CN101111597A - 分离和纯化核酸的方法 - Google Patents

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驹泽宏幸
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Abstract

一种分离和纯化核酸的方法，该方法包括：(1)将含有核酸的样品溶液与固相接触，从而使核酸吸附到所述固相上的步骤；(2)将洗涤液与所述固相接触，从而在所述核酸被吸附在所述固相上的状态下洗涤该固相的步骤；以及(3)将回收液与所述固相接触，从而使核酸从所述固相上解吸附的步骤，其中，所述样品溶液是通过包括加入至少两种酶的步骤的方法制得的。

Description

分离和纯化核酸的方法
技术领域
本发明涉及广泛用在重组核酸技术领域中的用于分离和纯化质粒DNA的方法。
背景技术
在许多情况下，仅仅可获得极微量的核酸，并且除此以外，分离和纯化的操作比较复杂，而且需要花费大量的时间。这种通常需要花费大量时间的复杂操作往往会导致核酸的损失。常规的方法包括将所需DNA引入大肠杆菌质粒载体并在载体内对其培养，因此制备大量所需DNA是重组核酸技术领域中经常进行的一种操作。在目前阶段，通过以下方法来实施从E.coli中对质粒DNA的回收：在进行裂解操作后，通过碱性-SDS法除去基因组DNA、蛋白质等，从而获得RNA和质粒DNA的混合物，并且通常使用(例如)柱分离法(使用离子交换树脂)或者氯化铯密度梯度超离心法从RNA和质粒DNA的混合物中获得经纯化的质粒DNA。然而，在使用离子交换树脂的柱分离法中，所需质粒DNA经大量的洗脱液稀释。结果，需要对洗脱后的质粒DNA进行浓缩，并且这需要进行复杂的操作。此外，在氯化铯密度梯度超离心法中，离心处理用大型装置高速旋转长时间来进行。结果，应当细心注意，并且该处理也较复杂，而且是不经济的。
另一方面，作为简单、高效的分离和纯化核酸的方法，报导有这样一种核酸分离纯化方法：使用用来使核酸吸附到固相上的溶液和用来使核酸从固相上解吸附的溶液，分别使核酸吸附到固相上，并使其解吸附，其中，所述固相在其表面上含有带羟基的有机聚合物(JP-A-2003-128691)。
发明内容
然而，在JP-A-2003-128691中提出的技术不能在从E.coli中纯化质粒的过程中充分地去除所包含的RNA，并且所回收的质粒的纯度较低。鉴于此，在实施从含有RNA和质粒DNA的溶液中分离和纯化质粒DNA的方法时，对于许多样品来说，都需要高收率高纯度地快速回收所需的质粒DNA。
本发明的目的是要提供分离和纯化核酸的方法，该方法包括使含有RNA和质粒DNA的样品溶液吸附到固相表面上，并且通过洗涤等将核酸从固相解吸附，从而以高收率快速得到高纯度的质粒DNA。
作为为克服常规技术中的问题而进行的深入研究的结果，本发明人已发现：通过将由包括加入多种不同的酶的步骤的方法制备的样品溶液(即，含有预先加入的多种核酸酶的样品溶液)吸附到固相上可以高收率、高纯度地快速回收所需的核酸(质粒DNA)。特别是，本发明已经证实：通过使用包含有机聚合物的固相可以显著地提高所需核酸的收率和纯度，其中，所述有机聚合物是通过使醋酸纤维素或者乙酰值互异的醋酸纤维素的混合物皂化制得的。基于上述发现而完成本发明。
根据本发明，提供这样一种分离和纯化所需核酸(质粒DNA)的方法，该方法分别使用用于吸附含有所需核酸(质粒DNA)的样品溶液中的所需核酸的溶液和用于使核酸从固相上解吸附的溶液，其中，所述样品溶液是通过以上样品溶液的制备方法制得的。
本发明通过以下内容实现上述目的。
1.一种分离和纯化核酸的方法，所述方法包括：
(1)将含有核酸的样品溶液与固相接触，从而使所述核酸吸附到固相上的步骤；
(2)将洗涤液与所述固相接触，从而在所述核酸被吸附在所述固相上的状态下洗涤固相的步骤；和
(3)将回收液与所述固相接触，从而使所述核酸从固相上解吸附的步骤；
其中，所述样品溶液是通过包括加入至少两种酶的步骤的方法制备的。
2.如以上1所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述至少两种酶包含至少一种核酸降解酶。
3.如以上2所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述至少一种核酸降解酶为至少一种RNA降解酶。
4.如以上3所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述至少一种RNA降解酶包含RNase T1和RNase A。
5.如以上1至4中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述样品溶液是通过向其中加入预处理液、并且还加入水溶性有机溶剂制得的，所述预处理液含有选自离液盐、表面活性剂、消泡剂、核酸稳定剂、缓冲剂、酸剂和碱剂中的至少一种。
6.如以上1至5中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法，
其中所述固相为膜状固相。
7.如以上1至6中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述水溶性有机溶剂含有选自甲醇、乙醇、丙醇及其异构体和丁醇及其异构体中的至少一种。
8.如以上1至7中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述固相包含二氧化硅或其衍生物、硅藻土或者氧化铝。
9.如以上1至8中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法，
其中所述固相包含有机聚合物。
10.如以上9所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述固相包含选自Teflon(注册商标)、聚酯、聚醚砜、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯共聚物、聚氨酯、聚苯并咪唑、聚烯烃、聚氯乙烯和聚偏氟乙烯中的至少一种。
11.如以上9所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述固相包含带正电荷或负电荷的尼龙。
12.如以上9所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述有机聚合物具有多糖结构。
13.如以上9所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述有机聚合物包含选自纤维素、纤维素混合酯、硝酸纤维素、醋酸纤维素和硝化纤维素中的至少一种。
14.一种装置，该装置用于自动实施如以上1至13中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法中的步骤。
15.一种成套用具，该成套用具用于实施如以上1至13中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法，所述成套用具包括：
(i)核酸分离纯化柱；
(ii)至少两种酶；
(iii)预处理液，其含有选自离液盐、表面活性剂、消泡剂、核酸稳定剂、缓冲剂、酸剂和碱剂、和水溶性有机溶剂中至少一种；
(iv)洗涤液；以及
(v)回收液试剂。
附图简要说明
图1是对根据本发明的方法分离和纯化的核酸和分子量标记进行电泳而得到的电泳照片，
其中M表示分子量标记，Invitrogen 1kb DNA Ladder；Q表示使用QIAGEN QIAprep mini提取；1表示仅向分散液中加入RNase A(Wako Pure Chemical Industries有限公司的产品)；2表示仅向分散液中加入RNase T1(Sigma公司的产品)；3表示向分散液中加入RNase A(Wako Pure Chemical Industries有限公司的产品)和RNaseT1(Sigma公司的产品)。
本发明的最佳实施方式
以下将详细地描述根据本发明的核酸分离和纯化方法。
样品溶液的制备
本发明中使用的含有核酸的样品包括细菌或细胞。
对能够使用的细菌或细胞并不特别限定，只要其是含有质粒DNA的那些即可。
在本发明中，样品中所含的“核酸”可以为环形和直链中的任何一种，可以为单链和双链中的任何一种，并可以为DNA和RNA中的任何一种。对所用核酸的分子量并没有任何限定。此外，作为所需核酸的质粒DNA可以是双链(ds)质粒DNA或单链(ss)噬菌体DNA，并且还对其分子量没有任何限定。
本文中所使用的样品是指任选的含有核酸的样品。样品中核酸的种类可以是一种或多种(两种或多种)。对单个核酸的长度没有特别限定。例如，可以使用具有任选长度(例如，从几bp到几Mbp)的核酸。从操作性能来说，核酸的长度通常为几bp到几百kbp。
在本发明的方法中，使由细菌或细胞制备的含有核酸的样品溶液与固相接触，从而使样品溶液中的核酸吸附到固相上，然后使吸附到固相上的核酸从固相上解吸附。
如上所述，在本发明的方法中，通过包括加入多种不同酶的步骤的方法制备样品溶液，并且使其作为具有多种先前加入的核酸酶的样品溶液吸附到固相上，由此分离和纯化所需核酸(质粒DNA)。
优选的是，通过加入预处理液、并还加入水溶性有机溶剂来制备所述样品溶液，其中，所述预处理液含有选自离液盐、表面活性剂、消泡剂、核酸稳定剂、缓冲剂、酸剂和碱剂中的至少一种。
更优选的是，通过以下的方法制备所述样品溶液：
使用分散液分散细菌或细胞；
加入碱性液以溶解细菌或细胞；
加入中和液；
除去沉淀成分；
向所得沉淀的上清液中加入裂解液；并且
加入水溶性有机溶剂。
所述分散液可含有选自核酸稳定剂和缓冲剂中的至少一种。
