することを意味する。固相を形成する材料を処理またはコーティングする場合、固相を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、固相を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である固相、親水基を持たない有機材料の固相を処理して親水基を導入した固相、親水基を持たない有機材料の固相に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した固相、固相を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である固相、親水基を持たない無機材料の固相を処理して親水基を導入した固相、親水基を持たない無機材料の固相に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した固相などを使用することができるが、加工の容易性から、固相を形成する材料は有機高分子などの有機材料を用いることが好ましい。

親水基を有する材料の固相としては、水酸基を有する有機材料の固相を挙げることができる。水酸基を有する有機材料の固相としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アクリル被覆ナイロンのようなポリアミド及びポリプロピレン（ナイロンは、正もしくは負のどちらに荷電していてもよい）、多糖構造を有する有機分子などを挙げることができる。

多糖構造を有する有機高分子としては、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、アガロース、デキストリン、アミロース、アミロペクチン、デンプン、グリコーゲン、プルラン、マンナン、グルコマンナン、リケナン、イソリケナン、ラミナラン、カラギーナン、キシラン、フルクタン、アルギン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン、キチン、キトサン等を好ましく用いることができるが、多糖構造およびその誘導体であれば前記に挙げた材料に限定されることはない。また、前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体についても好ましく用いることができる。また、前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のエステル誘導体のエステルとしては、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造の、カルボン酸エステル、硝酸エステル、硫酸エステル、スルホン酸エステル、リン酸エステル、ホスホン酸エステル、ピロリン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のカルボン酸エステルとしては、アルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造のアルキルカルボニルエステル、アルケニルカルボニルエステル、芳香族カルボニルエステル、芳香族アルキルカルボニルエステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のアルキルカルボニルエステルのエステル基としては、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、バレル基、ペプタノイル基、オクタノイル基、デカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、ヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基のいずれか一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のアルケニルカルボニルエステルのエステル基がアクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記アクリル基、メタクリル基のいずれか一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造の芳香族カルボニルエステルのエステル基がベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記ベンゾイル基、ナフタロイル基の少なくとも一つ以上から選ばれるエステル基を持つ前記いずれかの多糖構造の鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造の硝酸エステルとしては、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどを好ましく用いることができる。
また、前記、ニトロセルロース、ニトロヘミセルロース、ニトロデキストラン、ニトロアガロース、ニトロデキストリン、ニトロアミロース、ニトロアミロペクチン、ニトログリコーゲン、ニトロプルラン、ニトロマンナン、ニトログルコマンナン、ニトロリケナン、ニトロイソリケナン、ニトロラミナラン、ニトロカラギーナン、ニトロキシラン、ニトロフルクタン、ニトロアルギン酸、ニトロヒアルロン酸、ニトロコンドロイチン、ニトロキチン、ニトロキトサンなどの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造の硫酸エステルとしては、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロース硫酸、ヘミセルロース硫酸、デキストラン硫酸、アガロース硫酸、デキストリン硫酸、アミロース硫酸、アミロペクチン硫酸、グリコーゲン硫酸、プルラン硫酸、マンナン硫酸、グルコマンナン硫酸、リケナン硫酸、イソリケナン硫酸、ラミナラン硫酸、カラギーナン硫酸、キシラン硫酸、フルクタン硫酸、アルギン酸硫酸、ヒアルロン酸硫酸、コンドロイチン硫酸、キチン硫酸、キトサン硫酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のスルホン酸エステルとしては、アルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルのいずれか一つ以上から選ばれることが好ましい。また、前記いずれかの多糖構造のアルキルスルホン酸エステル、アルケニルスルホン酸エステル、芳香族スルホン酸エステル、芳香族アルキルスルホン酸エステルの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のリン酸エステルとしては、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースリン酸、ヘミセルロースリン酸、デキストランリン酸、アガロースリン酸、デキストリンリン酸、アミロースリン酸、アミロペクチンリン酸、グリコーゲンリン酸、プルランリン酸、マンナンリン酸、グルコマンナンリン酸、リケナンリン酸、イソリケナンリン酸、ラミナランリン酸、カラギーナンリン酸、キシランリン酸、フルクタンリン酸、アルギン酸リン酸、ヒアルロン酸リン酸、コンドロイチンリン酸、キチンリン酸、キトサンリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のホスホン酸エステルとしては、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースホスホン酸、ヘミセルロースホスホン酸、デキストランホスホン酸、アガロースホスホン酸、デキストリンホスホン酸、アミロースホスホン酸、アミロペクチンホスホン酸、グリコーゲンホスホン酸、プルランホスホン酸、マンナンホスホン酸、グルコマンナンホスホン酸、リケナンホスホン酸、イソリケ
ナンホスホン酸、ラミナランホスホン酸、カラギーナンホスホン酸、キシランホスホン酸、フルクタンホスホン酸、アルギン酸ホスホン酸、ヒアルロン酸ホスホン酸、コンドロイチンホスホン酸、キチンホスホン酸、キトサンホスホン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のリン酸エステルとしては、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などを好ましく用いることができる。また、前記、セルロースピロリン酸、ヘミセルロースピロリン酸、デキストランピロリン酸、アガロースピロリン酸、デキストリンピロリン酸、アミロースピロリン酸、アミロペクチンピロリン酸、グリコーゲンピロリン酸、プルランピロリン酸、マンナンピロリン酸、グルコマンナンピロリン酸、リケナンピロリン酸、イソリケナンピロリン酸、ラミナランピロリン酸、カラギーナンピロリン酸、キシランピロリン酸、フルクタンピロリン酸、アルギン酸ピロリン酸、ヒアルロン酸ピロリン酸、コンドロイチンピロリン酸、キチンピロリン酸、キトサンピロリン酸などの鹸化物についてもさらに好ましく用いることができる。

