CN101098962A - 样品溶液的制备方法和样品溶液的制备装置 - Google Patents

Abstract

一种样品溶液的制备方法，其是在通过从样品溶液中提取核酸的核酸分离和纯化过程之前的步骤，该方法包括：将样品溶液注入制备容器中；对样品溶液进行振摇式搅拌处理，其中，通过轻轻振动所述容器来搅拌样品溶液；并且对样品溶液进行抽吸式搅拌处理，其中，通过抽吸所述容器内的样品溶液来搅拌该样品溶液。

Description

样品溶液的制备方法和样品溶液的制备装置

技术领域

本发明涉及为了从含核酸的试验样品中分离和纯化核酸而从试验样品得到含核酸的样品溶液的方法，更具体地说，本发明涉及其中预处理过程是高效自动化的样品溶液制备方法，本发明还涉及样品溶液的制备装置。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)应用于各种场合中，例如，它通常用于人致病因子的检测和诊断。通常，只有极少量的DNA可以获得，因此DNA的分离和纯化操作是复杂且耗时的。于是，人们研发了多种用于以高收率纯化所有来源的各种形式的DNA的方法。例如，专利文献JP-B-7-51065中披露的DNA的纯化方法涉及在DNA的纯化中使用有机溶剂，并且该方法包括：通过使用水溶性有机溶剂(如，乙醇、丙醇或异丙醇)将核酸吸附到固相(如，二氧化硅、二氧化硅聚合物、硅酸镁等)上；然后通过随后的过程(如，洗涤和解吸附)纯化核酸，以便可以以高收率纯化DNA；并通过使用水溶性有机溶剂而避免使用腐蚀性和毒性成分(如，离液剂)。

此外，日本未审查专利申请公开No.2003-128691中披露的核酸分离和纯化方法是包括以下步骤的核酸分离和纯化方法：使核酸吸附到固相上并使核酸从该固相上解吸附，该方法通过使用其表面具有羟基的有机聚合物作为固相，并使用将该固相容纳在具有两个开口的容器中的核酸分离和纯化装置而能够从含有核酸的样品溶液中分离出高纯度的核酸。

发明内容

然而，虽然专利文献JP-B-7-51065中批露的DNA的纯化方法在分离性能方面是优异的，但是在简便性、快速性和自动化适应性方面是不能令人满意的，所以，存在的问题在于：难以进行具有一致性能的吸附介质的工业化大规模生产，并且由于该吸附性介质不便于处理而难于将其加工成各种形状。

同时，日本未审查专利申请公开No.2003-128691中披露的核酸分离和纯化方法通过使用将固相容纳在具有两个开口的容器中的核酸分离和纯化装置而使得从含有核酸的样品溶液中分离出高纯度的核酸。然而，在通过从样品溶液中提取核酸的核酸分离和纯化过程之前的处理过程的步骤中，应当如何制备含有核酸的样品溶液还是一个问题。

在样品溶液的纯化过程中，需要搅拌样品溶液；然而，由于(例如)搅拌(如，涡旋)使样品溶液从容器内溅出，因此，需要额外的时间以提供盖子等等。然而，当减弱振动程度时，又不能达到充分的搅拌效果，由此减少了所提取的核酸的量，从而降低了核酸提取效率。

本发明是在考虑此类情况的基础上而完成的，因此，本发明的一个目的是提供样品溶液的制备方法和样品溶液的制备装置，在该样品溶液的制备方法中，预处理不是通过剧烈振摇的搅拌来进行的，而是通过将温和的搅拌和抽吸相结合来进行的，由此可以使预处理过程完全自动化。此外，本发明的另一个目的是提供通过洗涤或类似操作而使核酸解吸附的核酸分离和纯化方法，该方法在自动化特征方面是高效、简便、快速和优异的，并且该方法可以再现性地制得含有核酸的样品溶液。

为了实现上述目的，提供以下的方法。

(1)一种样品溶液的制备方法，其是在通过从样品溶液中提取核酸的核酸分离和纯化过程之前的步骤，该方法包括：

将样品溶液注入制备容器中；

对该样品溶液进行振摇式搅拌处理，其中，通过轻轻振动所述容器来搅拌所述的样品溶液；

对所述的样品溶液进行抽吸式搅拌处理，其中，通过抽吸所述容器内的样品溶液来搅拌该样品溶液。

(2)以上(1)所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的振摇式搅拌处理包括旋转振摇搅拌，并且该旋转振摇处理的转速为400rpm到2000rpm。

(3)以上(1)或(2)所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的抽吸式搅拌处理是以单次抽吸体积为50μl到1000μl的方式进行的。

(4)以上(1)到(3)中任意一项所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的抽吸式搅拌处理是以所述抽吸的重复次数为10次到100次的方式进行的。

(5)以上(1)到(4)中任意一项所述的样品溶液的制备方法，该方法包括对注入到所述容器内的多个样品溶液同时进行处理。

(6)以上(1)或(5)中任意一项所述的样品溶液的制备方法，

其中将所述样品溶液注入到所述制备容器中的所述过程包括：加入蛋白酶、含核酸的样品和预处理液的过程，该预处理液含有选自下列物质中的至少一种：离液盐、表面活性剂、消泡剂、核酸稳定剂和缓冲液，并且

其中所述蛋白酶、所述样品和所述预处理液的加入次序为：

以所述预处理液、所述样品和所述蛋白酶这样的次序加入，或者

以所述样品、所述预处理液和所述蛋白酶这样的次序加入。

(7)以上(6)所述的样品溶液的制备方法，

其中将所述样品溶液注入所述制备容器中的所述过程还包括：在加入所述蛋白酶、所述样品和所述预处理液之后，加入水溶性有机溶剂。

(8)以上(6)或(7)所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的样品溶液是通过制备全血而得到的。

(9)以上(7)所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的水溶性有机溶剂含有以下物质中的至少一种：甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。

(10)以上(7)所述的样品溶液的制备方法，

其中在所述的加入水溶性有机溶剂之后，使所述的样品溶液与核酸吸附性固相接触。

(11)以上(10)所述的样品溶液的制备方法，

其中所述固相为膜形式。

(12)以上(10)或(11)所述的样品溶液的制备方法，

其中所述固相含有二氧化硅或其衍生物、硅藻土或氧化铝。

(13)以上(10)或(12)中任意一项所述的样品溶液的制备方法，

其中所述固相含有有机聚合物。

(14)以上(13)所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的有机聚合物为具有多糖结构的有机聚合物。

(15)以上(13)或(14)所述的样品溶液的制备方法，

其中所述有机聚合物为醋酸纤维素。

(16)以上(13)或(14)所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的有机聚合物是通过将醋酸纤维素皂化或将乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物皂化而得到的。

(17)以上(13)或(14)所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的有机聚合物是再生纤维素。

(18)一种样品溶液的制备装置，其用于在通过从样品溶液中提取核酸的核酸分离和纯化过程之前的步骤中制备含核酸的样品溶液，该样品溶液制备装置具有：

制备容器，所述的样品溶液被注入其中；

振摇式搅拌机构，用于通过轻轻振动所述容器来搅拌所述的样品溶液；以及

抽吸式搅拌机构，用于通过抽吸所述容器内的所述样品溶液来搅拌该样品溶液。

这种样品溶液的制备方法是一种从试验样品得到含有核酸的样品溶液的方法，该方法在进行核酸分离和纯化(包括将核酸吸附到多孔膜上的过程和使核酸从多孔膜上解吸附的过程)之前实施，其中加入裂解液，随后首先通过振摇操作进行搅拌，然后进行抽吸搅拌，由此从试验样品得到含有核酸的样品溶液。因此，预处理不是通过使用涡旋的剧烈振摇方式的搅拌实施的，而是通过将温和的搅拌和抽吸相结合的方式实施的，从而不必使用盖子来防止溅洒，并且可以实现预处理过程的完全自动化。

此外，这种样品溶液的制备方法可以避免搅拌不充分，这种情况可能在转速小于或等于400rpm时发生，并且这种样品溶液的制备方法可以避免由于剧烈振摇搅拌而引起的样品溶液溅洒，这种情况可能在转速大于或等于2000rpm时发生。因此，可以实施温和且有效的搅拌。