所述碱性液含有碱剂以及选自表面活性剂、消泡剂和缓冲剂中的至少一种。加入碱性液能够使分散液所分散的溶液中的细菌或细胞以及核酸溶解。结果，构成细胞的结构被溶解，并且可以将核酸分散在样品溶液中。所用的碱性液包括氢氧根离子浓度为0.1到5摩尔/升的碱金属类似物的水溶液。另一方面，可以利用蛋白质耐热性差、而核酸(如，DNA)耐热性较强的特性，使用热改性法来代替碱性液法。在使用热改性法的情况下，加热条件优选的是：加热温度为80℃到100℃，并且加热时间为5到20分钟。在加入碱性液的情况下，可以单独使用热改性法或者将两种方法组合使用。
中和液含有酸和选自离液盐、表面活性剂、消泡剂、核酸稳定剂、缓冲剂和碱金属类似物中的至少一种。中和液优选通过加入矿物酸和无机盐而起到对加入碱性液后所得的碱性裂解物酸化的作用。所述酸优选为乙酸。对本发明而言，酸的浓度并不重要并且可以变动。对酸可以使用任何无机盐，只要其在水中溶解即可。优选的无机盐是其阴离子与酸的阴离子相同的盐。例如，在使用乙酸的情况下，无机盐优选为碱金属乙酸盐或碱土金属乙酸盐，特别优选为乙酸钾。使用酸充分地将pH降低至优选为4.0到6.5，更优选为4.5到6.0的酸性范围。盐的浓度的变化也可以与酸的浓度类似，但由于以下原因，优选盐的浓度较高。在所得溶液具有高离子浓度的情况下，这种溶液有助于染色体DNA和其它杂质的沉淀，并且这使得容易分离质粒DNA和这些杂质。盐的浓度最优选为1.0摩尔/升到10摩尔/升(基于一碱价盐)。
所述裂解液含有选自离液盐、表面活性剂、消泡剂、核酸稳定剂、缓冲剂、碱金属类似物和水溶性有机溶剂中的至少一种。
并不希望的是，在通过用分散液分散所得的溶液中保留未分散的细胞。优选的是，在分散细菌或细胞时，使用涡旋、轻敲、翻转混合等方法将其均匀分散。
酶
多种不同的酶可以在任何时候加入。例如，可以将这些酶加入到任何上述溶液中。此外，除了上述溶液外，可以在制备样品溶液的任何时刻加入这些酶。
例如，可以将RNA降解酶溶液加入到通过加入裂解液制备的溶液中，从而预先降解不需要的RNA。
通过将特定的DNA降解酶溶液加入到通过裂解液制备的溶液中还可以降解不需要的DNA(如，染色体基因组DNA)。此外，通过将特定的DNA降解酶溶液加入到含有待回收的所需核酸的溶液中可以降解不需要的DNA(如，染色体基因组DNA)。
本发明中所用的酶的实例包括蛋白质降解酶、核酸降解酶和胞壁质酶。
对蛋白质降解酶没有特别限定，并且例如，可以优选使用碱性蛋白酶。
对核酸降解酶没有特别限定，并且例如，可以优选使用RNA降解酶。
对RNA降解酶没有特别限定，并且例如，从酶活性和稳定性上来说，可以优选使用RNase A或RNase T1。
可以优选使用的DNA降解酶的例子包括APT依赖性核酸外切酶(商品名：Plasmid-Safe，位于美国威斯康星州Madison市的Epicenter technologies公司的产品)和单链的特异性核酸外切酶。这些酶特异性地酶切线性DNA(例如基因组DNA)，但却不会酶切超螺旋状质粒DNA。
对胞壁质酶没有特别限定，并且例如，可以优选使用溶菌酶。
本发明使用多种不同的酶。所用的酶优选为核酸降解酶，并且在这些核酸降解酶中，RNA降解酶是更优选的。作为多种不同的酶，特别优选使用作为RNA降解酶的RNase A和RNase T1。
所述酶可各自单独使用，或者以各种酶混合物的方式使用。
样品溶液中酶的浓度优选为加入时每1毫升样品溶液总体积0.001到10IU，更优选为0.1到1IU。可供选用的另外一种方式是，可以按照作用浓度为0.05到20mg/mL的浓度使用样品溶液。
为了稳定地保持酶的作用效果，可以将缓冲剂加入到样品溶液中。在这种情况下，(例如)可以加入的Tris-HCl的量为1到200毫摩尔/升。
还可以优选使用不含核酸降解酶的蛋白质降解酶或者胞壁质酶。
另外，可以优选使用含有蛋白降解酶稳定剂的酶。可优选使用的稳定剂是金属离子。所述金属离子的例子包括镁离子和钙离子。这些离子可以分别以(例如)氯化镁和醋酸钙的形式加入。含有蛋白质降解酶稳定剂可以极大地降低回收核酸所需的蛋白降解酶的量，由此，可以减少回收核酸所需的费用。蛋白质降解酶的溶液可含有缓冲剂或多元醇。例如，可以按照0.1到200毫摩尔/升的量加入作为缓冲剂的Tris-HCl，或者可以按照1％到70％的量加入作为多元醇的甘油。这些缓冲剂和多元醇可以各自单独使用或者以其两种或多种的混合物的方式使用。
表面活性剂
本发明中使用的表面活性剂的例子包括非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂。
在这些之中，可以优选使用阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂。
阴离子表面活性剂的例子包括硫酸酯类表面活性剂、磺酸类表面活性剂、羧酸类表面活性剂和磷酸类表面活性剂。优选使用烷基硫酸酯盐，并且更优选使用十二烷基硫酸钠。优选的是，可以将表面活性剂包含在碱性液中，以便促进细菌或细胞的溶解。
非离子表面活性剂的例子包括聚氧化亚乙基烷基苯基醚类表面活性剂、聚氧化亚乙基烃基醚类表面活性剂和脂肪酸烷醇酰胺。在这些之中，优选使用聚氧化亚乙基烃基醚类表面活性剂。在上述聚氧化亚乙基(此后为了简便，有时也称作“POE”)烃基醚类表面活性剂中，更优选的例子包括POE癸醚、POE月桂基醚、POE十三烷基醚、POE亚烷基癸醚、POE失水山梨糖醇单月桂酸酯、POE脱水山梨糖醇单油酸酯、POE脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、四油酸聚氧乙烯山梨糖醇、POE烷基胺和POE炔二醇。
这些表面活性剂可以单独使用或者以其两种或多种的混合物的方式使用。碱性液、中和液和裂解液中的表面活性剂的浓度优选为0.1质量％到30质量％(在本说明书中，质量％相当于重量％)。
缓冲剂
本发明中使用的缓冲剂的例子包括常规使用的pH缓冲剂。优选的pH缓冲剂为生物化学用的pH缓冲剂。生物化学用的pH缓冲剂的例子包括含有柠檬酸盐、磷酸盐或者醋酸盐的缓冲剂、Tris-HCl、TE(Tris-HCl/EDTA)、TBE(Tris-硼酸盐/EDTA)、TAE(Tris-乙酸盐/EDTA)和Good’s缓冲剂。Good’s缓冲剂的例子包括MES(2-吗啉代乙磺酸)、Bis-Tris(双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷)、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、PIPES(哌嗪基-1，4-双(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)和TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)。
分散液、碱性液、中和液、裂解液、洗涤液和回收液中的这些缓冲剂的浓度优选为1到300毫摩尔/升。
核酸稳定剂
本发明中使用的核酸稳定剂的例子包括具有使核酸酶活性失活的作用的化合物。例如，根据样品种类的不同，可能会在样品中含有降解核酸的核酸酶。在(例如)核酸被匀化的情况下，核酸酶对核酸发生作用，结果会使核酸的收率显著地降低。核酸稳定剂可以使样品中的核酸稳定地存在，并且这是优选的。
作为具有使核酸酶活性失活的作用的核酸稳定剂，可以使用通常被用作还原剂的化合物。所用还原剂的例子包括：氢；氢化物，如碘化氢、硫化氢、氢化铝锂或者硼氢化钠；高正电性金属，如碱金属、镁、钙、铝或者锌，或它们的汞合金；有机氧化物，如醛类、糖类、甲酸或者草酸；以及巯基化合物。在这些物质当中，优选使用巯基化合物。巯基化合物的例子包括：N-乙酰半胱氨酸、巯基乙醇和烷基硫醇。特别是，优选使用β-巯基乙醇。巯基化合物可以单独使用或以两种或多种的混合物使用。
在处理液中可使用的核酸稳定剂的浓度优选为0.1质量％到20质量％，并且更优选为0.3质量％到15质量％。
还可以将螯合剂用作具有使核酸酶活性失活的作用的核酸稳定剂。可使用的螯合剂的例子包括EDTA、NTA和EGTA。螯合剂可单独使用或以两种或者多种螯合剂的混合物使用。例如，可以按照1到300毫摩尔/升的作用浓度来使用EDTA。优选的是，可以将螯合剂包含于分散液中，从而起到使内源性核酸酶活性失活的作用。
碱金属类似物
本发明中所用的碱金属类似物的优选例子包括氯化物和乙酰化产物。更优选的是钠盐、钾盐和锂盐。可以使用在分散液、碱性液、中和液、裂解液、洗涤液和回收液中的碱金属类似物的浓度优选为0.01摩尔/升或者更高，并且更优选0.01到5摩尔/升。
消泡剂
本发明中所用的消泡剂的例子包括：有机硅类消泡剂(如，硅油、二甲基聚硅氧烷、有机硅乳液、改性聚硅氧烷或有机硅复合物)以及醇类消泡剂(如，炔二醇、庚醇、乙基己醇、较高级的醇或聚氧化亚烷基二醇)、醚类消泡剂(例如，庚基溶纤剂或壬基溶纤剂-3-庚基山梨糖醇)、油类和脂肪类消泡剂(动物油和植物油)、脂肪酸类消泡剂(例如，硬脂酸、油酸或棕榈酸)、金属皂类消泡剂(例如，硬脂酸铝或硬脂酸钙)、脂肪酸酯类消泡剂(如，天然蜡或磷酸三丁酯)、磷酸酯类消泡剂(例如，辛基磷酸钠)、胺类消泡剂(例如，二戊基胺)、酰胺类消泡剂(例如，硬脂酸酰胺)和其它消泡剂(例如，硫酸铁和矾土)。作为特别优选的消泡剂，可以将有机硅类消泡剂和醇类消泡剂中的两种成分组合使用。另外，作为醇类消泡剂，优选使用炔二醇类表面活性剂。碱性液、中和液、裂解液和样品溶液中使用的消泡剂的浓度优选为0到10质量％，并且更优选0.01质量％到5质量％。
离液盐
本发明中所用的离液盐的例子包括胍盐、异氰酸钠、碘化钠、碘化钾。在这些离液盐中，优选使用胍盐。胍盐的例子包括盐酸胍、异硫氰酸胍和硫氰酸胍。在这些中，优选使用盐酸胍。这些离液盐可以单独使用，或以两种或多种离液盐混合物的方式使用。中和液、裂解液或样品溶液中使用的离液盐的浓度优选为0.5摩尔/升，更优选为0.5到4摩尔/升，并且甚至更优选为1到3摩尔/升。