前記いずれかの多糖構造のエーテル誘導体としては、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチル−カルバモイルエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、シアノエチルセルロース、カルバモイルエチルセルロース等を用いることができるが、これらに限定されることはない。好ましくは、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースを用いることができる。

前記いずれかの多糖構造の水酸基が、任意の置換度でハロゲン化したものについても好ましく用いることができる。

多糖構造を有する有機高分子から成る固相として好ましくは、アセチルセルロ−スが挙げられ、更にアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物から成る有機高分子の固相を使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物を好ましく使用する事ができる。 特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９である事が好ましく、９０：１０〜５０：５０である事がより好ましい。

特に好ましい、アセチルセルロ−スから成る固相としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースの表面鹸化物とは、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理したものであり、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロース混合物の鹸化物も好ましく使用することができる。より好ましくは、ト
リアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の鹸化物を使用することである。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比（質量比）は、９９：１〜１：９９であることが好ましい。更に好ましくは、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロース混合物の混合比は、９０：１０〜５０：５０であることである。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率をあげるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。鹸化処理により得られる固相の鹸化率（表面鹸化率）が５％以上１００％以下であることが好ましく、１０％以上１００％以下であることが更に好ましい。また、水酸基を有する固相の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの固相を鹸化処理することが好ましい。

ここで、鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分は、再生セルロースとなり水酸基が導入される。こうして作成された再生セルロースは、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。本発明において固相として、再生セルロースの固相を用いることが特に好ましい。
又、鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。

親水基を持たない有機材料の固相に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を固相に結合することができる。
有機材料の固相にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、固相とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、固相を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。

まず、固相とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に固相と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と固相の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。固相と反応する官能基としては、固相の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。
ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレンなどを挙げることができる。

固相を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖とする方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱などの方法で基材表面上に活性種を与え、固相と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって固相と結合させる方法を指す。
基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば
親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーである。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。

親水基を持たない有機材料の固相に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物などを挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。

また、親水基を持たない有機材料の固相に、アセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。

親水基を有する無機材料である固相としては、シリカもしくはその誘導体、珪藻土、又はアルミナ化合物を含有する固相を挙げることができる。シリカ化合物を含有する固相としては、ガラスフィルターを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調製し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。

親水基を持たない無機材料の固相に親水基を導入する方法としては、固相と親水基を持つグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、固相を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
固相と親水基を持つグラフトポリマー鎖とを化学結合させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用し、固相を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。

親水基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、前記、親水基を持たない有機材料の固相に親水基を導入する方法において、記載した親水性基を有するグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。

親水基を持たない無機材料の固相に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリ
マーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロース混合物などを挙げることができる。

また、親水基を持たない無機材料の固相に、アセチルセルロースまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロ−スまたはアセチル価の異なるアセチルセルロース混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が５％以上１００％以下であることが好ましい。さらには、鹸化率が１０％以上１００％以下であることが好ましい。

親水基を持たない無機材料の固相としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した固相を挙げることができる。

前記の固相は、フィルター、膜状の形態で使用することが、溶液が内部を通過可能であり、好ましい。この場合、厚さが１０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、厚さが５０μｍ〜２５０μｍである。洗浄がし易い点で、厚さが薄いほど好ましい。

前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、平均孔径が０．１μｍ〜１０μｍであることが好ましい。さらに好ましくは、平均孔径が１μｍ〜５μｍである。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。この溶液が内部を通過可能な固相の平均孔径は、バブルポイント法(ASTM316-86、JIS3832準拠)を用いて決定することができる。

前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、表裏対称性の多孔膜であってもよいが、表裏非対称性の多孔膜を好ましく使用することができる。ここで、表裏非対称性とは、多孔膜の一方の面から他方の面へと膜の物理的性質または化学的性質が変化している性質を示す。
膜の物理的性質の例としては、平均孔径が挙げられる。また膜の化学的性質としては鹸化度が挙げられる。
平均孔径が表裏非対称性の多孔膜を本発明で使用する場合は、液の通過する方向に平均孔径が、大→小に変化するようにするのが好ましい。ここで、最大孔径と最小孔径の比が２以上である多孔膜を用いる事が好ましい。さらに好ましくは、最大孔径と最小孔径の比が５以上である。これにより、核酸が吸着するのに十分な表面積が得られるとともに、目詰まりし難い。

前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、空隙率が５０〜９５％であることが好ましい。さらに好ましくは、空隙率が６５〜８０％である。また、バブルポイントが、０．１〜１０ｋｇｆ／ｃｍ²である事が好ましい。さらに好ましくは、バブルポイントが、０．２〜４ｋｇｆ／ｃｍ²である。

前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、圧力損失が、０．１〜１００ｋＰａである事が好ましい。これにより、過圧時に均一な圧力が得られる。さらに好ましくは、圧力損失が、０．５〜５０ｋＰａである。ここで、圧力損失とは、膜の厚さ１００μｍあたり、水を通過させるのに必要な最低圧力である。

前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ²あたり１分間で１〜５０００ｍＬであることが好ましい
。さらに好ましくは、２５℃で１ｋｇ／ｃｍ²の圧力で水を通過させたときの透水量が、膜１ｃｍ²あたり１分間で５〜１０００ｍＬである。