这种样品溶液的制备方法还可以避免由于抽吸的量少而引起的搅拌效果较差，这种情况可能在抽吸体积小于或等于50μl时发生，并且这种样品溶液的制备方法还可以避免由于被抽吸的样品溶液与未被抽吸的样品溶液的混合不均匀而引起的搅拌效果较差，这种情况可能在抽吸体积大于或等于1000μl时发生。

此外，这种样品溶液的制备方法可以避免由于抽吸搅拌效果较差而引起的收率降低，这种情况可能在抽吸的重复次数小于或等于10次时发生，并且这种样品溶液的制备方法还可以避免由于过度的抽吸搅拌而引起的收率的降低，这种情况可能在抽吸的重复次数大于或等于100次时发生。

此外，在这种样品溶液的制备方法中，可以同时制备和处理注入多个容器中的样品溶液，也可以以组合方式制备和处理注入多个容器中的样品溶液，因此可以进行有效的操作，而不会发生由于向多个容器分装或分注样品溶液的操作所造成的错误。

在所述的样品溶液制备装置中，通过振摇式搅拌机构对其中注入有样品溶液的制备容器首先施加轻轻的振摇，然后通过抽吸式搅拌机构抽吸搅拌容器内的样品溶液。由此，可以通过不同方式(如，轻轻的振动和抽吸)的搅拌来实施温和且有效的搅拌。因此，无需使用需要盖子的涡旋以及防碍自动化实施的盖子，从而使得预处理过程的完全自动化得以实现。

附图简要说明

图1为示出根据本发明的样品溶液制备方法的程序的流程图；

图2为根据本发明的样品溶液的制备装置的外部立体图；

图3为图2的主要部分的立体放大剖面图；

图4为示出在(a)、(b)和(c)中抽吸搅拌操作的过程的图；

图5为示出搅拌操作程序的时间变化图；

图6为柱子的透视图；

图7为示出在(a)到(g)中提取操作方法的程序的图；

图8示出核酸提取装置的前盖处于打开状态的立体图；

图9为示出核酸提取装置的移动头的图；

图10为示出核酸提取装置的框图；

其中，25表示抽吸式搅拌装置(抽吸式搅拌机构)；27表示振动装置(振摇式搅拌机构)；29表示容器；30b表示核酸吸附性多孔膜(固相)；31表示样品溶液；和100表示样品溶液制备装置。

实施本发明的最佳方式

下文中，将参照附图说明根据本发明的样品溶液的制备方法和样品溶液的制备装置的优选实施方案。

图1为示出根据本发明的样品溶液制备方法的程序的流程图。

在核酸分离和纯化处理S13中，含核酸的样品溶液中的核酸被吸附到核酸吸附性固相上，然后通过洗涤等操作使核酸解吸附。在此类核酸分离和纯化中，在进行所述的处理之前由试验样品制得含核酸的样品溶液。在制备样品溶液S11之后，通过搅拌将样品溶液进行分离和纯化操作。根据本发明，在加入裂解液之后，先通过振摇操作接着通过抽吸搅拌S12来获得进行分离和纯化前的样品溶液。

图2为根据本发明的样品溶液制备装置的外部立体图。

在进行到使用核酸提取装置(如下文所述)之前的步骤中，安装样品溶液制备装置100。样品溶液制备装置100大体上分为装载单元11、搅拌单元13和保持单元15。装载单元11被安装在底座单元17上。装载单元11设有具有框架结构的输送器21，并且输送器21上可布置多个接收盒19，此外，输送器21可以沿XY方向输送这些接收盒19，以便将接收盒19提供给搅拌单元13。将具有控制单元等的支撑单元23(如下文所述)安装在底座单元17的后部，并且支撑单元23承载抽吸式搅拌装置25，该抽吸式搅拌装置是设置在所述搅拌单元13上的抽吸式搅拌机构。

图3为图2的主要部分的立体放大剖面图；图4为示出在(a)、(b)和(c)中抽吸搅拌操作的步骤的图；图5为示出搅拌操作步骤的时间变化图。

在搅拌单元13的下部安装有作为输送器21的一部分的振动装置27，该振动装置是振摇式搅拌机构。振动装置27内部具有装配有电动机等的振动源27a。通过与控制单元相连的PC(包括计算机等)来控制振动源27a的操作。振动装置27通过控制振动源27a的操作轻轻地振动设置在振动装置27之上的接收盒19，并且振动装置27能够通过振摇来搅拌容器29内的样品溶液31，其中容器29容纳在振动装置的内部。

通过沿单方向(图3中箭头V所示的方向)的旋转振摇搅拌来实施振动装置27的振摇式搅拌处理。在本实施方案中，实施这种旋转振摇搅拌的转速为400rpm到2000rpm。当将转速设定在该范围内时，避免了在转速小于或等于400rpm时可能发生的搅拌不充分，同时避免了当转速大于或等于2000rpm时可能发生的因剧烈振摇搅拌而引起的样品溶液的溅洒。由此，使温和且有效的搅拌成为可能。

接收盒19容纳有多个注入了样品溶液的制备容器29。因此，所述的样品溶液31的制备方法可以同时处理注入到多个容器29中的样品溶液31。同样，可以对注入到多个容器29中的样品溶液31同时进行制备或者以组合方式进行制备，由此可以实施有效的操作，而不会发生由于分别向多个容器29中分装或分注样品溶液的操作所造成的错误。

将固定在振动装置27上的接受盒19设置在搅拌单元13中的抽吸式搅拌装置25的正下方。抽吸式搅拌装置25具有多个与容器29相对应的垂直向下的吸管33，并通过(图中未示出)变位机构，将吸管33的末端33a插入到容器29中。吸管33通过供给管路35与压力调节单元37连通，并且压力调节单元37与控制单元中的PC连接，从而通过该控制单元来驱动和控制压力调节单元。

在抽吸式搅拌装置25中，如图4(a)所示，当吸管末端33a插入样品溶液31中时，通过控制单元中的PC来操纵压力调节单元37，并使吸管33内的压力降低，从而将一些样品溶液31吸入(如图4(b)所示)吸管中。然后，如图4(c)所示，使吸管33内的压力增加，并将样品溶液31由吸管33中排出。因此，容器29中的样品溶液31通过抽吸得到搅拌。

通过抽吸式搅拌装置25实施的抽吸式搅拌处理优选的是使单次抽吸的体积为50μl到1000μl。当将抽吸体积设定在该范围内时，避免了由于抽吸的量少而引起的搅拌效果较差，这种情况可能在抽吸体积小于或等于50μl时发生，同时避免了由于被抽吸的样品溶液与未被抽吸的样品溶液的混合不均匀而引起的搅拌效果较差，这种情况可能在抽吸体积大于或等于1000μl时发生。

此外，抽吸式搅拌处理优选的是使抽吸重复次数为10次到100次。当将抽吸重复次数设定在该范围内时，避免了由于抽吸搅拌不充分而引起的收率的降低，这种情况可能在抽吸重复次数小于或等于10次时发生，同时避免了由于过度的抽吸搅拌而引起的收率的降低，这种情况可能在抽吸重复次数大于或等于100次时发生。

同样，还可以在通过从样品溶液31中提取核酸的核酸分离和纯化过程之前的步骤中，将样品溶液的制备装置100用于制备含有核酸的样品溶液31。关于注入有样品溶液31的制备容器29，先通过振动装置27对其施加轻轻的振动，然后通过所述抽吸式搅拌装置25抽吸搅拌容器29内的样品溶液31。因此，如图5所示，可以通过不同方式(如轻轻振动和抽吸)的搅拌来实施温和且有效的搅拌。因此，无需使用需要盖子的涡旋以及防碍自动化实施的盖子，从而使得预处理过程的完全自动化得以实现。

本文中，可将样品溶液31注入制备容器29中的过程称为依次加入蛋白酶、含核酸的样品和预处理液的过程，其中所述预处理液含有选自离液盐、表面活性剂、消泡剂、核酸稳定剂和缓冲液中的至少一种。此外，注入样品溶液31的过程也可以是依次加入预处理液、样品和蛋白酶的过程。注入样品溶液31的过程还可以是依次加入样品、预处理液和蛋白酶的过程。