可以将脲用作离液物质，以代替离液盐。
水溶性有机溶剂
如上所述，通过加入预处理液，然后加入水溶性有机溶剂来制备样品溶液。使通过包括加入水溶性有机溶剂这一步骤的方法制备的样品溶液与固相接触。通过该操作，使样品溶液中的核酸吸附到固相上。为了吸附通过上述操作溶解的核酸，需要使水溶性有机溶剂与溶解的核酸混合液相混合，并且还需要所得样品溶液中存在盐。
换言之，通过破坏存在于核酸周围的水分子的水合结构使核酸溶解为不稳定状态。当处于这种状态的核酸和固相接触时，可以认为，核酸表面上的极性基团和固相表面(优选的是如下所述的固相表面)上的极性基团之间发生相互作用，由此，核酸吸附到固相表面上。根据本发明的方法，通过使水溶性有机溶剂与溶解的核酸混合液相混合并且使所得样品溶液中存在盐的步骤，使核酸处于不稳定状态。
水溶性有机溶剂的例子包括醇类、丙酮、乙腈和二甲基甲酰胺。在这些水溶性有机溶剂中，优选使用醇类。醇类可以是伯醇、仲醇和叔醇中的任意一种。在这些醇类中，优选使用甲醇、乙醇、丙醇及其异构体和丁醇及其异构体。
含有核酸的样品溶液中的水溶性有机溶剂的最终浓度优选为5质量％到90质量％，并且更优选为20质量％到60质量％。特别优选的是，加入的水溶性有机溶剂的浓度在不产生聚集的范围内尽可能地高。
所得样品溶液中存在的盐的优选例子包括各种离液物质(如胍盐、碘化钠或高氯酸钠)、氯化钠、氯化钾、氯化铵、溴化钠、溴化钾、溴化钙、溴化铵、乙酸钠、乙酸钾和乙酸铵。
样品溶液的pH优选为3到10，更优选为4到9，并且最优选为5到8。
所得样品溶液的表面张力优选为0.05J/cm2或者更低，粘度优选为1到10,000mPa，并且比重优选为0.8到1.2。制备具有这种物理性能的溶液具有以下优点。在下一个步骤中，在含有核酸的样品溶液穿过固相并且核酸吸附于固相上后，可以很容易地除去残留溶液。
固相
固相优选是通过基本不涉及离子键的相互作用来吸附核酸的固相。这意味着在使用条件下，固相侧没有发生“离子化”，并且可以推测：由于周围极性的改变，核酸和固相相互吸引。由此，可以以优异的分离性能以及优良的洗涤效率来分离和纯化核酸。可以推测：固相是具有亲水性基团的固相，并且由于周围极性的改变，核酸的亲水性基团和固相的亲水性基团相互吸引。
本文中所用的亲水性基团是指能与水发生相互作用的极性基团(原子团)，对应于所有参与吸附核酸的基团(原子团)。优选的是，亲水性基团是与水具有中等强度水平的相互作用的亲水性基团(参见由共立出版株式会社出版的《化学大词典》中所述的关于“亲水性基团”中的“亲水性不太强的基团”)。这种亲水性基团的例子包括羟基、羧基、氰基和氧乙烯基。在这些亲水性基团中，优选使用羟基。
本文所用的具有亲水性基团的固相是指这样的固相：形成固相的材料本身具有亲水性基团，或是指这样的固相：通过处理或涂敷将亲水性基团引入形成固相的材料中。在对形成固相的材料进行处理或涂敷的情况下，形成固相的材料可以为有机材料和无机材料中的任何一种。可使用的固相的例子包括：其中形成材料本身为具有亲水性基团的有机材料的固相；对不含亲水性基团的有机材料的固相进行处理，从而向其中引入亲水性基团的固相；通过用具有亲水性基团的材料对不含亲水性基团的有机材料的固相进行涂敷，从而向其中引入亲水性基团的固相；其中形成材料本身为具有亲水性基团的无机材料的固相；对不含亲水性基团的无机材料的固相进行处理，从而向其中引入亲水性基团的固相；和用具有亲水性基团的材料对不含亲水性基团的无机材料的固相进行涂敷，从而向其中引入亲水性基团的固相。从操作易于进行的角度考虑，优选使用有机材料(如有机聚合物)作为形成固相的材料。
具有亲水性基团的材料的固相可包括具有羟基的有机材料的固相。这种具有羟基的有机材料的固相的例子包括：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氧乙烯、聚酰胺(例如丙烯酰基涂敷的尼龙，该尼龙可以带正电荷，也可以带负电荷)、聚丙烯和具有多糖结构的有机聚合物。
可以优选使用的具有多糖结构的有机聚合物的例子包括纤维素、半纤维素、葡聚糖、琼脂糖、糊精、直链淀粉、淀粉精、淀粉、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、葡甘露聚糖、地衣淀粉、异地衣淀粉、昆布糖、角叉菜胶、木聚糖、果聚糖、褐藻酸、透明质酸、软骨素、甲壳素和壳聚糖。但是，有机聚合物并不限于上述材料，只要其具有多糖结构和多糖结构衍生物即可。也可以优选使用任何上述多糖结构的酯衍生物。此外，可优选使用任何上述多糖结构的酯衍生物的皂化产物。
优选的是，任何上述多糖结构的酯衍生物的酯选自羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯和焦磷酸酯中的至少一种。此外，可优选使用任何上述多糖结构的羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯和焦磷酸酯的皂化产物。
优选的是，任何上述多糖结构的羧酸酯选自烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳烷基羰基酯中的至少一种。此外，可优选使用任何上述多糖结构的烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳烷基羰基酯的皂化产物。
优选的是，任何上述多糖结构的烷基羰基酯的酯基选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、庚酰基、辛酰基、癸酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十六烷酰基和十八烷酰基中的至少一种。此外，可以优选使用具有选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、庚酰基、辛酰基、癸酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十六烷酰基和十八烷酰基中的至少一种的酯基的任何上述多糖结构的皂化产物。
优选的是，任何上述多糖结构的烯基羰基酯的酯基选自丙烯酰基和甲基丙烯酰基中的至少一种。此外，可优选使用具有选自丙烯酰基和甲基丙烯酰基中的至少一种的酯基的任何上述多糖结构的皂化产物。
优选的是，任何上述多糖结构的芳香基羰基酯的酯基选自苯酰基和萘酰基(naphthaloyl)中的至少一种。此外，可优选使用具有选自苯酰基和萘酰基中的至少一种的酯基的任何上述多糖结构的皂化产物。
可优选使用的任何上述多糖结构的硝酸酯的例子包括硝酸纤维素、硝酸半纤维素、硝酸葡聚糖、硝酸琼脂糖、硝酸糊精、硝酸直链淀粉、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸支链淀粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸异地衣淀粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜胶、硝酸木聚糖(nitroxylam)、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、硝酸透明质酸、硝酸软骨素、硝酸甲壳素和硝酸壳聚糖。
此外，可优选使用上述硝酸纤维素、硝酸半纤维素、硝酸葡聚糖、硝酸琼脂糖、硝酸糊精、硝酸直链淀粉、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸支链淀粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸异地衣淀粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜胶、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、硝酸透明质酸、硝酸软骨素、硝酸甲壳素和硝酸壳聚糖的皂化产物。
可优选使用的具有任何上述多糖结构的硫酸酯的例子包括硫酸纤维素、硫酸半纤维素、硫酸葡聚糖、硫酸琼脂糖、硫酸糊精、硫酸直链淀粉、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸支链淀粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸异地衣淀粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜胶、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、硫酸透明质酸、硫酸软骨素、硫酸甲壳素和硫酸壳聚糖。此外，可优选使用上述硫酸纤维素、硫酸半纤维素、硫酸葡聚糖、硫酸琼脂糖、硫酸糊精、硫酸直链淀粉、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸支链淀粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸异地衣淀粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜胶、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、硫酸透明质酸、硫酸软骨素、硫酸甲壳素和硫酸壳聚糖的皂化产物。