前記の、溶液が内部を通過可能な固相は、多孔膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．１μｇ以上である事が好ましい。さらに好ましくは、多孔膜１ｍｇあたりの核酸の吸着量が０．９μｇ以上である。

核酸を含む試料溶液を前記固相に通過させる場合の流速は、液の固相への適切な接触時間を得るために、固相の面積ｃｍ²あたり、２〜１５００μＬ/secである事が好ましい。液の固相への接触時間が短すぎると十分な分離精製効果が得られず、長すぎると操作性の点から好ましくない。さらに、前記流速は、固相の面積ｃｍ²あたり、５〜７００μＬ/secである事が好ましい。

また、使用する溶液が固相の内部を通過可能な場合は、１種類であってもよいが、複数を使用することもできる。複数の固相は、同一の素材であっても、異なるものであって良い。

［洗浄］
核酸を固相に吸着させた後。固相を洗浄することにより、核酸の回収量及び純度が向上し、必要な核酸を含む試料の量を微量とすることができる。また、洗浄や回収操作を自動化することによって、操作が簡便かつ迅速に行うことが可能になる。洗浄工程は、迅速化のためには１回の洗浄で済ませてもよく、また純度がより重要な場合には複数回洗浄を繰返すことが好ましい。

洗浄液は、水溶性有機溶媒を含んでいる溶液であることが好ましい。又、必要に応じて水溶性塩、緩衝剤、界面活性剤を含むでも良い。洗浄液は、固相に核酸と共に吸着した試料溶液中の不純物を洗い流す機能を有する必要がある。そのためには、固相から核酸は脱着させないが不純物は脱着させる組成であることが必要である。この目的には、核酸がアルコール等の水溶性有機溶媒に難溶性であるので、核酸を保持したまま核酸以外の成分を脱着させるのに適している。また、水溶性塩を添加することにより、核酸の吸着効果が高まるので、不純物および不要成分の選択的除去作用が向上する場合もある。

洗浄液に含まれる水溶性有機溶媒としては、アルコール、アセトンなどを用いることができ、アルコールが好ましい。アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノールが挙げられる。プロパノールとしては、イソプロパノール、ｎ−プロパノールのいずれでもよく、ブタノールも直鎖状でも分岐状でもよい。これらアルコールは、複数種類を使用することもできる。この中でも、エタノールを用いることが好ましい。洗浄液中に含まれる水溶性有機溶媒の量は、２０〜１００質量％であることが好ましく、４０〜１００質量％であることがより好ましい。

一方、洗浄液に水溶性塩が含まれる場合は、ハロゲン化物の塩が好ましく、中でも塩化物がより好ましい。また、水溶性塩は、一価または二価のカチオンであることが好ましく、特にアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が好ましく、中でもナトリウム塩及びカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が最も好ましい。
水溶性塩が洗浄液中に含まれる場合、その濃度は１０mmol/L以上であることが好ましく、その上限は不純物の溶解性を損なわない範囲であれば特に問わないが、１mol/L以下であることが好ましく、０．１mol/L以下であることがより好ましい。よりさらに好ましくは、水溶性塩が塩化ナトリウムであり、とりわけ、塩化ナトリウムが２０mmol/L以上含まれていることが好ましい。

洗浄液は、カオトロッピック物質を含んでいなくてもよい。それによって、洗浄工程に引き続く回収工程にカオトロピック物質が混入する可能性を減らすことができる。回収工程時に、カオトロピック物質が混入すると、しばしばＰＣＲ反応等の酵素反応を阻害するので、後の酵素反応等を考慮すると洗浄液にカオトロッピク物質を含まないことが望ましい。また、カオトロピック物質は、腐食性で有害であるので、この点でもカオトロピック物質を用いないで済むことは、実験者にとっても試験操作の安全上極めて有利である。ここでカオトロピック物質とは、前記した尿素、グアニジン塩、イソチアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウムなどである。

従来、核酸分離精製方法における洗浄工程の際、洗浄液がカートリッジなどの容器に対する濡れ性が高いため、しばしば洗浄液が容器中に残留することになり、洗浄工程に続く回収工程への洗浄液の混入して核酸の純度の低下や次工程における反応性の低下などの原因となっている。したがって、カートリッジなどの容器を用いて核酸の吸着及び脱着を行う場合、吸着、洗浄時に用いる液、特に洗浄液が、次の工程に影響を及ぼさないように、カートリッジ内に洗浄残液が残留しないことは重要である。

したがって、洗浄工程における洗浄液が次工程の回収液に混入することを防止して、洗浄液のカートリッジ内への残留を最小限に留めるため、洗浄液の表面張力を０．０３５Ｊ／ｍ²未満が好ましい。表面張力が低いと、洗浄液とカートリッジの濡れ性が向上し、残留する液量を抑えることができる。

しかし、洗浄効率を上げる為に、水の割合を増やすことができるが、この場合、洗浄液の表面張力は上昇し、残留する液量が増える。洗浄液の表面張力が０．０３５Ｊ／ｍ²以上の場合は、カートリッジの撥水性を高めることで、残留する液量を抑えることができる。カートリッジの撥水性を高めることで、液滴を形成させ、その液滴が流れ落ちることによって残留する液量が抑制できる。撥水性を高める方法としては、カートリッジ表面にシリコン等の撥水剤をコートするか、カートリッジ成型時にシリコン等の撥水剤を練り込む等の手段があるが、これに限らない。

洗浄工程における洗浄液の液量は、２μｌ/ｍｍ²以上が好ましい。洗浄液量が多量であれば洗浄効果は向上する。しかし、２００μｌ/ｍｍ²以下とすることで、操作性を保ち、試料の流出を抑止することができ好ましい。