将样品溶液注入制备容器29中的过程还可以是在加入蛋白酶、样品和预处理液后再加入水溶性有机溶剂的过程。在这种情况下，可由全血制备样品溶液31。此外，水溶性有机溶剂可以含有选自甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的至少一种。

接下来将要描述用于从通过样品溶液的制备装置100制备的样品溶液31中提取核酸的核酸提取装置200。

图6为柱子的透视图。

将通过样品溶液制备装置100制备的样品溶液31从容器29转移到核酸提取装置200的柱子30中。柱子30具有圆筒形主体30a，该主体的顶端是开放的，并将作为固相的核酸吸附性多孔膜30b保持在其底部。该圆筒形主体30a在核酸吸附性多孔膜30b以下的部分的形状为棒状，并且具有细管嘴形状的排放单元30c从底部的中心伸出预定长度。在从柱子30的顶端开口30d分注样品溶液之后、分注洗涤液之后以及分注回收液之后(这些溶液将在下文中说明)，均从顶端开口30d引入压缩空气，而各种溶液则穿过核酸吸附性多孔膜30b向下流动，由排放单元30c排放到废液容器或回收容器(各种容器将在下文中提到)中，以进行排放。此外，如图中所示，圆筒形主体30a具有这样的结构：圆筒形主体30a被分为互相结合并连接在一起的上部和下部。顶端开口30d具有斜面30e，该斜面由周缘内表面被切削成锥形而形成，并且如此形成的该斜面30e与核酸提取装置中压缩空气供给机构的加压嘴(将在下文提到)的倾斜的周缘外表面基本吻合。

图7为示出从(a)到(g)步骤的核酸提取程序的流程图。

以下将说明通过核酸提取装置提取核酸的过程。

在核酸提取处理中，基本上通过图7(a)到(g)所示的提取过程来进行核酸的提取。首先，在图7的步骤(a)中，将含有溶解的核酸的样品溶液S注入设置于废液容器41上方的柱子30中。在随后的步骤(b)中，将压缩空气引入柱子30中，以便向柱子内加压，使样品溶液S穿过核酸吸附性多孔膜30b，并且将穿过了用于吸附核酸的核酸吸附性多孔膜30b的液相成分排放到废液容器41中。

在随后的步骤(c)中，将洗涤液W自动地注入到柱子30中，并且压缩空气也被引入到柱子30中，以便向柱子内加压(此步骤为步骤(d))。当核酸被保留在核酸吸附性多孔膜30b上时，通过洗涤除去其它杂质，而穿过多孔膜的洗涤液W则被排放到废液容器41中。该步骤(c)和步骤(d)可以重复多次。

接着，在步骤(e)中，用回收容器43取代设置于柱子30下方的废液容器41，然后，在步骤(f)中，将回收液R自动地注入到柱子30中。在步骤(g)中，将压缩空气引入到柱子30中以便向柱子内加压，从而使得核酸吸附性多孔膜30b与核酸之间的亲合力减弱，致使被吸附的核酸解离下来，并将含有解离的核酸的回收液R排放到回收容器43中以便回收。

在柱子30内，核酸吸附性多孔膜30b基本上是允许核酸穿过的多孔体，并且该多孔膜的表面具有通过化学亲合力来吸附样品溶液中的核酸的性能。在使用洗涤液进行洗涤的过程中，亲和力得到保持，而在使用回收液进行回收的过程中，核酸的吸附力减弱从而使核酸解离下来。

以下将说明在提取核酸的上述处理中所用的核酸提取装置。

图8示出核酸提取装置的前盖处于打开状态的立体图；图9为示出核酸提取装置的移动头的轮廓的示意图；图10为示出核酸提取装置的轮廓的示意性框图。

核酸提取装置200可具有：保持机构45，其用于排布和保持多个其中容纳有滤膜的柱子30、多个装有废液的废液容器41(参见图10)和多个装有含核酸的回收液的回收容器43(参见图10)；压缩空气供给机构49(参见图9)，其用于由单个加压嘴47将压缩空气引入柱子30中；分注机构53(参见图9)，其具有用于向柱子30中分别注入洗涤液和回收液的分注嘴51；和移动机构55，其用于使压缩空气供给机构49的加压嘴47和保持机构45彼此相对移动。所用的滤膜是核酸吸附性固相(本文所用的核酸吸附性多孔膜)。

核酸提取装置200的装置主体57除了具有保持机构45、压缩空气供给机构49和分注机构53以外，还具有箱形主体单元61(其前面侧被打开了)，并且该主体单元具有在其顶部配置的控制面板59和盖住主体单元61被打开侧的前盖63，其中所述的箱形主体单元61内设有移动机构55等。

压缩空气供给机构49具有以下部分：作为可移动件的移动头65，其可以升起和下降；单个加压嘴47，其被安装在移动头65上；气泵67，其可产生压缩空气；减压阀69；止回阀71，其被设置在加压嘴47的一侧，以便打开和关闭气体供应通路；压力传感器73，其被安装在加压嘴47的一侧；以及加压嘴升降装置，其用于使加压嘴47升起和下降。加压嘴升降装置通过加压嘴升降用电动机75(例如脉冲电动机)和与之相连的螺栓-螺母式机构来实施升降操作。如此构造可以使压缩空气被依次供入到柱子30中。气泵67、减压阀69和加压嘴47各自根据控制单元77的控制命令工作。

上述移动头65具有以下部分：作为移动装置的移动头移动用电动机79(例如脉冲电动机)，其被安装于装置主体57的内部；驱动侧的皮带轮81，其是由移动头移动用电动机79驱动而旋转的；垂直移动侧的皮带轮(图中未示出)，其自由旋转以进行张力调节；以及同步皮带83，其悬接在驱动侧的皮带轮81和垂直移动侧的皮带轮之间。移动头移动用电动机79是根据光传感器85a到85c的检测反馈控制而被驱动的，以便沿柱子30的排布方向来升降移动头65。

将加压嘴47安装在移动头65中，以使其可以上下移动并可向下施加更多的力，此外，位于加压嘴47的下部前端的周缘外表面被制成圆锥形。由此，当加压嘴47向下移动时，设置于柱支架87上的柱子的上端开口30d与加压嘴47的前端接触，以便使被切削成锥形的柱子30的斜面30e贴附在加压嘴47的前端的圆锥形表面上，从而密封柱子30。在这种密封的状态下，就可以将压缩空气供入柱子30中，而不会泄露。

当从气泵67和止回阀71之间的通路中排放空气时，将减压阀69打开通向大气。通过选择性的开启来操作止回阀71，并构建空气环路，以便使压缩空气从气泵67通过加压嘴47而被引入到柱子30中。如此构造可以形成从气泵67到柱子30的气流供应通路。

分注机构53具有以下部分：洗涤液分注嘴51w和回收液分注嘴51r，它们一起被固定于上述移动头65中，该移动头65沿排列在柱支架87上的柱子30的方向是可移动的；洗涤液供给泵52w，其用于将洗涤液瓶56w所容纳的洗涤液W供到洗涤液分注嘴51w中；回收液供给泵52r，其用于将回收液瓶56r所容纳的回收液R供到回收液分注嘴51r中；废液容器91，其被设置在废液容器支架89上；等等。

移动头65通过移动头移动用电动机79驱动和控制，以便使移动头65依次在各个柱子30的上方停下，并在复位后，使移动头65停在废液容器91的上方，从而保持每个柱子30的上方都具有一定的空间。当每个柱子30的上方都留有一定的空间时，工作性能大大提高。

洗涤液分注嘴51w和回收液分注嘴51r的前端向下弯曲，并且洗涤液分注嘴51w通过阀55w与洗涤液供给泵52w连接，而洗涤液供给泵52w与洗涤液瓶56w连接。回收液分注嘴51r通过阀55r与回收液供给泵52r连接，而回收液供给泵52r与回收液瓶56r连接。洗涤液瓶56w和回收液瓶56r分别被固定于装置主体57的前侧，以便提高可操作性。洗涤液供给泵52w和回收液供给泵52r都由管式泵构成，并且它们各自受泵用电动机53w和53r(脉冲电动机)驱动和控制，以便根据传感器54w和54r的位置检测结果而分别注入预定量的洗涤液W和回收液R。这些泵用电动机53w、53r和阀55w、55r都是根据控制单元77的指令来工作的。