优选的是，具有任何上述多糖结构的磺酸酯选自烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺酸酯中的至少一种。此外，可优选使用上述烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺酸酯的皂化产物。
可优选使用的具有任何上述多糖结构的磷酸酯的例子包括磷酸纤维素、磷酸半纤维素、磷酸葡聚糖、磷酸琼脂糖、磷酸糊精、磷酸直链淀粉、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸支链淀粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸异地衣淀粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜胶、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、磷酸透明质酸、磷酸软骨素、磷酸甲壳素和磷酸壳聚糖。此外，可优选使用上述磷酸纤维素、磷酸半纤维素、磷酸葡聚糖、磷酸琼脂糖、磷酸糊精、磷酸淀粉酶、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸支链淀粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸异地衣淀粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜胶、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、磷酸透明质酸、磷酸软骨素、磷酸甲壳素和磷酸壳聚糖的皂化产物。
可优选使用的具有任何上述多糖结构的膦酸酯的例子包括膦酸纤维素、膦酸半纤维素、膦酸葡聚糖、膦酸琼脂糖、膦酸糊精、膦酸直链淀粉、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸支链淀粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸异地衣淀粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜胶、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、膦酸透明质酸、膦酸软骨素、膦酸甲壳素和膦酸壳聚糖。此外，可优选使用上述膦酸纤维素、膦酸半纤维素、膦酸葡聚糖、膦酸琼脂糖、膦酸糊精、膦酸直链淀粉、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸支链淀粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸异地衣淀粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜胶、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、膦酸透明质酸、膦酸软骨素、膦酸甲壳素和膦酸壳聚糖的皂化产物。
可优选使用的具有任何上述多糖结构的焦磷酸酯的例子包括焦磷酸纤维素、焦磷酸半纤维素、焦磷酸葡聚糖、焦磷酸琼脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸直链淀粉、焦磷酸淀粉精、焦磷酸糖原、焦磷酸支链淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸地衣淀粉、焦磷酸异地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜胶、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明质酸、焦磷酸软骨素、焦磷酸甲壳素和焦磷酸壳聚糖。此外，可优选使用上述焦磷酸纤维素、焦磷酸半纤维素、焦磷酸葡聚糖、焦磷酸琼脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸直链淀粉、焦磷酸淀粉精、焦磷酸糖原、焦磷酸支链淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸地衣淀粉、焦磷酸异地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜胶、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明质酸、焦磷酸软骨素、焦磷酸甲壳素和焦磷酸壳聚糖的皂化产物。
可使用的具有上述多糖结构的醚类衍生物的例子包括甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、羧乙基-氨基甲酰乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、氰乙基纤维素和氨基甲酰乙基纤维素。但是，醚类衍生物并不限定于上述材料。在这些醚类衍生物中，优选使用羟甲基纤维素和羟乙基纤维素。
还可以优选使用其中任何上述多糖结构中的羟基被以任意程度卤化取代的化合物。
可优选使用的含有具有多糖结构的有机聚合物的固相是醋酸纤维素。此外，也可以使用含有乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合物的有机聚合物固相。可优选使用的乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合物的例子包括：三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物；和二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。在这些醋酸纤维素混合物中，可特别优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合比(质量比)优选为99∶1到1∶99、并且更优选为90∶10到50∶50。
含有醋酸纤维素的特别优选的固相是如专利文献JP-A-2003-128691中所述的醋酸纤维素的表面皂化产物。醋酸纤维素的表面皂化产物是通过使乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物皂化所得的材料。还可优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化产物，三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物，三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物，和二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物。更优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化产物。三醋酸纤维素与二醋酸纤维素的混合比(质量比)优选为99∶1到1∶99，并且更优选为90∶10到50∶50。在这种情况下，就可以根据皂化处理的程度(皂化度)来控制固相表面上的羟基含量(密度)。为了提高核酸的分离效率，优选较高含量(密度)的羟基。通过皂化获得的固相的皂化率(表面皂化率)优选为5％到100％，并且更优选为10％到100％。此外，为了增加固相的表面积，优选的是，使醋酸纤维素固相皂化。
本文中使用的皂化是指使醋酸纤维素与皂化液(例如，氢氧化钠水溶液)接触。通过这种处理，与皂化液接触的醋酸纤维素部分转化为再生纤维素，从而引入羟基。如此制备的再生纤维素与起始纤维素在结晶态等方面是不同的。本发明中特别优选的是使用再生纤维素固相作为固相。
为了改变皂化率，可通过改变氢氧化钠的浓度进行皂化。通过NMR可以容易地测定皂化率(例如，可通过羰基峰值的减少程度来测定)。
将亲水性基团引入不含亲水性基团的有机材料固相中的方法是将聚合物主链或侧链上具有亲水性基团的接枝聚合物链键合到固相上。
有两种方法作为将接枝聚合物链键合到有机材料的固相上的方法。一种方法是使固相与接枝聚合物链化学键合的方法，另一种方法是用固相作为起始点，使具有可聚合双键的化合物聚合，从而形成接枝聚合物链的方法。
在使固相与接枝聚合物链化学键合的方法中，使用在聚合物的末端或侧链上具有能够与固相发生反应的官能团的聚合物。该官能团与固相的官能团之间发生化学反应而进行接枝。对能与固相发生反应的官能团没有特别限定，只要它能与固相的官能团反应即可。与固相发生反应的官能团的例子包括：硅烷偶联基(如，烷氧基硅烷)、异氰酸酯基、氨基、羟基、羧基、磺酸基、磷酸基、环氧基、烯丙基、甲基丙烯酰基和丙烯酰基。
特别可用作在聚合物末端或侧链上具有反应性官能团的聚合物的化合物的例子包括：在其末端具有三烷氧基甲硅烷基的聚合物、在其末端具有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具有环氧基的聚合物，和在其末端具有异氰酸酯基的聚合物。对在这种实施方案中使用的聚合物没有特别限定，只要它具有参与吸附核酸的亲水性基团即可。这种聚合物的例子包括：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸和它们的盐；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其盐；和聚氧乙烯。
用固相作为起始点、使具有可聚合双键的化合物进行聚合而形成接枝聚合物链的方法通常被称为表面接枝聚合法。表面接枝聚合法是指这样一种方法：通过等离子体辐射、光辐射或加热等，使基材表面产生活性部位，从而将具有可聚合双键并且被设置为可与固相接触的化合物通过聚合反应与固相键合。