洗浄工程において、洗浄液を固相に通過させる場合の流速は、膜の単位面積（ｃｍ²）あたり、２〜１５００μＬ/secであることが好ましく、５〜７００μＬ/secであることがより好ましい。通過速度を下げて時間を掛ければ洗浄がそれだけ十分に行なわれることになる。しかし、前記の範囲とすることで、洗浄効率を落とすことなく、核酸の分離精製操作を迅速化でき、好ましい。

洗浄工程において、洗浄液の液温は４〜７０℃であることが好ましい。さらには、洗浄液の液温を室温とすることがより好ましい。また、洗浄工程において、洗浄工程と同時に核酸分離精製カートリッジに器械的な振動や超音波による攪拌を与えることもできる。または遠心分離を行うことにより洗浄することもできる。

上記の洗浄工程の前もしくは工程の途中において、回収する目的の核酸がＤＮＡの場合は、固相にＲＮＡ分解酵素溶液を接触させることで、予めＲＮＡを分解することも出来る。また、目的の核酸がＲＮＡの場合は、固相にＤＮＡ分解酵素溶液を接触させることで、予めＤＮＡを分解することも出来る。いずれの場合も、その後に洗浄液を用いて固相を洗浄し、ＲＮＡ分解酵素またはＤＮＡ分解酵素を固相から除くことが重要である。

［回収］
次に、固相に吸着した核酸を脱着せしめうる溶液（回収液）に、前記洗浄後の固相を接触させる。この溶液には目的とする核酸が含まれているので、これを回収し、後に続く操作、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による核酸の増幅に提供する。

試料から調製した核酸を含む試料溶液の体積に対して、回収液の体積を調整して核酸の脱着を行うことができる。分離精製された核酸を含む回収液量は、そのとき使用する試料の量による。一般的によく使われる回収液量は数１０から数１００μｌであるが、試料の量が極微量である時や、逆に大量の核酸を分離精製したい場合には回収液量は１μｌから数１０ｍｌの範囲で変える事ができる。

回収液としては好ましくは精製蒸留水、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡバッファ等が使用でき、ｐＨは、ｐＨ２〜１１であることが好ましい。さらには、ｐＨ５〜９であることが好ましい。また特にイオン強度と塩濃度は吸着核酸の溶出に効果を及ぼす。回収液は、２９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のイオン強度であることが好ましく、さらには、９０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩濃度であることが好ましい。この時の塩はアルカリ金属塩であってもよい。回収液を以上のようにすることで、核酸の回収率が向上し、より多くの核酸を回収できることができる。

回収液の体積を当初の核酸を含む試料溶液の体積と比較して少なくすることによって、濃縮された核酸を含む回収液を得ることができる。好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１００〜９９：１００であり、更に好ましくは、(回収液体積)：(試料溶液体積)＝１：１０〜９：１０である。これにより核酸分離精製後工程において濃縮のための操作をすることなく、簡単に核酸を濃縮できる。これらの方法により試料よりも核酸が濃縮されている核酸溶液を得る方法を提供できる。

回収液の注入回数は限定されるものではなく、１回でも複数回でもよい。通常、迅速、簡便に核酸を分離精製する場合は、１回の回収で実施するが、大量の核酸を回収する場合等複数回にわたり回収液を注入してもよい。

また、回収工程において、核酸の回収液に回収した核酸の分解を防ぐための安定化剤を添加しておくことも可能である。安定化剤としては、抗菌剤、抗カビ剤や核酸分解抑制剤などを添加することができる。核酸分解抑制剤としては、核酸分解酵素の阻害剤が挙げられ、具体的にはＥＤＴＡなどが挙げられる。また別の実施態様として、回収容器にあらかじめ安定化剤を添加しておくこともできる。また、回収された核酸溶液へ特定のＤＮＡ分解酵素溶液を添加することによっても染色体ゲノムＤＮＡなどの不要なＤＮＡを分解することも出来る。
本発明の方法は、プラスミドＤＮＡを分離精製するときのみならず、ファージミドＤＮＡを分離精製するときにも同様に好ましく適用することができる。

［核酸分離精製ユニット、核酸分離精製カートリッジ］
本発明では、(ａ) 固相、(ｂ) 前記固相を収容する、少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ) 前記容器の一の開口に結合された圧力差発生装置、を含む核酸分離精製ユニットを使用することが好ましい。以下、この核酸分離精製ユニットについて説明する。

容器の材料に特別な限定はなく、固相が収容でき、かつ少なくとも２個の開口を設けることができればよいが、製造の容易性からプラスチックが好ましい。例えば、ポリスチレン、ポリメタアクリル酸エステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリカーボネート等の透明あるいは不透明の樹脂を用いるのが好ましい。

容器は、固相の収容部を持ち、収容部に固相を収容でき、固相が試料溶液等の吸引及び排出時に収容部の外へは出ることがなく、開口に圧力差発生装置、例えば注射器を接合できればよい。このためには、容器が当初は二つの部分に分かれており、固相を収容した後で一体化できることが好ましい。また、固相が収容部から外へでることをさける為には、固相の上下に核酸を汚染しない材料で作成されたメッシュを置くことができる。

前記容器に収容される固相の形状にも特別な限定は無く、円形、正方形、長方形、楕円、膜の場合には筒状、巻物状、あるいは表面に水酸基を有する有機高分子をコーティングしたビーズ等、任意の形状で良いが、製造適性の点からは、円、正方形、円筒状、巻物状等の対称性の高い形状及びビーズが好ましい。