当要分注洗涤液W或回收液R时，开启阀55w或55r，并开动泵用电动机53w或53r，使得洗涤液供给泵52w的转动部件或回收液供给泵52r的转动部件转动。因此，通过洗涤液供给泵52w或回收液供给泵52r吸入洗涤液W或回收液R，并由阀55w或55r通过洗涤液分注嘴51w或回收液分注嘴51r排出洗涤液W和回收液R。在进行这种排放时，将洗涤液分注嘴51w或回收液分注嘴51r移动到柱子30的上方。由此，将预定量的洗涤液W或回收液R分注到柱子30中。

洗涤液瓶56w和回收液瓶56r各自由容器主体56wb或56rb以及盖56wu或56ru构成。两个盖56wu和56ru中分别具有细管状的吸管58w和58r，并且吸管58w和58r的下端开口分别在容器瓶主体56wb和56rb的底部附近，从而在操作洗涤液供给泵52w或回收液供给泵52r时，分别抽吸洗涤液W或回收液R。

上述机构45到53分别是由与控制面板59相连的控制单元77根据控制板的输入操作来控制的，该控制板设置于装置主体57的上部。换言之，这些机构是根据存储单元93(与控制单元77连接)中预先存储的程序进行驱动和控制的。此外，当用前盖63从前方盖住装置主体57时，机构45到53中的每一个都被装在装置主体57中，所述前盖63被设置为可从装置主体57上自由拆装。

因此，根据本发明的样品溶液的制备方法包括：在通过从样品溶液31中提取核酸的核酸分离和纯化的过程之前、但在将样品溶液31注入制备容器29中之后的步骤中，进行振摇式搅拌处理(其中，通过对容器施加轻轻的振摇来搅拌样品溶液31)和抽吸式搅拌处理(其中，通过抽吸容器29中的样品溶液31来搅拌样品溶液31)。因此，预处理可以不通过剧烈振摇(如，涡旋)搅拌来进行，而是通过将温和的搅拌和抽吸相结合的方式来进行，并且可以实现预处理过程的完全自动化。结果，通过将含核酸的样品溶液31中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上、然后通过洗涤等操作使核酸解吸附的这一核酸分离和纯化方法在自动化适应性方面是有效、简便、快速和优异的，并且该方法可以再现性地制得含有核酸的样品溶液31。

此外，根据本发明的样品溶液的制备装置100具有：制备容器29，样品溶液31被注入其中；振动装置27，其用于通过轻轻振动容器29来搅拌样品溶液31；以及抽吸式搅拌装置25，其用于通过抽吸容器29中的样品溶液31来搅拌样品溶液31。由此，无需使用需要盖子的涡旋，并且可以通过避免使用防碍自动化实施的盖子而实现预处理过程的完全自动化。结果，通过将含核酸的样品溶液31中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上、然后通过洗涤等操作使核酸解吸附的这一核酸分离和纯化方法在自动化适应性方面是有效、简便、快速和优异的，并且该方法可以再现性地制得含有核酸的样品溶液31。

接下来将详细说明容纳于柱子30中的核酸吸附性固相30b(以核酸吸附性多孔膜作为本文中所用的例子)。

本文所用的核酸吸附性固相可以含有二氧化硅或其衍生物、硅藻土或氧化铝。该固相还可含有有机聚合物。有机聚合物优选为具有多糖结构的聚合物。有机聚合物还可以是醋酸纤维素。有机聚合物还可以是通过对醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物进行皂化而得到的有机聚合物。有机聚合物可以是再生纤维素。以下将给出关于这些方面的详细描述。

柱子30中所容纳的核酸吸附性固相30b基本是多孔的，以便使核酸能够穿过，并且该固相的表面具有通过化学亲和力来吸附样品溶液中的核酸的性能。在使用洗涤液进行洗涤的过程中，该亲和力得到保持，而在使用回收液进行回收过程中，核酸的吸附力减弱从而使核酸解离下来。

核酸提取柱30中所容纳的核酸吸附性固相30b是以基本不涉及离子键的相互作用来吸附核酸的多孔固相。这意味着多孔固相的使用条件是多孔固相没有发生“离子化”，并且据信：环境极性的改变使得核酸和多孔固相之间相互吸引。因此，多孔固相具有优异的分离性能和优良的洗涤效率，并可以分离和纯化核酸。优选的是，核酸吸附性多孔固相是具有亲水性基团的多孔固相，并且据信：环境极性的改变使得核酸和多孔固相的亲水性基团之间相互吸引。

亲水性基团是指能与水发生相互作用的极性基团(原子团)，并且包括所有参与吸附核酸的基团(原子团)。优选的是，亲水性基团是可以与水以中等水平相互作用的亲水性基团(参见由共立出版株式会社出版的《化学大词典》中所述的关于“亲水性基团”中的“亲水性不太强的基团”)，并且其实例包括：羟基、羧基、氰基和氧基亚乙基等。优选羟基。

本文中，具有亲水性基团的多孔固相是指这样的多孔固相，其中构成多孔固相的材料其本身具有亲水性基团，或者是这样的多孔固相，通过对构成多孔固相的材料进行处理或涂敷而将亲水性基团引入多孔固相中。构成多孔固相的材料可以是有机或无机材料。例如，可以使用这样的多孔固相，其中构成多孔固相的材料本身是具有亲水性基团的有机材料；可以使用这样的多孔固相，其中通过对不具有亲水性基团的有机材料多孔固相进行处理，从而向其中引入亲水性基团而制成的固相；可以使用这样的多孔固相，其中通过用具有亲水性基团的材料对不具有亲水性基团的有机材料固相进行涂敷，从而向其中引入亲水性基团而制成的固相；可以使用这样的多孔固相，其中构成多孔固相的材料本身为具有亲水性基团的无机材料而制成的固相；可以使用这样的多孔固相，其中通过对不具有亲水性基团的无机材料多孔固相进行处理，从而向其中引入亲水性基团而制成的固相；可以使用这样的多孔固相，其中通过用具有亲水性基团的材料对不具有亲水性基团的无机材料多孔固相进行涂敷，从而向其中引入亲水性基团而得到的固相等等。为了处理方便，优选使用有机材料(如，有机聚合物)作为构成多孔固相的材料。

具有亲水性基团的材料的多孔固相可以是具有羟基的多孔固相或有机材料。具有羟基的有机材料多孔固相的实例包括由以下物质构成的多孔固相：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氧乙烯、醋酸纤维素、乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物等。尤其优选使用具有多糖结构的有机材料多孔固相。

优选使用由乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物构成的有机聚合物多孔固相作为具有羟基的有机材料多孔固相。关于乙酰值互异的醋酸纤维素混合物，可以优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物；以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。

特别是，可以优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合比(质量比)优选为99∶1到1∶99、更优选为90∶10到50∶50。

具有羟基的更优选的有机材料可以举出在专利文献JP-A No.2003-128691中所述的醋酸纤维素的表面皂化产物。醋酸纤维素的表面皂化产物是通过将乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物皂化而得到的产物，并且优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化产物，三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物，三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物，以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物。更优选的是，使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化产物。三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的混合比(质量比)优选为99∶1到1∶99。更优选的是，三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的混合比为90∶10到50∶50。在这种情况下，可以根据固相表面上的羟基的量(密度)控制皂化处理的程度(皂化率)。为了提高核酸的分离效率，优选的是羟基的量(密度)大。例如，在醋酸纤维素(如，三醋酸纤维素)的情况下，皂化率(表面皂化率)优选为约5％或更高、更优选为10％或更高。此外，为了增加具有羟基的有机聚合物的表面积，优选的是，对醋酸纤维素的多孔固相进行皂化。在这种情况下，多孔固相可以是表面和内部是对称性的多孔膜，但优选使用表面和内部是不对称的多孔膜。