可用于形成与基材键合的接枝聚合物链的化合物需要同时具有可聚合的双键和参与吸附核酸的亲水性基团这两个必要条件。具有亲水性基团的聚合物、具有亲水性基团的低聚物和具有亲水性基团的单体中的任何化合物都可用作此类化合物，只要其分子中具有双键即可。特别有用的化合物是具有亲水性基团的单体。
具有亲水性基团的特别有用的单体的例子是含有羟基的单体例如丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯和单甲基丙烯酸甘油酯。此外，可优选使用含有羧基的单体，例如丙烯酸或甲基丙烯酸、或其碱金属盐或胺盐。
其它把亲水性基团引入到不具有亲水性基团的有机材料的固相中的方法是用具有亲水性基团的材料涂敷固相。对用于涂敷的材料没有特别限定，只要其具有参与核酸吸附的亲水性基团即可。但是从操作容易进行的角度上来说，优选使用包含有机材料的聚合物作为用于涂敷的材料。这种聚合物的例子包括：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸或它们的盐；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸和它们的盐；聚氧乙烯、醋酸纤维素以及乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物。优选使用具有多糖结构的聚合物。
可使用的一种方法为：将醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物涂敷到不具有亲水性基团的有机材料固相上，并且对醋酸纤维素或乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物的涂层进行皂化。在该方法中，皂化率优选为5％到100％，并且更优选为10％到100％。
具有亲水性基团的无机材料固相的例子包括含有二氧化硅或其衍生物、硅藻土或氧化铝化合物的固相。含有二氧化硅化合物的固相可以是玻璃滤膜。固相的例子还可以包括如日本专利No.3,058,342中所述的二氧化硅多孔薄膜。这种二氧化硅多孔薄膜可按以下方法制备：把具有形成双分子膜能力的阳离子两性物质的展开液铺展到基板上，然后从基板上的液体膜中除去溶剂，从而制成两性物质的多层双分子薄膜，将多层双分子薄膜与含有二氧化硅化合物的溶液接触，提取多层双分子薄膜并除去。
有两种方法作为将亲水性基团引入不具有亲水性基团的无机材料固相的方法。一种方法是将固相和具有亲水性基团的接枝聚合物链化学键合的方法；另一种方法是使用接枝聚合物链的方法，其中使用分子内具有亲水性基团和双键的单体，并用固相作为起始点，聚合成为接枝聚合物链的方法。
在将固相与具有亲水性基团的接枝聚合物链化学键合的情况下，将与接枝聚合物链的末端官能团发生反应的官能团引入无机材料中，然后使接枝聚合物键合到其上。此外，在使用分子内具有亲水性基团和双键的单体，并且用固相作为起始点，聚合成为接枝聚合物链的情况下，将在具有双键的化合物进行聚合时作为起始点的官能团引入到无机材料中。
具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有亲水性基团和双键的单体可以分别优选使用在上述将亲水性基团引入到不具有亲水性基团的有机材料固相中的方法中所述的具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有亲水性基团和双键的单体。
另一种将亲水性基团引入不具有亲水性基团的无机材料固相中的方法是用具有亲水性基团的材料进行涂敷。对涂敷所用的材料没有特别限定，只要其具有参与核酸吸附的亲水性基团即可。从操作容易进行的角度上来说，优选使用包含有机材料的聚合物作为用于涂敷的材料。这种聚合物的例子包括：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸以及它们的盐；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和它们的盐；聚氧乙烯、醋酸纤维素和乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物。
可使用的一种方法为：用醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物涂敷不具有亲水性基团的有机材料固相，并对醋酸纤维素或乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物的涂层进行皂化。在该方法中，皂化率优选为5％到100％，并且更优选为10％到100％。
含有不具有亲水性基团的无机材料的固相的例子包括：金属(如铝)、玻璃、水泥、陶瓷(如瓷和陶)、以及对新型陶瓷、硅或活性炭等加工制得的固相。
优选使用过滤器或者膜形式的固相，其原因是溶液能够从其内部通过。在这种情况下，固相的厚度优选为10到500μm，并且更优选为50到250μm。考虑到洗涤的容易程度，优选厚度尽可能薄的固相。
溶液可从中通过的固相的平均孔径优选为0.1到10μm，并且更优选为1到5μm。由于固相具有该范围内的平均孔径，所以可得到用于吸附核酸的足够的表面积，并且孔不容易被堵。可使用泡点法(根据ASTM 316-86和JIS 3832)确定溶液可从中穿过的固相的平均孔径大小。
溶液可从中通过的固相可以是其前表面和后表面彼此对称的多孔膜，但可以优选使用前表面和后表面彼此不对称的多孔膜。在本文中使用的“前表面和后表面彼此不对称”是指从多孔膜的一面到其另一面，膜的物理或化学性质发生变化。
膜物理性质的一个例子是平均孔径，化学性质的一个例子是皂化率。
在本发明中使用其前表面和后表面彼此不对称的多孔膜时，优选使平均孔径沿着溶液通过膜的方向，从“较大平均孔径”变为“较小平均孔径”。此外，优选使用最大孔径与最小孔径之比为2或更高的多孔膜。更优选的是，最大孔径与最小孔径之比为5或更高。由于具有这种孔径比，所以可得到用于吸附核酸的足够的表面积，并且孔不容易被堵。
溶液可从中通过的固相的孔隙率优选为50％到95％，并且更优选为65％到80％。此外，泡点优选为0.1到10kgf/cm2，并且更优选为0.2到4kgf/cm。
溶液可从中通过的固相的压力损失优选为0.1到100kPa。由于具有这种压力损失，所以施加压力时会得到均匀的压力。更优选的是，压力损失为0.5到50kPa。本文中所使用的“压力损失”是指水每通过100μm厚度的膜所需要的最小压力。
当水在25℃、1kg/cm2的压力下通过固相时，溶液可从中通过的固相的透水量优选为每分钟每1cm2膜1到5000毫升，更优选为每分钟每1cm2膜5到1000毫升。
溶液可从中通过的固相的核酸吸附量优选为每毫克多孔膜吸附0.1μg或更高的核酸，并且更优选为每毫克多孔膜吸附0.9μg或更高的核酸。
为了使溶液和多孔膜达到适当的接触时间，当含有核酸的样品溶液通过固相时，其流速优选为每单位固相面积(cm2)2到1,500μL/秒。如果溶液和多孔膜的接触时间太短，则不能达到充分的分离和纯化效果。另一方面，从操作性能的角度来说，太长的接触时间是不利的。此外，流速更优选为每单位固相面积(cm2)5到700μL/秒。
当所用的溶液可以通过固相的内部时，该溶液可以是一种溶液，但是也可以使用多种溶液。多种固相可含有相同或不同的材料。
洗涤
在将核酸吸附到固相上以后，洗涤固相，由此提高核酸的回收量和纯度并使含有所需核酸的样品的量减少到少量。此外，通过自动进行洗涤和回收操作，可以方便、快捷地实施该操作。为快速完成操作可以只进行一次洗涤步骤。在纯度更加重要的情况下，优选重复进行几次洗涤操作。
洗涤液优选为含有水溶性有机溶剂的溶液。如果需要并且必要的话，洗涤液还可以含有水溶性盐、缓冲剂和表面活性剂。要求洗涤操作起到这样的作用：其洗去样品溶液中与核酸一起吸附到固相上的杂质。为了达到这种要求，洗涤液需要具有这样的组成，其使核酸不会从固相上解吸附而使杂质从固相上解吸。这样做的原因是由于核酸难溶于水溶性有机溶剂(如醇类)中，因此，这种组合物适合于在保持核酸的条件下使除了核酸之外的其它成分解吸附。此外，加入水溶性盐可增加核酸的吸附效果，由此，使选择性地除去杂质和不必要成分的作用增强。
洗涤液中所含的水溶性有机溶剂的例子包括醇类和丙酮。优选使用醇类。醇类的例子包括所述甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。丙醇可以是异丙醇和正丙醇中的任何一种，而丁醇可以是直链丁醇和支链丁醇中的任何一种。可以使用这些醇类的两种或多种的混合物。在这些醇类中，优选使用乙醇。洗涤液中所含的水溶性有机溶剂的量优选为20质量％到100质量％，并且更优选为40质量％到100质量％。
当洗涤液中含有水溶性盐时，优选卤盐。在这些卤盐中，更优选氯化物。水溶性盐优选为单价阳离子或二价阳离子。优选碱金属盐和碱土金属盐。在这些碱金属盐和碱土金属盐中，更优选钠盐和钾盐，并且最优选钠盐。
当洗涤液中含有水溶性盐时，水溶性盐的浓度优选为10毫摩尔/升或更高。对浓度上限没有特别限定，只要该上限在不降低杂质的溶解性的范围内即可。然而，该上限优选为1摩尔/升，并且更优选为0.1摩尔/升。优选实施方案为水溶性盐是氯化钠，并且其浓度为20毫摩尔/升或更高。
洗涤液可以不含离液物质。这种情况可降低洗涤步骤后离液物质混入回收步骤中的可能性。在回收步骤中洗涤液含有离液物质的情况下，该离液物质通常会抑制诸如PCR反应之类的酶反应。因此，考虑到之后的酶反应等，理想的情况是洗涤液中不含离液物质。此外，离液性物质具有腐蚀性和毒性。因此，从这方面上说，如果可以不使用离液物质，则这对实验人员的操作安全极为有利。本文中使用的离液物质为脲、胍盐、异氰酸钠、碘化钠、碘化钾等。