容器は、通常、固相を収容する本体と、蓋体に分けた態様で作製され、いずれにも少なくとも１個の開口が設けられている。開口は核酸を含有する試料溶液、洗浄液及び固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液（以下、「試料溶液等」と記す。）の入口及び出口として使用され、又、容器内を減圧又は加圧状態にせしめうる圧力差発生装置に接続される。本体の形状に特に限定はないが、製造が容易で、試料溶液等が固相の全面に拡散し易くするには、断面を円形にすることが好ましい。断面を四角形にすることも、固相の裁断屑を発生させないために好ましい。

前記蓋は、圧力差発生装置によって容器内部を減圧及び加圧状態にできるように本体に接合されている必要があるが、この状態が達成できれば、接合方法は任意に選択できる。例えば、接着剤の使用、ねじ込み、はめ込み、ネジ止め、超音波加熱による融着等が挙げられる。

容器の内容積は処理すべき試料溶液の量のみによって決められるが、通常、収容される固相の体積で表す。即ち、厚さが約１ｍｍ以下（例えば、５０〜５００μｍ程度）で、直径が約２ｍｍ〜２０ｍｍの固相を１枚〜６枚程度収容する大きさとすることが好ましい。

固相の端面は、試料溶液等が通過しない程度に、容器の内壁面に密着させることが好ましい。

試料溶液等の入り口に使用される開口に対向する固相の下は、容器の内壁に密着させずに空間を設け、試料溶液等が固相の全面にできるだけ均等に拡散する構造にする。

圧力差発生装置に結合される開口に対向する固相の上には、ほぼ中央に穴を穿った部材を設けることが好ましい。この部材は、固相を押さえると共に、試料溶液等を効率よく排出する効果を有するものであり、液が中央の穴に集まる様に、漏斗状あるいはお椀状等の斜面を有する形状にすることが好ましい。この穴の大きさ、斜面の角度、部材の厚さは、処理する試料溶液等の量や固相を収容する容器の大きさ等を考慮して、当業者が適宜定めることができる。この部材と当該開口の間には、オーバーフローした試料溶液等を溜めて、圧力差発生装置内に吸引されることを防ぐための空間を設けることが好ましい。この空間の大きさも当業者が適宜選択することができる。なお、核酸を効率良く集めるためには、固相の全体が浸る以上の量の核酸を含む試料溶液を吸引することが好ましい。

また、吸引している開口の真下の部分にのみ試料溶液等が集中することを防いで、試料溶液等が固相内を比較的均一に通過できるようにするため、固相とこの部材の間にも空間を設けることが好ましい。このためには、当該部材から固相に向けて複数の突起物を設けることが好ましい。突起物の大きさや数は当業者が適宜選択することができるが、空間を保持しながら固相の開口面積をできる限り大きく保つことが好ましい。

なお、容器に３以上の開口を設けた場合には、減圧及び加圧操作に伴う液の吸引及び排出を可能にすべく、余分の開口を一時的に封鎖する必要があることはいうまでもない。

圧力差発生装置は、まず固相を収容した容器内を減圧にして核酸を含む試料溶液を吸引する。圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような吸引及び加圧が可能なポンプ等が挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、前記容器の一の開口に着脱可能に結合されている。

次に、前記した核酸分離精製ユニットを使用した、核酸の精製方法について説明する。

本発明の核酸の分離精製方法では、好ましくは、少なくとも２個の開口を有する容器内に前記固相を収容した核酸分離精製カートリッジを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。

さらに好ましくは、前記した(ａ) 前記固相、(ｂ) 該固相を収容する少なくとも２個の開口を有する容器、及び(ｃ) 該容器の一の開口に結合された圧力差発生装置を含む核酸分離精製ユニットを用いて核酸の吸着及び脱着を行うことができる。

この場合、本発明の核酸分離精製方法の第一実施態様は、以下の工程を含むことができる。
(ａ) 試料（細菌または細胞）に分散液を加える工程、
(ｂ) 上記（ａ）で得られた溶液にアルカリ溶液を加えて試料を溶解する工程、
(ｃ) 上記（ｂ）で得られた溶液に中和液を加えて目的とする核酸以外の不要物を沈殿せしめる工程、
(ｄ) 上記（ｃ）で得られた沈殿上清に溶解液を加える工程、
(ｅ) 上記（ｄ）で得られた溶液に水溶性有機溶媒を添加し試料溶液（固相に核酸を吸着させる溶液）を調製する工程
(ｆ) 上記試料溶液に核酸分離精製ユニットの一の開口を該試料溶液中に挿入する工程、
(ｇ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして固相に核酸を吸着させる溶液を吸引し、固相に接触させる工程、
(ｈ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引された固相に核酸を吸着させる溶液を容器外に排出する工程、
(ｉ) 核酸分離精製ユニットの一の開口を洗浄液に挿入する工程、
(ｊ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして洗浄液を吸引し、固相に接触させる工程、
(ｋ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、吸引された洗浄液を容器外に排出する工程、
(ｌ) 核酸分離精製ユニットの一の開口を、固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液（回収液）中に挿入する工程、
(ｍ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を減圧状態にして、固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液を吸引し、固相に接触させる工程、及び
(ｎ) 核酸分離精製ユニットの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液を容器外に排出する工程。
（ｇ）、（ｊ）、（ｍ）の際に、固相のほぼ全体と接触する量の溶液を吸引することが好ましいが、圧力差発生装置内に吸引すると装置を汚染するので、適量に調整する。適量の溶液を吸引後、圧力差発生装置を用いてユニットの容器内を加圧して、吸引した液を排
出する。この操作までに間隔を開ける必要はなく、吸引後直ちに排出してもよい。