皂化处理是指醋酸纤维素与皂化处理液(例如，氢氧化钠水溶液)接触。由此，与皂化处理液接触的醋酸纤维素部分被转化为再生纤维素，其中羟基被引入纤维素中。如此制备的再生纤维素与初始纤维素在晶态等方面是不同的。

此外，为了改变皂化率，优选通过改变氢氧化钠的浓度来实施皂化处理。通过NMR、IR或XPS(例如，皂化率可以通过检测羰基峰减弱的程度来确定)可以容易地测定皂化率。

可以把在聚合物主链或侧链上具有亲水性基团的接枝聚合物链键合到多孔固相上作为向不具有亲水性基团的有机材料多孔固相引入亲水性基团的方法。

关于将接枝聚合物链键合到有机材料多孔固相上的方法，可以提及两种方法：使接枝聚合物链与多孔固相化学键合的方法；以及使用多孔固相作为起始点、使具有可聚合双键的化合物聚合从而得到接枝聚合物链的方法。

首先，在通过化学键合使多孔固相和接枝聚合物链连接的方法中，可通过使用在聚合物的末端或侧链上具有能够与多孔固相发生反应的官能团的聚合物、并使这种聚合物的官能团与多孔固相的官能团发生化学反应来接枝聚合物链。对能与多孔固相发生反应的官能团没有特别限定，只要它能与多孔固相的官能团反应即可，并且其实例包括：硅烷偶联基(例如烷氧基硅烷)、异氰酸基、氨基、羟基、羧基、磺酸基、磷酸基、环氧基、烯丙基、甲基丙烯酰基和丙烯酰基等。

特别有用的在聚合物的末端或侧链上具有反应性官能团的化合物可以举例为：在聚合物末端具有三烷氧基甲硅烷基的聚合物、在聚合物末端具有氨基的聚合物、在聚合物末端具有羧基的聚合物、在聚合物末端具有环氧基的聚合物以及在聚合物末端具有异氰酸基的聚合物。对用于此目的的聚合物没有特别限定，只要该聚合物具有参与吸附核酸的亲水性基团即可，并且其具体实例包括：聚羟乙基丙烯酸和聚羟乙基甲基丙烯酸以及它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸以及它们的盐、聚氧化亚乙基等。

通过以多孔固相作为起始点、使具有可聚合的双键的化合物进行聚合而形成接枝聚合物链的方法通常被称为表面接枝聚合法。表面接枝聚合法是指这样一种方法：通过等离子体辐射、光辐射、加热等方法，在基材表面上形成活性部位，并且将被设置为与多孔固相接触的、具有可聚合双键的化合物通过聚合反应键合到多孔固相上。

用于形成与基材键合的接枝聚合物链的化合物需要具有两个特征：一个特征是具有可聚合的双键，另一个特征是具有参与吸附核酸的亲水性基团。对于此类化合物，可以使用具有亲水性基团的聚合物、具有亲水性基团的低聚物和具有亲水性基团的单体中的任何一种，只要其分子中具有双键即可。特别有用的化合物是具有亲水性基团的单体。

特别有用的具有亲水性基团的单体的具体实例包括以下的单体。例如，可特别优选使用诸如丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、单甲基丙烯酸甘油酯等之类的具有羟基类基团的单体。还优选使用诸如丙烯酸、甲基丙烯酸等之类的含羧基的单体，或它们的碱金属盐和胺盐。

可以用具有亲水性基团的材料进行涂敷作为将亲水性基团引入到不具有亲水性基团的有机材料多孔固相中的另一种方法。对用于涂敷的材料没有特别限定，只要该材料具有参与核酸吸附的亲水性基团即可，但是为了使操作简单，有机材料的聚合物是优选的。此类聚合物的实例包括：聚羟乙基丙烯酸和聚羟乙基甲基丙烯酸以及它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸以及它们的盐、聚氧化亚乙基、醋酸纤维素以及乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物，等等，并且优选为具有多糖结构的聚合物。

此外，可将醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物涂敷到不具有亲水性基团的有机材料多孔固相上，然后将所涂敷的醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物进行皂化。在这种情况下，皂化率优选为约5％或更大。此外，皂化率更优选为约10％或更大。

具有亲水性基团的无机材料多孔固相可举例为含有二氧化硅或其衍生物、硅藻土或氧化铝的上述多孔固相。含有二氧化硅化合物的多孔固相可举例为玻璃滤膜。此外，还可提及日本专利No.3058342所述的二氧化硅多孔薄膜。这种二氧化硅多孔薄膜可按以下方法制备：把能够形成双分子层的阳离子两性物质的展开液铺展到基材上，随后通过从基材上的液体膜中除去溶剂，而使所述的两性物质形成多层双分子层薄膜，使多层双分子层薄膜与含有二氧化硅化合物的溶液接触，然后通过取下多层双分子层薄膜而将该薄膜移走。

关于向不具有亲水性基团的无机材料多孔固相引入亲水性基团的方法，可以提及两种方法：使多孔固相和接枝聚合物链化学键合的方法；以及使用分子内具有双键和亲水性基团的单体、将多孔固相用作起始点使接枝聚合物链聚合的方法。

在通过化学键合将多孔固相和接枝聚合物链连接起来的情况下，将能够与接枝聚合物链末端的官能团发生反应的官能团引入无机材料中，并且使接枝聚合物链化学键合到无机材料上。在使用分子内具有双键和亲水性基团的单体与作为起始点的多孔固相聚合的情况下，将作为具有双键的化合物进行聚合时的起始点的官能团引入无机材料中。

可优选使用在上文中就不具有亲水性基团的有机材料多孔固相与接枝聚合物链化学键合的方法所述的那些具有亲水性基团的接枝聚合物和分子内具有亲水性基团和双键的那些单体，作为具有亲水性基团的接枝聚合物和分子内具有双键和亲水性基团的单体。

可以用具有亲水性基团的材料进行涂敷作为向不具有亲水性基团的无机材料多孔固相中引入亲水性基团的另一种方法。对涂敷所用的材料没有限定，只要该材料具有参与核酸吸附的亲水性基团即可，但为了易于操作，有机材料的聚合物是优选的。聚合物的实例包括：聚羟乙基丙烯酸和聚羟乙基甲基丙烯酸以及它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸以及它们的盐、聚氧化亚乙基、醋酸纤维素以及乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物等。此外，具有多糖结构的聚合物是优选的。

此外，可以用醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合物涂敷不具有亲水性基团的无机材料多孔固相，然后可以将经涂敷的醋酸纤维素和乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物皂化。在这种情况下，皂化率优选为约5％或更大。此外，皂化率更优选为约10％或更大。

作为不具有亲水性基团的无机材料多孔固相，可以提及通过对金属(如铝)、玻璃、水泥、陶瓷(如瓷、新型陶瓷)、硅、活性炭等进行加工而制成的多孔固相。

核酸吸附性多孔固相可以在其形成上述的膜形式之后使用。此外，核酸吸附性多孔固相还可以在根据柱子等的形状制成颗粒状或块状之后使用。

当将核酸吸附性多孔固相制成膜形式时，核酸吸附性多孔膜能够使溶液穿过其内部，因此，膜的厚度为10μm到500μm。更优选的是，核酸吸附性多孔膜的厚度为50μm到250μm。为了容易洗涤，膜的厚度越薄就越理想。

溶液可从其内部穿过的核酸吸附性多孔膜的最小孔径为0.22μm或更大。更优选的是，核酸吸附性多孔膜的最小孔径为0.5μm或更大。此外，使用最大孔径与最小孔径之比为大于或等于2的多孔膜是有利的。这样，可得到足够的用于吸附核酸的表面积，同时不容易堵塞。甚至更优选的是，最大孔径与最小孔径之比为5或更大。

能够使溶液穿过其内部的核酸吸附性多孔膜的孔隙率为50％到95％。更优选的是，孔隙率为65％到80％。核酸吸附性多孔膜的泡点为0.1kgf/cm²到10kgf/cm²。更优选的是，泡点为0.2kgf/cm²到4kgf/cm²。

能够使溶液穿过其内部的核酸吸附性多孔膜的压力损失优选为0.1kPa到100kPa。因此，可在过压出现时获得均匀的压力。更优选的是，压力损失为0.5kPa到50kPa。本文中，压力损失是指就膜而言，使水每穿过100μm的膜厚所需的最小压力。