常规上，在核酸分离纯化方法的洗涤步骤期间，洗涤液对诸如柱之类的容器具有高度的润湿性，所以洗涤液常常保留在容器中，导致洗涤液混入洗涤步骤之后的回收步骤中。这是(例如)核酸纯度降低或在随后步骤中的反应性降低的原因。由于该原因，当使用诸如柱之类的容器进行核酸的吸附和解吸附时，重要的是，残留的洗涤液不应保留在柱内，使得在吸附和洗涤中所用的溶液(特别是洗涤液)不会影响下一步骤。
因此，为了防止洗涤步骤中使用的洗涤液与随后步骤中使用的回收液混合，并且使柱内的洗涤液残留量达到最小，洗涤液的表面张力优选小于0.035J/m2。当洗涤液的表面张力小时，会改善洗涤液和柱子之间的润湿性能，由此，可以抑制残留溶液的量。
为了提高洗涤效率，可增加洗涤液中水的比例。然而，在这种情况下，洗涤液的表面张力增大，并且溶液的残留量增多。在洗涤液的表面张力为0.035J/m2或更大的情况下，通过增强柱的斥水性可以抑制残留溶液的量。通过增强柱的斥水性，而形成液滴，并且液滴向下流动，由此，可以抑制残留溶液的量。例如，用于增强斥水性的方法为在柱表面上涂敷防水剂的方法，或者在使柱成型时，引入防水剂(如硅树脂)的方法，但不限于此。
洗涤步骤中洗涤液的量优选为2μl/mm2或更高。当洗涤液的量较大时，会改善洗涤效果。然而，当洗涤液的量为200μl/mm2或更低时，可以保持操作性能，并且可以抑制样品的流出，这是优选的。
在洗涤步骤中，在洗涤液通过固相的情况下，流速优选为：每单位膜面积(cm2)2μL/秒到1，500μL/秒，更优选为：每单位膜面积(cm2)5μL/秒到700μL/秒。在降低通过速率，并且花费时间较长的情况下，会进行充分的洗涤。但是，通过将流速设定在以上范围内可以快速地进行核酸的分离和纯化操作，而不会降低洗涤效率，并且这是优选的。
在洗涤步骤中，洗涤液的温度优选为4到70℃，并且更优选为室温。此外，在洗涤步骤中，在进行洗涤步骤的同时可对核酸分离纯化柱施加机械振动搅拌或超声波搅拌。还可以通过实施离心操作来进行洗涤。
在洗涤步骤之前或洗涤步骤中，当要回收的所需核酸是DNA时，可以通过使RNA降解酶溶液与固相接触来预先降解RNA。当所需核酸是RNA时，可以通过使DNA降解酶溶液与固相接触来预先降解DNA。在任何一种情况下，随后通过使用洗涤液洗涤固相从固相中除去RNA降解酶或DNA降解酶都是非常重要的。
回收
然后使洗涤之后的固相与能够使吸附到固相上的核酸进行解吸附的溶液(回收液)接触。接触后的溶液含有所需的核酸。因此，回收该接触后的溶液，并用于随后的诸如通过PCR(聚合酶链式反应)进行的核酸扩增之类的操作中。
可以将回收液的体积调节为由样品制成的含有核酸的样品溶液的体积，然后可以进行核酸的解吸附。含有所分离和纯化的核酸的回收液的量取决于所用的样品的量。通常所用的回收液的量为几十微升到几百微升。但是，当样品的量极小或需要分离和纯化大量的核酸时，回收液的体积可在1μL到几十毫升的范围内变动。
回收液可以优选使用经纯化的蒸馏水和Tris/EDTA缓冲剂等。回收液的pH优选为2到11，并且更优选为5到9。特别的是，离子强度和盐浓度会对被吸附核酸的洗脱产生有利影响。回收液的离子强度优选为290毫摩尔/升或更低，并且盐浓度为90毫摩尔/升或更低。在这种情况下，盐可以是碱金属盐。通过将回收液设置为具有上述性质，可改善核酸的回收，由此，可以回收大量的核酸。
当参照含核酸的初始样品溶液的体积来减小回收液的体积时，可以得到含有浓缩的核酸的回收液。(回收液的体积)与(样品溶液的体积)之比优选为1∶100到99∶100，并且更优选为1∶10到9∶10。通过该范围内的比值，可以按照简便的方式浓缩核酸，而无需在核酸分离纯化之后的步骤中实施浓缩操作。由此，可提供一种用于制得核酸溶液的方法，其中，通过上述方法浓缩的核酸的浓度比样品中的高。
对回收液注入的次数没有限定，注入次数可以是一次或两次或多次。通常，在方便快捷地分离和纯化核酸时，可通过一次回收操作的方式来进行。另一方面，  在要回收大量核酸时，可以分批多次注入回收液。
在回收步骤中，为了抑制回收的核酸的降解，可向核酸回收液中加入稳定剂。可加入的稳定剂的例子包括抗细菌剂、抗真菌剂和核酸降解抑制剂。核酸降解抑制剂是核酸降解酶的抑制剂，并且尤其是EDTA。作为其它的回收实施方案，可以预先向回收容器中加入稳定剂。此外，通过向回收的核酸溶液中加入特定的DNA降解酶可以降解不需要的DNA(如染色体基因组DNA)。
根据本发明的方法可用于分离和纯化质粒DNA的情况中，并且还可以优选用于以类似的方式分离和纯化噬粒DNA的情况中。
核酸分离纯化单元以及核酸分离纯化柱
在本发明中，优选使用核酸分离纯化单元，该核酸分离纯化单元具有：(a)固相；(b)具有至少两个开口的容器，该容器用于容纳固相；和(c)与所述容器的一个开口相连的压力差产生装置。
以下将说明所述核酸分离纯化单元。
容器的材料没有特别限定，只要该容器能够容纳固相，并且可以设置至少两个开口即可。从易于制造上来说，优选使用塑料。例如优选使用透明或不透明的树脂作为塑料，所述树脂如聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、尼龙或聚碳酸酯。
容器设有固相容纳部分，并且固相可容纳在该容纳部分中。在抽吸和排出样品溶液等时，固相不会脱离容纳部分，并且压力差产生装置(如注射器)可连接到开口上。对于这种容器，优选的是，该容器最初分为两部分，并且在容纳固相后，可将这两部分接合。此外，为了避免固相脱离容纳部分，可将由不污染核酸的材料制成的网放到固相的上侧和下侧。
容纳在容器中的固相的形状没有特别限定，并且固相可以是圆形、正方形、矩形、椭圆形、圆柱形(在为膜的情况下)、卷绕形(在为膜的情况下)、珠形(其表面涂有含羟基的有机聚合物)等。从适合制造的角度上来说，优选使用高度对称的形状，如圆形、正方形、圆柱形或卷绕形和珠形。
通常在固相容纳体和盖子相分离的情形下制造容器，并且固相容纳体和盖子各设有至少一个开口。开口被用作含有核酸的样品溶液、洗涤液和能够使被吸附到固相上的核酸解吸附的溶液(为了简便的目的，下文全部称为“样品溶液等”)的入口和出口。开口连接到能够使容器内部形成减压状态或者加压状态的压力差产生装置上。固相容纳体的形状没有特别限定。但是为了方便制造，并且使样品溶液等容易扩散到固相的整个表面上，优选固相容纳体的横截面为圆形。为了防止产生固相切屑，四边形的横截面也是优选的。
需要将盖子连接到固相容纳体上，以便通过压力差产生装置使容器内部处于减压状态或者加压状态。但是，可以选择任何连接方法，只要可以达到这种状态即可。连接方法的例子包括使用粘合剂连接、螺栓连接、配合连接、使用螺钉固定以及使用超声波加热熔融连接。
容器的内部体积仅仅由待处理的样品溶液的量决定，但通常是由所容纳固相的体积来指示。具体的说，内部体积优选为这样的体积：该体积可容纳约1到6个固相，每个固相的厚度为约1mm或者更低(如约50到500μm)，并且其直径为约2到20mm。
优选的是，容器中的固相的边缘部分与容器的内壁面紧密接触到这样的程度，该程度使得样品溶液等不会通过固相和内壁之间的空间。
面向被用作样品溶液等的入口的开口的固相的底部被构建为这样的方式，使得固相和容器的内壁接触不紧密，从而提供空间，以便样品溶液等尽可能均匀地扩散到固相的整个表面上。
优选的是，在面对与压力差产生装置相连接的开口的固相的上部，设置其接近中心处具有穿孔(孔)的元件。该元件具有下压固相的功能，并且还具有高效排出样品溶液等的作用。该元件优选为具有斜面的形状(如，漏斗形或碗形)，以便将溶液集中在中心孔处。通过考虑待处理的样品溶液等的量以及容纳固相的容器的尺寸，孔的尺寸、斜面的角度和元件的厚度可由本领域的技术人员适当地确定。优选的是，在所述元件和开口之间设有空间，该空间用于储存溢出的样品溶液等，从而防止其被吸入压力差产生装置中。该空间的大小可由本领域技术人员适当地确定。为了有效地收集核酸，优选的是以至少这样的量吸入含有核酸的样品溶液，该溶液量使得全部固相足以浸入其中。
为了防止样品溶液等仅集中在进行抽吸操作的开口的正下方，从而使样品溶液等相对均匀地通过固相内部，还优选在固相和所述元件之间设有空间。为了达到这种构造，由元件朝向固相设有多个突起物。突起物的尺寸和数目可由本领域内的技术人员确定。然而，优选的是在保持空间的同时，保持固相的开口面积尽可能地大。
在容器上设有至少三个开口的情况下，无需说明，需要临时密封多余的开口，以便能够通过减压操作和加压操作吸入和排出溶液。
压力差产生装置首先具有通过降低其内容纳有固相的容器内的压力来吸入含有核酸的样品溶液的功能。压力差产生装置具有能够进行抽吸操作和加压操作的泵，如注射器、移液管和蠕动泵。在这些之中，注射器适于手工操作，而蠕动泵适于自动操作。移液管的优点是其可容易地用单手操作。优选的是，压力差产生装置以可拆装的方式连接到容器的一个开口上。
下面说明使用上述核酸分离纯化单元的核酸分离和纯化方法。
优选的是，在根据本发明的核酸分离和纯化方法中，使用核酸分离纯化柱可以实施核酸的吸附和解吸附，其中，所述核酸分离纯化柱在具有至少两个开口的容器内容纳有固相。
更优选的是，使用核酸分离纯化柱可以实施核酸的吸附和解吸附，其中，所述核酸分离纯化柱具有：(a)固相、(b)具有至少两个开口、容纳固相的容器以及(c)与容器的一个开口相连的压力差产生装置。
在这种情况中，根据本发明的核酸分离和纯化方法的第一实施方案可以包括以下的步骤。
(a)向样品(细菌或细胞)中加入分散液的步骤；
(b)向上述步骤(a)中获得的溶液中加入碱性液，从而溶解其中的样品的步骤；
(c)向上述步骤(b)中获得的溶液中加入中和液，从而使除所需核酸外的不需要的材料沉淀的步骤；
(d)向上述步骤(c)中获得的沉淀物的上清液中加入裂解液的步骤；