本発明の核酸分離精製方法の第二実施態様は、以下の工程を含むことができる。
(ａ) 試料（細菌または細胞）に分散液を加える工程、
(ｂ) 上記（ａ）で得られた溶液にアルカリ溶液を加えて試料を溶解する工程、
(ｃ) 上記（ｂ）で得られた溶液に中和液を加えて目的とする核酸以外の不要物を沈殿せしめる工程、
(ｄ) 上記（ｃ）で得られた沈殿上清に溶解液を加える工程、
(ｅ) 上記（ｄ）で得られた溶液に水溶性有機溶媒を添加し試料溶液（固相に核酸を吸着させる溶液）を調製する工程
(ｆ) 上記試料溶液を核酸分離精製ユニットの一の開口に注入する工程、
(ｇ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した固相に核酸を吸着させる溶液を他の開口より排出することによって、固相に接触させることで、核酸を固相に吸着させる工程、
(ｈ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に洗浄液を注入する工程、
(ｉ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した洗浄液を前記他の開口より排出することによって、固相に接触させることで、固相を洗浄する工程、
(ｊ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に固相に吸着された核酸を脱着せしめうる液（回収液）を注入する工程、
(ｋ) 核酸分離精製ユニットの前記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いて容器内を加圧状態にし、注入した核酸を脱着せしめうる液を前記他の開口より排出させることによって、固相に吸着された核酸を脱着させ、容器外に排出する工程。

前記の工程において、試料溶液を容器に注入するには、限定はなく、ピペットやスポイトなどの実験用器具を使用するのが好ましい。これらの器具が、ヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーであれば、より好ましい。
試料と各液を混合する方法は、特に限定されない。例えば、混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる。

上記した（ｉ）核酸分離精製カ−トリッジと、（ｉｉ）複数の酵素と、（ｉｉｉ）カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、核酸安定化剤、緩衝剤、酸およびアルカリ剤の少なくともいずれかを含む前処理液並びに水溶性有機溶媒と、（ｉｖ）洗浄液と、（ｖ）回収液の試薬とをキットとすることが出来る。

以下に、少なくとも二個の開口を有する容器内に前記固相を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力差発生装置を用いて、核酸を含む試料から核酸を分離精製する工程を自動で行う自動で行う自動装置の例を示すが、自動装置はこれに限定されるものではない。

自動装置は、溶液が内部を通過可能な、核酸を吸着する固相を収容した核酸分離精製カートリッジを用い、該核酸分離精製カートリッジに固相に核酸を吸着させる溶液（試料溶液）を注入し加圧して該試料溶液中の核酸を前記固相に吸着させた後、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去した後、前記核酸分離精製カートリッジに、回収液を分注し固相に吸着した核酸を脱着して回収液とともに回収する、分離精製動作を自動的に行う核酸分離精製装置であって、前記核酸分離精製カートリッジ、前記試料溶液および洗浄液の排出液を収容する廃液容器および前記核酸を含む回収液を収容する回収容器を保持する搭載機構と、前記核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する
加圧エア供給機構と、前記核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備えてなることを特徴とするものである。

前記搭載機構は、装置本体に搭載されるスタンドと、該スタンドに上下移動可能に支持され前記核酸分離精製カートリッジを保持するカートリッジホルダーと、該カートリッジホルダーの下方で前記核酸分離精製カートリッジに対する位置を交換可能に前記廃液容器および前記回収容器を保持する容器ホルダーとを備えてなるものが好適である。

また、前記加圧エア供給機構は、下端部より加圧エアを噴出するエアノズルと、該エアノズルを支持して前記カートリッジホルダーに保持された前記核酸分離精製カートリッジに対し前記エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、該加圧ヘッドに設置され前記搭載機構のラックにおける核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えてなるものが好適である。

また、前記分注機構は、前記洗浄液を分注する洗浄液分注ノズルと、前記回収液を分注する回収液分注ノズルと、前記洗浄液分注ノズルおよび前記回収液分注ノズルを保持し前記搭載機構に保持された核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液を収容した洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し前記洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液を収容した回収液ボトルより回収液を吸引し前記回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えてなるものが好適である。

前記のような自動装置によれば、核酸分離精製カートリッジ、廃液容器および回収容器を保持する搭載機構と、核酸分離精製カートリッジに加圧エアを導入する加圧エア供給機構と、核酸分離精製カートリッジに洗浄液および回収液を分注する分注機構とを備え、前記固相部材を備えた核酸分離精製カートリッジに固相に核酸を吸着させる溶液を注入加圧し核酸を該固相部材に吸着させた後、洗浄液を分注して不純物を洗浄排出した後、回収液を分注して該固相膜部材に吸着した核酸を分離して回収する核酸分離精製方法における各工程を自動的に行って短時間で効率よく試料溶液の核酸を自動的に分離精製できる機構をコンパクトに構成することとができる。

また、前記搭載機構を、スタンドと、核酸分離精製カートリッジを保持する上下移動可能なカートリッジホルダーと、廃液容器および回収容器を交換可能に保持する容器ホルダーとを備えて構成すると、核酸分離精製カートリッジおよび両容器のセット並びに廃液容器と回収容器の交換が簡易に行える。

また、前記加圧エア供給機構を、エアノズルと、該エアノズルを昇降移動させる加圧ヘッドと、核酸分離精製カートリッジの位置決めをする位置決め手段とを備えて構成すると、簡易な機構で確実な加圧エアの供給が行える。