对于能使溶液穿过其内部的核酸吸附性多孔膜而言，当水在25℃、1kg/cm²的压力下穿过时，每1cm²的膜上每分钟水的渗滤量优选为1mL到5000mL。更优选的是，当水在25℃、1kg/cm²的压力下穿过时，每1cm²的膜上每分钟水的渗滤量为5mL到1000mL。

对于能够使溶液穿过其内部的核酸吸附性多孔膜而言，每1mg多孔膜的核酸吸附量为0.1μg或更多。更优选的是，每1mg多孔膜的核酸吸附量为0.9μg或更多。

能够使溶液穿过其内部的核酸吸附性多孔膜优选为这样的纤维素衍生物：在将边长为5mm的正方形多孔膜浸渍在5mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内不溶解，但是在48小时以内溶解。此外，更优选的是这样的纤维素衍生物：在将边长为5mm的正方形多孔膜浸渍在5mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内溶解，但是在将所述膜浸渍在5mL二氯甲烷中时，该纤维素衍生物在24小时以内不溶解。

在含有核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，从使样品溶液与多孔固相均匀接触的角度而言，优选的是，使样品溶液从多孔膜的一侧流到另一侧。在含有核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，从使孔不容易被堵塞的角度而言，优选的是，使样品溶液以从多孔膜较大孔径的一侧向较小孔径的一侧穿过多孔膜。

在含有核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，流速优选为：每cm²的膜表面积2μL/秒到1500μL/秒，以便向溶液与多孔膜提供合适的接触时间。当溶液与多孔膜的接触时间过短时，不能得到充分的核酸提取效果。当接触时间过长时，从可操作性来说是不理想的。此外，流速优选为：每cm²膜表面积5μL/秒到700μL/秒。

可以使用能够使所用溶液通过其内部的单层核酸吸附性多孔膜，但也可以使用多层此类膜。多层的核酸吸附性多孔膜可以是相同或者是不同的。

多层核酸吸附性多孔膜可以由无机材料的核酸吸附性多孔膜和有机材料的核酸吸附性多孔膜的组合构成。例如，可以提及的是玻璃滤膜和再生纤维素多孔膜的组合。此外，多层核酸吸附性多孔膜可以是无机材料的核酸吸附性多孔膜和有机材料的核酸非吸附性多孔膜的组合，并且可以举例为玻璃滤膜和尼龙(或聚砜)多孔膜的组合。

接着，将详细说明样品溶液。

<含有核酸的样品溶液>

含有核酸的样品溶液可以通过用含有以下成分的预处理液进行处理而得到，所述成分为选自核酸稳定剂、离液盐、表面活性剂、缓冲液、消泡剂和蛋白酶中的至少一种，并且特别优选的溶液是通过加入水溶性有机溶剂得到的溶液。

(试验样品)

对可用于本发明的试验样品没有特别限定，只要该试验样品含有核酸即可。例如，在诊断领域中可以提及的是体液，如所收集的全血、血浆、血清、尿、粪便、精液、唾液等；或者生物材料，如植物(或其一部分)、动物(或其一部分)、细菌、病毒等。这些试验样品可以以获得时的状态使用，也可以以其溶解液或匀浆作为样品。

“样品”是指含有核酸的任何样品。更具体地说，可以提及关于上述试验样品中所述的那些。样品溶液中可以含有一种类型的核酸，或者可以两种或多种类型的核酸。对提供给上述核酸分离和纯化方法的各种核酸的长度没有特别限定，其可以是(例如)从几bp到几Mbp的任何长度的核酸。通常，从可操作性的角度而言，核酸的长度优选为几bp到几百kbp。

根据本发明，“核酸”可以是任何单链或双链的DNA或RNA，并且对其分子量也没有限定。

优选的是，通过以下方法获得的试验样品作为含有核酸的样品溶液：溶解细胞膜、核膜等；并将核酸分散在水溶液中。

(消泡剂)

消泡剂可以举出以下试剂：有机硅类消泡剂(例如，硅油、二甲基聚硅氧烷、有机硅乳液、改性聚硅氧烷和有机硅复合物等)、醇类消泡剂(例如，炔二醇、庚醇、乙基己醇、高碳醇和聚氧化亚烷基二醇等)、醚类消泡剂(例如，庚基溶纤剂和壬基溶纤剂-3-庚基山梨糖醇等)、脂肪和油类消泡剂(例如，动物油和植物油等)、脂肪酸类消泡剂(例如，硬脂酸、油酸和棕榈酸等)、金属皂类消泡剂(例如，硬脂酸铝和硬脂酸钙等)、脂肪酸酯类消泡剂(例如，天然蜡和磷酸三丁酯等)、磷酸盐酯类消泡剂(例如，辛基磷酸钠等)、胺类消泡剂(例如，二戊基胺等)、酰胺类消泡剂(例如，硬脂酸酰胺等)、其它消泡剂(例如，硫酸铁(III)和矾土等)等等。优选的是有机硅类消泡剂和醇类消泡剂。这些消泡剂可以单独使用或组合使用。特别优选的是，将两种成分(包括选自有机硅类消泡剂中的一种和选自醇类消泡剂中的另一种)组合在一起作为消泡剂。对于醇类消泡剂而言，优选炔二醇类消泡剂。

可以直接将消泡剂加入试验样品中，或将消泡剂包含在被用作核酸溶解试剂的预处理液中。当预处理液中不含有消泡剂时，加入消泡剂的时间可以在使用预处理液之前或使用预处理液之后。

消泡剂在含核酸的样品溶液中的浓度优选为0.1质量％到10质量％(在本说明书中，质量％等于重量％。)

(核酸稳定剂)

关于核酸稳定剂，可以提及具有使核酸酶的活性失活作用的那些。根据试验样品的不同，降解核酸的核酸酶等最初可能包含在试验样品中，并且当核酸被均化时，核酸酶可作用于核酸，从而导致收率显著降低。由于核酸稳定剂可以有助于试验样品中的核酸稳定存在，因此，是需要它的。

关于具有使核酸酶活性失活的功能的核酸稳定剂，可使用通常被用作还原剂的那些化合物。还原剂的实例包括：氢化化合物，例如，氢气、碘化氢、硫化氢、氢化铝锂和硼氢化钠等；具有高正电性的金属，例如，镁、钙、铝和锌等，或它们的汞合金；醛类；糖类；有机氧化物，例如，甲酸、草酸等；巯基化合物；等等。在这些物质当中，巯基化合物是优选的。巯基化合物可以举例为N-乙酰半胱氨酸、巯基乙醇和烷基硫醇等。具体而言，β-巯基乙醇是优选的。巯基化合物可以单独使用或者多种组合使用。

预处理液中可以使用的核酸稳定剂的浓度优选为0.1质量％到20质量％、更优选为0.3质量％到15质量％。预处理液中可以使用的巯基化合物浓度优选为0.1质量％到10质量％、更优选为0.5质量％到5质量％。

此外，可以使用螯合剂作为具有使核酸酶的活性失活的功能的核酸稳定剂。螯合剂的实例包括：乙二胺四乙酸盐(EDTA)、次氨基三乙酸酯(NTA)、EGTA等。螯合剂可以单独使用或者多种组合使用。预处理液中可以使用的螯合剂的浓度优选为1mmol/L到1mol/L、更优选为5mmol/L到100mmol/L。

(离液盐)

关于离液盐，可以使用胍盐、异氰酸钠、碘化钠、碘化钾等。在这些物质中，胍盐是优选的。胍盐的实例包括：盐酸胍、异硫氰酸胍和硫氰酸胍，并且在这些胍盐之中，盐酸胍是优选的。这些盐可单独使用或者多种组合使用。预处理液中离液盐的浓度优选为0.5mol/L或更高、更优选为0.5mol/L到4mol/L、甚至更优选为1mol/L到3mol/L。

脲也可以被用作离液物质来代替离液盐。

(表面活性剂)