(e)向上述步骤(d)中获得的溶液中加入水溶性有机溶剂，从而制备样品溶液(用于使核酸吸附到固相上的溶液)的步骤；
(f)使核酸分离纯化单元的第一开口插入样品溶液中的步骤；
(g)通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口相连的压力差产生装置降低容器内的压力来吸入用于使核酸吸附到固相上的溶液，从而使该溶液与固相接触的步骤；
(h)通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口相连的压力差产生装置来增加容器内的压力而使被吸入的用于使核酸吸附到固相上的溶液从容器内排出的步骤；
(i)将核酸分离纯化单元的第一开口插入洗涤液中的步骤；
(j)通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口相连的压力差产生装置降低容器内的压力来吸入洗涤液，从而使该洗涤液与固相接触的步骤；
(k)通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口相连的压力差产生装置来增加容器内的压力而使被吸入的洗涤液从容器内排出的步骤；
(1)将核酸分离纯化单元的第一开口插入能够使被吸附到固相上的核酸解吸附的溶液(回收液)中的步骤；
(m)通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口相连的压力差产生装置降低容器内的压力来吸入能够使被吸附到固相上的核酸解吸附的溶液，从而使该溶液与固相接触的步骤；以及
(n)通过使用与核酸分离纯化单元的其它开口相连的压力差产生装置来增加容器内的压力而使能够使被吸附到固相上的核酸解吸附的溶液从容器内排出的步骤。
在步骤(g)、(j)和(m)中，优选的是，以基本上与全部固相接触的量吸入溶液。然而，在溶液被吸入压力差产生装置中的情况下，该装置会被该溶液污染。因此，将溶液的吸入量控制到合适的量。在吸入适量的溶液后，用压力差产生装置对容器内部加压，从而排出被吸入的溶液。在进行该操作之前不需要具有时间间隔，并且可以在吸入溶液后立即将其排出。
根据本发明的核酸分离和纯化方法的第二实施方案可包括以下步骤。
(a)向样品(细菌或细胞)中加入分散液的步骤；
(b)向上述步骤(a)中获得的溶液中加入碱性液，从而溶解其中的样品的步骤；
(c)向上述步骤(b)中获得的溶液中加入中和液，从而使除所需核酸外的不需要的材料沉淀的步骤；
(d)向上述步骤(c)中获得的沉淀物的上清液中加入裂解液的步骤；
(e)向上述步骤(d)中获得的溶液中加入水溶性有机溶剂，从而制备样品溶液(用于使核酸吸附到固相上的溶液)的步骤；
(f)将样品溶液注入到核酸分离纯化单元的第一开口内的步骤；
(g)通过使用与核酸分离纯化单元的第一开口相连的压力差产生装置来增加容器内的压力而使被注入的用于使核酸吸附到固相上的溶液从其它开口排出的步骤；
(h)将洗涤液注入到核酸分离纯化单元的第一开口内的步骤；
(i)通过使用与核酸分离纯化单元的第一开口相连的压力差产生装置来增加容器内的压力而使被注入的洗涤液从其它开口排出的步骤；
(j)将能够使被吸附到固相上的核酸解吸附的溶液(回收液)注入到核酸分离和纯化单元的第一开口内的步骤；以及
(k)通过使用与核酸分离纯化单元的第一开口相连的压力差产生装置来增加容器内的压力而使被注入的能够使被吸附到固相上的核酸解吸附的溶液从其它开口排出，由此使被吸附到固相的核酸解吸附并且将核酸从容器内排出的步骤。
在上述步骤中，对容器中样品溶液的注入方式没有限制，优选使用实验用器具(如移液管或注射器)。更优选的是，这些器具是不含核酸酶的或不含氢的。
对样品和各种溶液的混合方法没有特别限定。例如，优选的是，使用搅拌装置在30到3,000rpm的条件下实施混合1秒钟到3分钟。通过这种混合，可以提高经分离和纯化的核酸的收率。可供选用的另外一种方式是，优选通过翻转混合5到30次来混合。此外，也可以通过进行移液操作10到50次来混合。
可制造和使用一种成套用具，该成套用具包含：(i)核酸分离纯化柱；(ii)多种酶；(iii)预处理液，其含有离液盐、表面活性剂、消泡剂、核酸稳定剂、缓冲剂、酸剂和碱剂、和水溶性有机溶剂中的至少一种；(iv)洗涤液；以及(v)回收液试剂。
下面描述自动装置的例子，该自动装置使用核酸分离纯化柱和压力差产生装置从含有核酸的样品中自动地实施分离和纯化核酸的步骤，其中所述核酸分离纯化柱在具有至少两个开口的容器内容纳有固相，但是自动装置不限于此。
自动装置是自动进行如下分离和纯化操作的用于分离和纯化核酸的装置。使用其内容纳固相的核酸分离纯化柱，其中，溶液能够通过柱子的内部。将用于使核酸吸附到固相上的溶液(样品溶液)注入到核酸分离纯化柱内，然后加压，从而使样品溶液中的核酸吸附到固相上。将洗涤液注入核酸分离纯化柱内，进行加压，从而除去杂质。将回收液注入核酸分离纯化柱内，从而使被吸附到固相上的核酸解吸附，并且将解吸附后的核酸和回收液同时回收。由此，该自动装置具有：支承机构，其支承核酸分离纯化柱、接收样品溶液和洗涤液的废液容器和接收含有核酸的回收液的回收容器；压缩空气供给机构，其把压缩空气引入核酸分离纯化柱中；以及分注机构，其分别把洗涤液和回收液注入核酸分离纯化柱中。
优选的是，支承机构具有：安装于装置主体上的立架；由立架承载的可上下移动的柱支架，其支承核酸分离纯化柱；以及容器支架，其支承废液容器和回收容器，它们的位置可以在柱子的下方相对于核酸分离纯化柱交换。
优选的是，压缩空气供给机构具有：从其下部喷射压缩空气的气嘴；压头，用于承载气嘴并使气嘴相对于由柱支架支承的核酸分离纯化柱上下移动；以及设在压头上的定位装置，该定位装置用于确定位于支承机构的台架中的核酸分离纯化柱的位置。
优选的是，分注机构具有：注入洗涤液的洗涤液注入嘴；注入回收液的回收液注入嘴；支承洗涤液注入嘴和回收液注入嘴的注入嘴移动架，该移动架能够在由支承机构支承的核酸分离纯化柱上依次移动；从其内容纳有洗涤液的洗涤液瓶中抽吸洗涤液并把洗涤液供给洗涤液注入嘴的洗涤液供给泵；以及从其内容纳有回收液的回收液瓶中抽吸回收液并把回收液供给回收液注入嘴的回收液供给泵。
根据如上所述的自动装置，其设有：支承核酸分离纯化柱、废液容器和回收容器的支承机构；把压缩空气引入核酸分离纯化柱中的压缩空气供给机构；以及分别把洗涤液和回收液注入核酸分离纯化柱中的注入机构。此外，该装置自动地进行如下核酸分离和纯化方法中的每一步：在加压下将用于使核酸吸附到固相上的溶液注入到装备有固相部件的核酸分离纯化柱中，从而使核酸吸附到固相部件上；注入洗涤液，从而洗掉和排出杂质；以及注入回收液，从而分离和回收被吸附到固相部件上的核酸。由此，可以紧凑构造这样一种机构，其可以在短时间内高效、自动地实施分离和纯化样品溶液中的核酸的步骤。
当支承机构具有立架、可上下移动的柱支架(其支承着核酸分离纯化柱)以及以可交换的方式支承废液容器和回收容器的容器支架时，就可以容易地实施核酸分离纯化柱与废液容器和回收容器中的每一个或一组的互换。
当压缩空气供给机构具有气嘴、上下移动气嘴的压头以及用于确定核酸分离纯化柱的位置的定位装置时，以简单的机构就可以安全地供给压缩空气。
当分注机构包括洗涤液注入嘴、回收液注入嘴、可在核酸分离纯化柱上依次移动的注入嘴移动架、从洗涤液瓶中抽吸洗涤液并把洗涤液供给洗涤液注入嘴的洗涤液供给泵、以及从回收液瓶中抽吸回收液并把回收液供给回收液注入嘴的回收液供给泵时，以简单的机构就可以依次注入洗涤液和回收液。
以下由实施例来更详细地描述本发明，但是应当理解本发明并不仅限于这些实施例。
例子
实施例1
(1)制备核酸分离纯化柱
核酸分离纯化柱由高抗冲聚苯乙烯制成，其内径为7mm，并具有容纳作为固相的多孔膜的部分。
(2)将通过使包含三醋酸纤维素的多孔膜皂化而得到的多孔膜(孔径：2.5μm，直径：7mm，厚度：100μm，皂化率：95％)用作多孔膜，并将其容纳在上述(1)中制备的核酸分离纯化柱的固相容纳部分中。
(3)制备分散液、碱性液、中和液、裂解液、洗涤液和回收液。
制备各自具有下列配方的用于分离和纯化质粒DNA的分散液、碱性液、中和液、裂解液、洗涤液和回收液。
分散液(用于分离和纯化质粒DNA)
1摩尔/升Tris-盐酸(Wako Pure Chemical Industries有限 26g公司的产品)
0.5摩尔/升EDTA(Wako Pure Chemical Industries有限公  11g司的产品)
蒸馏水                                              465g
碱性液(用于分离和纯化质粒DNA)
1摩尔/升NaOH(Wako Pure Chemical Industries有限公司  104g的产品)
10重量％SDS(Wako Pure Chemical Industries有限公司的 50g产品)
蒸馏水                                              350g
中和液(用于分离和纯化质粒DNA)
乙酸钾(Wako Pure Chemical Industries有限公司的产品) 147g
乙酸(Wako Pure Chemical Industries有限公司的产品)   68g
蒸馏水                                              356g
裂解液(用于分离和纯化质粒DNA)
吐温-20(ICN Pharmaceutical公司的产品)               39g
Bis-Tris(Wako Pure Chemical Industries有限公司的产  3.4g品)
乙醇(99.5％)(Wako Pure Chemical Industries有限公     344mL司的产品)