また、前記分注機構を、洗浄液分注ノズルと、回収液分注ノズルと、核酸分離精製カートリッジ上を順に移動可能なノズル移動台と、洗浄液ボトルより洗浄液を吸引し洗浄液分注ノズルに供給する洗浄液供給ポンプと、回収液ボトルより回収液を吸引し回収液分注ノズルに供給する回収液供給ポンプとを備えて構成すると、簡易な機構で順次洗浄液および回収液の分注が行える。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（１） 核酸分離精製カートリッジの作成
内径７ｍｍ、多孔膜の固相を収容する部分を持つ核酸分離精製カートリッジをハイインパクトポリスチレンで作成した。

（２） 多孔膜として、トリアセチルセルロースの多孔膜を鹸化処理した多孔膜（孔径２．５μｍ、直径７ｍｍ、厚さ１００μｍ、鹸化率９５％）を使用し、前記（１）で作成した核酸分離精製カートリッジの固相収納部に収容した。

（３） 分散液、アルカリ溶液、中和液、溶解液、洗浄液および回収液の調製
下記に示す処方の、プラスミドＤＮＡ分離精製用の分散液、アルカリ溶液、中和液、溶解液、洗浄液および回収液を調製した。

［分散液（プラスミドＤＮＡ分離精製用）]
１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸塩 （和光純薬製） ２６ｇ
０．５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ （和光純薬製） １１g
蒸留水 ４６５ｇ

［アルカリ溶液（プラスミドＤＮＡ分離精製用）]
１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ（和光純薬製） １０４g
１０質量％ ＳＤＳ （和光純薬製） ５０ｇ
蒸留水 ３５０ｇ

［中和液（プラスミドＤＮＡ分離精製用）]
酢酸カリウム（和光純薬製） １４７g
酢酸 （和光純薬製） ６８ｇ
蒸留水 ３５６ｇ

［溶解液（プラスミドＤＮＡ分離精製用）]
Ｔｗｅｅｎ−２０（ＩＣＮ薬製） ３９ｇ
ＢｉＳ−Ｔｒｉｓ （和光純薬製） ３.４ｇ
エタノ−ル（９９．５％）（和光純薬製） ３４４ｍｌ
蒸留水 １０４ｍｌ

［洗浄液（プラスミドＤＮＡ分離精製用）]
１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸 （和光純薬製） ５.６ｇ
エタノ−ル（９９．５％）（和光純薬製） ４００ｍｌ
蒸留水 ９４ｇ

［回収液（プラスミドＤＮＡ分離精製用）]
１ｍｏｌ／Ｌ トリス塩酸 （和光純薬製） ５.２ｇ
蒸留水 ４９４ｇ

（４） 大腸菌ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIＳＫ（−）／ＤＨ５αからのプラスミドＤＮＡの抽出
（ｉ）大腸菌ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIＳＫ（−）／ＤＨ５αの調製
プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ IIＳＫ（−）（ストラタジーン製）で形質転換された大腸菌ＤＨ５α形質転換体（ｐＢｓ II（−）／ＤＨ５αと表記）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地［１０ｇ／L トリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）］１００ｍｌに植菌し、培養温度３７℃、振とう速度２２０ｍｉｎ‐¹で１５時間培養した。培養後、培養液を１．０ｍｌずつヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーの１．５ｍＬマイクロチューブ（プラチナチューブ ＢＭ機
器製）に分注し、高速微量冷却遠心分離機（ＭＸ−３００：トミー精工製）にて６０００×ｇ、１５分間遠心分離し、上清を除去することにより得られた菌体を抽出材料とした。

（ｉｉ）プラスミドＤＮＡの分離精製
上記（ｉ）にて調製した菌体に前記（３）で調製した分散液１００μＬにＲＮａｓｅＡ
１０ｍｇ／ｍｌ（和光純薬製）溶液３μＬ、ＲＮａｓｅＴ１ １ｍｇ／ｍｌ（シグマ製）溶液１μＬをそれぞれ添加して室温で１５秒間ボルテックスすることにより攪拌して確実に菌体を分散させた。続いて、前記（３）で調製したアルカリ溶液１００μＬを加えた後転倒混和を５回行い、菌体を溶菌させた。引き続いて前記（３）で調製した中和液１４０μＬを加えた後転倒混和を５回行い、試料溶液を中和した。沈殿残渣を高速微量冷却遠心分離機（ＭＸ−３００：トミー精工製）にて１８０００×ｇ、１０分間遠心分離し、上清を３３０μｌ回収した。新しいヌクレアーゼフリーかつパイロジェンフリーの１．５ｍＬマイクロチューブ（プラチナチューブ ＢＭ機器製）に前記（３）で調製した溶解液３２０μＬをあらかじめ添加しておき、その容器に前記上清を添加後、３０秒間ボルテックスにより攪拌し、試料溶液とした。
続いてこの試料溶液をそれぞれ前記（２）で作成した多孔膜の固相を有する核酸分離精製カートリッジの一の開口に注入し、続いて前記一の開口に圧力差発生装置（チュウビングポンプ）を結合し、核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した溶液を多孔膜の固相に通過させることで、多孔膜の固相に接触させ、核酸分離精製カートリッジの他の開口より排出した。続いて、前記核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に、上記（３）で調製した洗浄液を注入し、前記一の開口にチュウビングポンプを結合し、核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した洗浄液を、多孔膜の固相に通過させ、他の開口より排出した。続いて、前記核酸分離精製カートリッジの前記一の開口に上記（３）で調製した回収液を注入し、核酸分離精製カートリッジの前記一の開口にチュウビングポンプを結合して核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態（８０ｋｐａ）にし、注入した回収液を、多孔膜の固相に通過させ、他の開口より排出し、この液を回収した。この核酸分離精製操作（核酸を含む試料溶液を前記のカートリッジに注入してから回収するまで）に要した時間は６分であった。