关于表面活性剂，可以提及非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂和两性离子表面活性剂。

根据本发明，可优选使用非离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂。

非离子型表面活性剂包括：聚氧化亚乙基烷基苯基醚类表面活性剂、聚氧化亚乙基烷基醚类表面活性剂和脂肪酸烷醇酰胺，并且优选为聚氧化亚乙基烷基醚类表面活性剂。在聚氧化亚乙基(POE)烷基醚类表面活性剂中，更优选的是，POE癸醚、POE月桂基醚、POE十三烷基醚、POE亚烷基癸醚、POE脱水山梨糖醇单月桂酸酯、POE脱水山梨糖醇单油酸酯、POE脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、四油酸聚氧乙烯山梨糖醇、POE烷基胺和POE乙炔二醇(acetylene glycol)。

阳离子型表面活性剂的实例包括：溴化十六烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵和氯化十六烷基吡啶。

这些表面活性剂可以单独使用或者多种组合使用。预处理液中表面活性剂的浓度优选为0.1质量％到20质量％。

(缓冲液)

关于缓冲液，可以提及的是常规pH缓冲液。优选的是，可以提及生物化学试验中通常使用的pH缓冲液。这种缓冲液的实例包括含有以下物质的缓冲液：柠檬酸盐、磷酸盐或乙酸盐、Tris-HCl、TE(Tris-HCl/EDTA)、TBE(Tris-硼酸/EDTA)、TAE(Tris-乙酸/EDTA)、以及Good缓冲液。Good缓冲液的实例包括：MES(2-吗啉代乙磺酸)、Bis-Tris(双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷)、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、PIPES(哌嗪-1，4-双(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)和TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)。

预处理液中所包含的这些缓冲液的浓度优选为1mmol/L到300mmol/L。

(蛋白酶)

关于蛋白酶，可以提及丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，并且优选可使用至少一种蛋白酶。此外，还可优选使用多种蛋白酶的混合物。

为了增加核酸回收量和回收效率、减少所需的含有核酸的试验样品的量和进行快速操作，预处理液中优选含有蛋白酶。

对丝氨酸蛋白酶没有特别限定，例如，可优选使用蛋白酶K等。对半胱氨酸蛋白酶没有特别限定，例如，可优选使用木瓜蛋白酶、组织蛋白酶等。对金属蛋白酶没有特别限定，例如，可优选使用羧肽酶等。

优选的是，预处理液中蛋白酶的浓度为在添加后达到每毫升总体积有0.001IU到10IU、更优选为0.01IU到1IU。

此外，可优选使用不含核酸酶的那些蛋白酶。此外，可优选使用含有稳定剂的蛋白酶。关于稳定剂，可优选使用金属离子。具体地说，优选镁离子，并且可以以(例如)氯化镁等形式添加镁离子。当蛋白酶含有稳定剂时，可以减少核酸回收过程中所需的蛋白酶的量，由此减少核酸回收所需的成本。

在预处理液中，蛋白酶稳定剂的浓度优选为1mmol/L到1000mmol/L、更优选为10mmol/L到100mmol/L。

在使用蛋白酶的情况下，需要进行温育。在该情况下，温育条件可以是如下的条件：环境温度为从室温到80℃，并且优选为从40℃到70℃。

蛋白酶可以在预先与离液盐、表面活性剂、缓冲液和其它试剂混合后作为预处理液(以下称为预处理液A)而用于回收核酸。

此外，可以以两种或多种试剂的形式将蛋白酶与含有离液盐、表面活性剂、缓冲液和其它试剂的预处理液(以下称为预处理液B)分开使用。在后一情况下，将含有蛋白酶的试剂首先与试验样品混合，然后再与预处理液B混合。还可以首先将预处理液B与试验样品混合，然后再与蛋白酶混合。

此外，可以以滴眼药水的方式将蛋白酶从蛋白酶存放容器中直接滴加到试验样品中或试验样品与预处理液B的液体混合物中。在此情况下，操作更简便。

预处理液还优选为以干燥态形式供给，换言之，就是以预处理剂形式供给。此外，可以使用预先容纳有干燥态(如，冷冻-干燥态)形式的蛋白酶的容器。可通过使用上述预先容纳有预处理剂和/或干燥态蛋白酶的容器得到含有核酸的样品溶液。

当通过上述方法获得含有核酸的样品溶液时，预处理剂和干燥态的蛋白酶的贮存稳定性是良好的，由此，可在不影响核酸收率的条件下方便地进行操作。

此外，从增加样品溶液中含有的化合物的溶解度这一角度考虑，可以将水溶性有机溶剂加入到预处理液中。水溶性有机溶剂可以举例为：醇类、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺等。在这些物质中，醇类是优选的。关于醇类，伯醇、仲醇和叔醇都是优选的。具体而言，可以提及甲醇、乙醇、丙醇及其异构体、以及丁醇及其异构体等，并且在这些物质中，乙醇是特别优选的。这些水溶性有机溶剂可以单独使用或者多种组合使用。在含有核酸的样品溶液中，优选的是，将水溶性有机溶剂的浓度调节为1质量％到20质量％。

{水溶性有机溶剂与吸附过程}

含有核酸的样品溶液优选的是通过另加入了水溶性有机溶剂而得到的溶液。通过将水溶性有机溶剂加入到含有溶解的且分散的核酸的溶液中并将该溶液与固相接触，可有效地将样品溶液中的核酸吸附到固相上。换言之，优选的是，通过这样的方式得到含有核酸的样品溶液：另将水溶性有机溶剂加入到通过用上述预处理液处理而得到的溶液中。此外，优选的是，使盐存在于所得到的含核酸的样品溶液中，这是因为盐有利于溶解的核酸更有效地吸附到固相上。

水溶性有机溶剂和盐的存在破坏了存在于核酸周围的水分子所形成的水化结构，由此，使核酸的溶解处于一种不稳定的状态。据推测，当处于这种状态的核酸与固相接触时，核酸表面上的极性基团与固相表面上的极性基团之间相互作用，从而使核酸吸附到固相的表面上。特别是，当将其表面上具有羟基的有机聚合物用作固相时，该聚合物由于其所产生的显著吸附作用而成为优选。根据本发明的方法，为了使核酸不稳定，优选的是，将含有上述的溶解的核酸的混合溶液与水溶性有机溶剂相混合，并使盐存在于所得的核酸混合溶液中。

这种水溶性有机溶剂可以举例为：醇类、丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺等。在这些物质中，醇类是优选的。关于醇类，伯醇、仲醇和叔醇都是优选的。在这些物质中，可以优选使用甲醇、乙醇、丙醇及其异构体、以及丁醇及其异构体。更优选的是，可以使用乙醇。这些水溶性有机溶剂可单独使用或者多种组合使用。

在含有核酸的样品溶液中，水溶性有机溶剂的最终浓度优选为5质量％到90质量％。所加入的乙醇的浓度在该范围内时，不会形成聚集体，并且特别优选的是，尽可能增加乙醇的浓度。该浓度更优选为20质量％到70质量％。

优选存在于所得到的核酸混合溶液中的盐可以举例为：各种离液物质(胍盐、碘化钠、高氯酸钠)、氯化钠、氯化钾、氯化铵、溴化钠、溴化钾、氯化钾、溴化钙、溴化铵等。具体而言，胍盐是特别优选的，这是因为它们既具有溶解细胞膜的效果又具有溶解核酸的效果。

待使用的所得的样品溶液其pH优选为pH3到10、更优选为pH4到9、甚至更优选为pH5到8。

此外，所得的含核酸的样品溶液的表面张力优选为0.05J/m²或更低，粘度优选为1mPa到10,000mPa，比重优选为0.8到1.2。当将其性质满足所述范围的溶液用于吸附步骤时，通过使含有核酸的样品溶液与固相接触来进行吸附后所残留的溶液可以容易地在洗涤步骤中除去。

[第一实施方案]