蒸馏水                                               104mL
洗涤液(用于分离和纯化质粒DNA)
1摩尔/升Tris-盐酸(Wako Pure Chemical Industries有    5.6g限公司的产品)
乙醇(99.5％)(Wako Pure Chemical Industries有限公     400mL司的产品)
蒸馏水                                               94g
回收液(用于分离和纯化质粒DNA)
1摩尔/L Tris-盐酸(Wako Pure Chemical Industries有限  5.2g公司的产品)
蒸馏水                                               494g
(4)从E.coli pBluescript IISK(-)/DH5α中提取质粒DNA
(i)制备E.coli pBluescript IISK(-)/DH5α
将用质粒pBluescript IISK(-)(Stratagene公司的产品)转化的E.coli DH5α转化子接种到100mL含有100μg/mL的氨苄西林的Luria-Bertani培养液(10g/升的胰化蛋白胨、5g/升的酵母提取物、5g/升的氯化钠(pH：7.5))，并且在温育温度37℃、振摇速度为220分钟-1的条件下温育15个小时。温育后，将培养液以1.0mL的量分注入1.5mL的无核酸酶、无氢微管(铂管，BM Equipment公司的产品)中。使用高速微量冷冻离心机(商品名：MX-300，Tomy Seiko公司的产品)将培养液在6000×g的条件下离心15分钟。除去上清液，从而得到生物质。将该生物质作为用于提取的材料。
(ii)分离和纯化质粒DNA
将3μL浓度为10mg/mL的RNase A溶液(Wako Pure ChemicalIndustries的产品)和1μL浓度为1mg/mL的RNase T1溶液(Sigma公司的产品)分别加入100μL上述步骤(3)中制备的分散液中，该分散液含有步骤(i)中制备的生物质，将所得溶液在室温下涡旋搅拌15秒，以确保使生物质分散。然后向该溶液中加入100μL上述步骤(3)中制备的碱性液，并且进行翻转混合5次，以对生物质进行溶菌裂解。然后向该溶液中加入140μL上述步骤(3)中制备的中和液，并进行翻转混合5次，以中和样品溶液。使用高速微量冷冻离心机(商品名为MX-300，Tomy Seiko公司的产品)将沉淀残渣在18000×g的条件下离心10分钟，从而回收330μL上清液。向新的1.5mL无核酸酶、无氢微管中(铂管，BM Equipment公司的产品)中预先加入320μL上述步骤(3)中制备的裂解液，并且向该容器中加入以上所得的上清液。进行涡旋搅拌30秒，从而获得样品溶液。
将各溶液分别注入核酸分离纯化柱(其容纳有以上(2)中所制备的作为固相的多孔膜)的第一开口中，并且使压力差产生装置(管式泵)连接到该开口上。使核酸分离纯化柱的内部处于加压状态(80kPa)，并且使注入的溶液通过多孔膜固相，从而使该溶液与固相接触。将溶液从核酸分离纯化柱的其它开口排出。将以上(3)中所制备的洗涤液注入核酸分离纯化柱的第一开口中，并且使管式泵连接到该第一开口上。使核酸分离纯化柱的内部处于加压状态(80kPa)，并且使所注入的洗涤液通过多孔膜固相，然后从其它开口排出。将以上(3)中所制备的回收液注入核酸分离纯化柱的第一开口中，并且使管式泵连接到该核酸分离纯化柱的第一开口上。使核酸分离纯化柱的内部处于加压状态(80kPa)，并且使所注入的回收液通过多孔膜固相，然后从其它开口排出。然后回收该溶液。进行核酸分离和纯化操作(从注入含有核酸的样品溶液到对其回收)需要耗时6分钟。
进行以下实验作为对比例。
使用QIAGEN QIAprep mini根据该成套用具的试验方案对以上(i)中所制备的生物质进行分离和纯化操作，从而得到含有核酸的回收液。
在以上(ii)中，仅将RNase A(Wako Pure Chemical Industries的产品)加入分散液中，并且对所得的溶液进行分离和纯化操作，从而得到含有核酸的回收液。
在以上(ii)中，仅将RNase T1(Sigma公司的产品)加入分散液中，并且对所得的溶液进行分离和纯化操作，从而得到含有核酸的回收液。
(5)对核酸回收量的定量测定
关于在上述例子中回收的各回收液，将DNA的电泳结果示于附图1中。在这种情况下的电泳条件如下所示。
1％琼脂糖/1×TAW缓冲剂，EtBr染色，迁移时间为35分钟。
样品溶液2μL+负载缓冲剂1μL→所用总量3μL。
在260nm处的吸光度如下表1所示：
表1
 Q  1  2  3
 吸光度  6.9  10  8.5  6.6
 对比例  对比例  对比例  本发明
上述表中的符号如下所示。
Q：使用QIAGEN QIAprep mini提取；
1：仅将RNase A(Wako Pure Chemical Industries的产品)加入分散液中；
2：仅将RNase T1(Sigma公司的产品)加入分散液中；
3：将RNase A(Wako Pure Chemical Industries有限公司的产品)+RNase T1(Sigma公司的产品)加入分散液中。
从图1中的电泳图谱和表1所示的结果可以明显地看出：与对比例中用QIAGEN QIAprep mini提取的样品(泳道Q)以及使用单一一种酶的常规方法(泳道1和2)相比，本发明实施例(泳道3)可以纯化质粒DNA，而所含有的源自宿主的RNA污染物较少，并且可以得到具有明显较高纯度的基因组DNA。换句话说，根据本发明的方法表现出优异的分离性能和优良的洗涤效率，结果，可在上述时间段内高收率、高纯度地快速获得质粒DNA。
工业适用性
本发明的方法可以高效地从由细菌或细胞制得的含有核酸的样品溶液中分离出高纯度的质粒DNA。
在本申请中，已要求外国优先权的每一个外国专利申请的全部公开内容以引用的方式并入本文，如同全部列出一样。

Claims (15)

1.一种分离和纯化核酸的方法，该方法包括：
(1)将含有核酸的样品溶液与固相接触，从而使所述核酸吸附到所述固相上的步骤；
(2)将洗涤液与所述固相接触，从而在所述核酸被吸附在所述固相上的状态下洗涤该固相的步骤；以及
(3)将回收液与所述固相接触，从而使所述核酸从该固相解吸附的步骤，
其中，所述样品溶液是通过包括加入至少两种酶的步骤的方法制备的。
2.根据权利要求1所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述至少两种酶包含至少一种核酸降解酶。
3.根据权利要求2所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述至少一种核酸降解酶是至少一种RNA降解酶。
4.根据权利要求3所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述至少一种RNA降解酶包含RNase T1和RNase A。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述样品溶液是通过向其中加入预处理液、并且还加入水溶性有机溶剂制得的，所述预处理液含有选自离液盐、表面活性剂、消泡剂、核酸稳定剂、缓冲剂、酸剂和碱剂中的至少一种。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述固相为膜状固相。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述水溶性有机溶剂包含甲醇、乙醇、丙醇及其异构体和丁醇及其异构体中的至少一种。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述固相包含二氧化硅或其衍生物、硅藻土或氧化铝。
9.根据权利要求1至8中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述固相包含有机聚合物。
10.根据权利要求9所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述固相包含选自Teflon(注册商标)、聚酯、聚醚砜、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯共聚物、聚氨酯、聚苯并咪唑、聚烯烃、聚氯乙烯和聚偏氟乙烯中的至少一种。
11.根据权利要求9所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述固相包含带正电荷或负电荷的尼龙。
12.根据权利要求9所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述有机聚合物具有多糖结构。
13.根据权利要求9所述的分离和纯化核酸的方法，
其中，所述有机聚合物包含选自纤维素、纤维素混合酯、硝酸纤维素、醋酸纤维素和硝化纤维素中的至少一种。
14.一种装置，该装置用于自动实施根据权利要求1至13中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法中的步骤。
15.一种成套用具，该成套用具用于实施根据权利要求1至13中任意一项所述的分离和纯化核酸的方法中的步骤，所述成套用具包括：
(i)核酸分离纯化柱；
(ii)至少两种酶；
(iii)预处理溶液，其含有选自离液盐、表面活性剂、消泡剂、核酸稳定剂、缓冲剂、酸剂和碱剂、和水溶性有机溶剂中的至少一种；
(iv)洗涤液；以及
(v)回收液试剂。
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