比較例として、以下を行った。
・上記（ｉ）にて調製した菌体をＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉを用い、該キットのプロトコルに従って、分離精製操作を行い、核酸を含む回収溶液を得た。
・上記（ｉｉ）において、ＲＮａｓｅＡ(和光純薬製)のみを分散液に添加して、分離精製操作を行い、核酸を含む回収溶液を得た。
・上記（ｉｉ）において、ＲＮａｓｅＴ１(シグマ製)のみを分散液に添加して、分離精製操作を行い、核酸を含む回収溶液を得た。

（５）核酸の回収量の定量
上記の実施例で回収したそれぞれの回収溶液について、ＤＮＡの電気泳動の結果を図１に示す。このときの電気泳動の条件は以下のとおりである。
1%agarose/1xTAE buffer, EtBr染色 35分泳動
Sample２μL+Loading buffer１μL→３μL全量アプライ

また、２６０ｎｍにおける吸光度を表１に示す。

上記表中の符号は以下を表す
Ｑ：QIAGEN QIAprep miniにて抽出
１：ＲＮaseA(和光純薬製)のみを分散液に添加
２：ＲＮaseT1(シグマ製)のみを分散液に添加
３：ＲＮaseA(和光純薬製)＋ＲＮaseT1(シグマ製)を分散液に添加

図１の電気泳動および上記表１の結果から明らかなように、本発明例（３レーン）は、宿主由来ＲＮＡのコンタミネーションが少ないプラスミドＤＮＡを精製することができ、比較例としてＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｐｒｅｐ ｍｉｎｉにて抽出したサンプル（Ｑレーン）、単一酵素のみを用いた従来法（１，２レーン）との比較より、明らかに純度の高いゲノムＤＮＡを得ることが出来る。すなわち、本発明の方法により、分離性能に優れ、洗浄効率が良いために、前記した時間で迅速に、高収量でかつ高純度でプラスミドＤＮＡを得ることができた。

本発明の方法に従って分離精製した核酸および分子量マーカーを電気泳動して得られた写真である。

符号の説明

Ｍ：分子量マーカー Invitrogen 1kb DNA Ladder
Ｑ：QIAGEN QIAprep miniにて抽出
１：ＲＮaseA(和光純薬製)のみを分散液に添加
２：ＲＮaseT1(シグマ製)のみを分散液に添加
３：ＲＮaseA(和光純薬製)＋ＲＮaseT1(シグマ製)を分散液に添加

Claims (15)

1. （１）核酸を含む試料溶液を固相に接触させて、該固相に核酸を吸着させる工程、
   （２）洗浄液を該固相に接触させて、核酸が吸着した状態で該固相を洗浄する工程、及び（３）回収液を該固相に接触させて、該固相から核酸を脱着させる工程
   を含有する核酸分離精製方法において、
   上記試料溶液を、異なる複数の酵素を添加する工程を含んで調製することを特徴とする核酸の分離精製方法。
2. 酵素が、核酸分解酵素であることを特徴とする請求項１に記載の核酸の分離精製方法。
3. 核酸分解酵素が、ＲＮＡ分解酵素であることを特徴とする請求項１または２に記載の核酸の分離精製方法。
4. ＲＮＡ分解酵素が、ＲＮａｓｅＴ１およびＲＮａｓｅＡであることを特徴とする請求項３に記載の核酸の分離精製方法。
5. 試料溶液が、核酸を含む試料に、カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、核酸安定化剤、緩衝剤、酸およびアルカリ剤から選ばれる少なくとも１つを含む前処理液を添加し、さらに水溶性有機溶媒を添加して調製されることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
6. 固相が膜形状であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
7. 水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノールから選ばれる少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
8. 固相が、シリカもしくはその誘導体、珪藻土、又はアルミナを含有することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
9. 固相が、有機高分子を含有することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の核酸の分離精製方法。
10. 固相が、テフロン（登録商標）、ポリエステル、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ポリアクリレート共重合体、ポリウレタン、ポリベンズイミダゾール、ポリオレフィン、ポリ塩化ビニルおよびポリ弗化ビニリデンから選ばれる少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする請求項９に記載の核酸の分離精製方法。
11. 固相が、正もしくは負の荷電をもったナイロンを含むことを特徴とする請求項９に記載の核酸の分離精製方法。
12. 有機高分子が、多糖構造を有することを特徴とする請求項９に記載の核酸の分離精製方法。
13. 有機高分子が、セルロース、セルロース混合エステル、硝酸セルロース、酢酸セルロースおよびニトロセルロースから選ばれる少なくともいずれか１つを含むことを特徴とする請求項９に記載の核酸の分離精製方法。
14. 請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法における工程を自動で行う装置。
15. （ｉ）核酸分離精製カ−トリッジと、（ｉｉ）複数の酵素と、（ｉｉｉ）カオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、核酸安定化剤、緩衝剤、酸およびアルカリ剤の少なくともいずれかを含む前処理液並びに水溶性有機溶媒と、（ｉｖ）洗浄液と、（ｖ）回収液の試薬とを含む請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸の分離精製方法を行うためのキット。