(1)核酸分离和纯化容器的制备

由聚丙烯制备其内径为7mm的核酸纯化容器，该核酸纯化容器容纳有核酸吸附固相，并具有两个开口。

(2)核酸分离和纯化装置

把通过将三醋酸纤维素多孔膜皂化而得到的多孔膜用作核酸吸附性多孔膜，并且将其置于以上(1)所制备的纯化核酸用柱子内的核酸吸附性多孔膜的支撑部件中。

(3)DNA溶解试剂和洗涤液的制备

制备表1所列出的DNA溶解试剂和洗涤液。

表1

DNA溶解试剂	382g盐酸胍(Life Technologies有限公司)、12.1gTris(Life Technologies有限公司)、10g吐温20(Wako Pure Chemical Industries有限公司)、1000ml蒸馏水
		洗涤液	10mM Tris-HCl 50％乙醇

(4)核酸纯化操作

用真空采血管收集200μl人的全血。向其中加入200μl表1所列出的DNA溶解试剂和20μl蛋白酶K，并将混合物在60℃下温育10分钟。温育后，加入200μl乙醇，并搅拌。

在表2所列的条件下进行搅拌。在表3所列的条件下进行抽吸。

搅拌后，将上述经处理的全血样品注入以上(1)和(2)所制备的核酸纯化装置(容纳有多孔膜或由乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物构成的有机聚合物)的第一开口中，随后将第一开口连接到压力差产生装置上，以便向核酸分离和纯化装置内加压。使含有被注入全血样品的样品溶液穿过多孔膜，以便使其与多孔膜接触，并将该样品溶液从核酸分离和纯化装置的另一开口排出。

随后，将洗涤液注入到核酸分离和纯化装置的第一开口中，并将第一开口连接到压力差产生装置上，以便向核酸分离和纯化装置内加压。使所注入的洗涤液穿过多孔膜，并通过另一开口排出。随后，将回收液注入到核酸分离和纯化装置的第一开口中，并将第一开口连接到压力差产生装置上，以便向核酸分离和纯化装置内加压。使所注入的回收液穿过多孔膜，并通过另一开口排出。

(5)DNA分离和纯化的确认

测定回收液在260nm处的吸收波谱以测定DNA的收率。

表2示出了对比例和实施例中搅拌条件和DNA收率的关系，表3示出了抽吸条件和DNA收率的关系。

表2

搅拌条件

	对比例					实施例
												1	2	3	4	5	1	2	3	4	5	6
	振摇条件(rpm)	无	1200	无	1200	-	1200	1600	2000	1000	800												400
振摇时间												-	20秒	-	1分钟	-	20秒	20秒	20秒	20秒	20秒	20秒
	抽吸次数	无	无	10×	无	50×	10×	10×	10×	10×	10×												10×
回收量(μg)												0.3	1.2	0.9	1.2	1.5	4.3	4.2	4.5	4.1	4.2	3.9

表3

抽吸条件

	对比例				实施例
								1	2	3	4	1	2	3
	抽吸次数(次)	5	300	20	100	10	100								20
体积(μl)								100	100	10	2000	100	100	50
	回收量(μg)	2.4	2.2	1.1	2.3	4.1	4.3								4.3

从表2和表3中的结果可以看出，两种搅拌条件的组合(如振摇搅拌和抽吸搅拌)可以使DNA收率显著提高。

工业实用性

根据本发明的样品溶液的制备方法包括：在从样品溶液中提取核酸的核酸分离和纯化过程之前的步骤中，在将样品溶液注入制备容器之后，对样品溶液进行振摇式搅拌处理和抽吸式搅拌处理，其中，振摇式搅拌处理是通过轻轻振动容器来搅拌样品溶液的，抽吸式搅拌处理是通过抽吸容器内的样品溶液来搅拌样品溶液的。因此，预处理可以不通过剧烈振摇(如涡旋)搅拌进行，而可以通过将温和搅拌和抽吸相结合来进行，因此可以实现预处理过程的完全自动化。结果，通过将含核酸的样品溶液中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上、然后通过洗涤等操作使核酸解吸附的这一核酸分离和纯化方法，在自动化适应性方面是有效、简便、快速和优异的，并且该方法可以再现性地制得含有核酸的样品溶液。

根据本发明的样品溶液的制备装置是用于制备含有核酸的样品溶液的样品溶液制备装置，该装置具有：制备容器，样品溶液被注入其中；振摇式搅拌机构，用于通过轻轻振动容器来搅拌样品溶液；以及抽吸式搅拌机构，用于通过抽吸容器内的样品溶液来搅拌样品溶液。因此，无需使用需要盖子的涡旋，并且可以避免使用防碍自动化实施的盖子，由此可以实现预处理过程的完全自动化。结果，通过使含有核酸的样品溶液中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上、然后通过洗涤等操作使核酸解吸附的这一核酸分离和纯化方法，在自动化适应性方面是有效、简便、快速和优异的，并且该方法可以再现性地制得含有核酸的样品溶液。

本申请中已要求外国优先权的每一个外国专利申请的全部公开内容以引用的方式并入本文，如同全部列出的一样。

Claims (18)

1.一种样品溶液的制备方法，其是在通过从样品溶液中提取核酸的核酸分离和纯化过程之前的步骤，该方法包括：

将样品溶液注入制备容器中；

对该样品溶液进行振摇式搅拌处理，其中，通过轻轻振动所述容器来搅拌所述的样品溶液；

对所述的样品溶液进行抽吸式搅拌处理，其中，通过抽吸所述容器内的样品溶液来搅拌该样品溶液。

2.根据权利要求1所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的振摇式搅拌处理包括旋转振摇搅拌，并且该旋转振摇搅拌的转速为400rpm到2000rpm。

3.根据权利要求1或2所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的抽吸式搅拌处理是以单次抽吸体积为50μl到1000μl的方式进行的。

4.根据权利要求1到3中任意一项所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的抽吸式搅拌处理是以所述抽吸的重复次数为10次到100次的方式进行的。

5.根据权利要求1到4中任意一项所述的样品溶液的制备方法，该方法包括对注入到所述容器内的多个样品溶液同时进行处理。

6.根据权利要求1到5中任意一项所述的样品溶液的制备方法，

其中将所述样品溶液注入到所述制备容器中的所述过程包括：加入蛋白酶、含核酸的样品和预处理液的过程，该预处理液含有选自下列物质中的至少一种：离液盐、表面活性剂、消泡剂、核酸稳定剂和缓冲液，并且

其中所述蛋白酶、所述样品和所述预处理液的加入次序为：

以所述预处理液、所述样品和所述蛋白酶这样的次序加入，或者

以所述样品、所述预处理液和所述蛋白酶这样的次序加入。

7.根据权利要求6所述的样品溶液的制备方法，

其中将所述样品溶液注入所述制备容器中的所述过程还包括：在加入所述蛋白酶、所述样品和所述预处理液之后，加入水溶性有机溶剂。

8.根据权利要求6或7所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的样品溶液是通过制备全血而得到的。

9.根据权利要求7所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的水溶性有机溶剂含有以下物质中的至少一种：甲醇、乙醇、丙醇和丁醇。

10.根据权利要求7所述的样品溶液的制备方法，

其中在所述的加入水溶性有机溶剂之后，使所述的样品溶液与核酸吸附性固相接触。

11.根据权利要求10所述的样品溶液的制备方法，

其中所述固相为膜形式。

12.根据权利要求10或11所述的样品溶液的制备方法，

其中所述固相含有二氧化硅或其衍生物、硅藻土或氧化铝。

13.根据权利要求10到12中任意一项所述的样品溶液的制备方法，

其中所述固相含有有机聚合物。

14.根据权利要求13所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的有机聚合物为具有多糖结构的有机聚合物。

15.根据权利要求13或14所述的样品溶液的制备方法，

其中所述有机聚合物为醋酸纤维素。

16.根据权利要求13或14所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的有机聚合物是通过将醋酸纤维素皂化或将乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物皂化而得到的。

17.根据权利要求13或14所述的样品溶液的制备方法，

其中所述的有机聚合物是再生纤维素。

18.一种样品溶液的制备装置，其用于在通过从样品溶液中提取核酸的核酸分离和纯化过程之前的步骤中制备含核酸的样品溶液，该样品溶液制备装置具有：

制备容器，所述的样品溶液被注入其中；

振摇式搅拌机构，用于通过轻轻振动所述容器来搅拌所述的样品溶液；以及

抽吸式搅拌机构，用于通过抽吸所述容器内的所述样品溶液来搅拌该样品溶液。

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