CN101233233A

CN101233233A - 分离和纯化rna的方法

Info

Publication number: CN101233233A
Application number: CNA200680028099XA
Authority: CN
Inventors: 猪股弘子; 守智子
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2005-08-30
Filing date: 2006-08-30
Publication date: 2008-07-30

Abstract

本发明涉及一种分离和纯化RNA的方法，该方法包括下列步骤：使含核酸的样品溶液、洗涤液和回收液分别穿过核酸吸附性多孔膜，从而使核酸被吸附、洗涤和回收，其中所述核酸吸附性多孔膜是一种能够通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附核酸的多孔膜，并且所述样品溶液是通过以下方法得到的，所述方法包括下列步骤：(I)将试验样品注入到容器中，所述试验样品含有血液和白细胞中的至少一种并且所述试验样品还含有抗凝剂；(II)向所述容器中加入溶血剂以得到白细胞团；(III)向所述白细胞团中加入核酸溶解性试剂以得到混合物溶液；以及(IV)向所述混合物溶液中加入水溶性的有机溶剂以得到含核酸的样品溶液。

Description

分离和纯化RNA的方法

技术领域

本发明涉及一种分离和纯化RNA的方法。

背景技术

多种形式的核酸被用于不同的领域中。例如，在重组核酸技术领域中，核酸以探针、基因组核酸和质粒核酸的形式使用。

在诊断领域中，核酸以不同的形式用于不同的目的。例如，核酸探针常用于检测和诊断人类的病原体。同样，核酸还用于检测遗传病。核酸也用于检测食品污染物。此外，由于从绘制基因图谱到克隆和重组表达的多种原因，核酸常用于对所关注的核酸进行定位、识别和分离。

近年来，人们已经开发出用于检测RNA表达的方法，例如实时PCR技术或者微阵列技术，并且人们还非常重视对RNA的表达方式与疾病、药效等的关系进行研究。

在多数情况下，只能得到极少量的核酸，并且核酸的分离和纯化操作是复杂的而且耗费时间。这种耗时的复杂操作容易导致核酸损失。RNA非常不稳定，因此热、碱性条件以及特别是核糖核酸酶(RNase)都可以容易使RNA发生降解。因此，难以分离和纯化得到高纯度的RNA而又不使RNA发生降解。

在纯化从血清、尿液和细菌培养物得到的样品中的核酸时，存在污染和假阳性结果的其它风险。

公知的分离和纯化方法中的一种方法包括：将核酸吸到诸如二氧化硅、二氧化硅聚合物(silica polymer)或硅酸镁之类的固相上，然后进行洗涤或解吸附的步骤(参见例如专利文献JP-B No.7-51065)。然而，虽然这些方法具有较高的分离性能，但是它们在简便性、快速性、自动化适用性以及减小在这些方法中使用的工具或者装置的尺寸方面还存在问题。其它问题来自工具、装置、以及(特别是)吸附剂方面，这些问题包括：难以以工业化规模来生产性能相同的吸附剂；难以处理；以及难以形成不同的形状。此外，由于材料具有脆性而要求达到一定的厚度或更厚以获得机械强度，特别是在用脱氧核糖核酸酶(DNase)来降解DNA以便从含有DNA和RNA的混合样品中选择性地回收RNA时，为了使DNase在固相上均匀地发生相互作用，就会存在着这样的缺点(例如)：需要使DNase溶液达到一定的量或更高。DNase是相对昂贵的，这样在选择性地回收RNA的情况下，这将成为问题，而据预计，今后回收RNA的需求将会大幅增加。

此外，用于简单有效地分离和纯化核酸的方法之一是：使用一种用于将核酸吸附在固相上的溶液和一种用于使核酸从固相膜上解吸附的溶液，从而就有这样一种用于分离和纯化核酸的方法，该方法包括以下步骤：将核酸吸附到固相上以及使核酸从该固相上解吸附，所述固相在其表面上含有带羟基的有机聚合物(参见专利文献JP-A No.2003-128691)。但是该方法还需要进一步改进。

其它相关的用于分离和纯化核酸的已知方法的例子包括：利用离心作用的方法、使用磁珠的方法和使用滤膜的方法。此外，人们已经提出了使用上述方法的核酸分离纯化装置。例如，有一种使用滤膜的核酸分离纯化装置，其中：把若干带有滤膜的滤管固定在台架上，并把含核酸的样品溶液注入滤管中，在该装置内，将密封剂施加在台架的底部，并用气室密封，以便减小内压。同时，从排出侧抽吸含核酸的样品溶液，使该样品溶液从所有滤管中通过，从而将核酸吸附到滤膜上。然后，注入洗涤液和回收液，并在减压条件下再次抽吸，这样就进行了洗涤和解吸附操作。人们已经提出了一种采取上述工序的自动装置(例如参见日本专利No.2832586)。

发明内容

与此同时，对分离(特别是)白细胞中的RNA的需求也正在增多。血液中含有的红细胞的数目是白细胞数目的大约1000倍。此外，在红细胞中，含有RNA的幼红细胞(即“网织红细胞”)占红细胞的大约1％，因此含有RNA的幼红细胞的数目为白细胞数目的大约10倍。

由于存在大量的网织红细胞，所以，据信，网织红细胞中的RNA最多占全血中RNA量的70％。因此，当收集白细胞中的RNA时，网织红细胞中的RNA便成为噪声，所以重要的是预先除去网织红细胞中的RNA。

已经提出了这样的核酸检测的方法，其中所述核酸是在破坏红细胞后通过裂解白细胞而得到的白细胞溶液中的核酸(参见专利文献JP-W No.8-501208)。在该技术中，使用CTAB或皂苷作为溶血剂(其溶血效果得到验证)，但是由于直接进行的核酸检测反应是在白细胞分解后在没有对核酸实施分离纯化的条件下进行的，所以该方法被认为是具有很大噪声的方法。特别是，近年来，当RNA在检测中具有重要性的情况下，如果诸如DNA或蛋白质之类的残留物没有被几乎完全除去，那么就不能得到精确的结果。该技术尚不能用于分离和纯化出不稳定的高纯度的RNA。

另外，在使用多孔膜来分离纯化RNA的情况下，当将能够在不破坏红细胞的条件下来溶解全血的溶液作为样品溶液时，发生堵塞的可能性增大。

为了避免由红细胞所产生的所述的两个问题，非常重要的是预先破坏红细胞。

因此，本发明的目的是通过在不破坏白细胞的条件下破坏红细胞从而以优良的效率和较高的纯度来分离和纯化白细胞的RNA。

本发明人进行了大量的研究以解决上述问题。结果是，本发明人发现：在核酸分离纯化方法中，包括以下(1)至(3)的步骤是有用的。另外，本发明人发现：在核酸分离纯化方法中，通过使用能够吸附核酸的多孔膜(其通过基本上不涉及离子键的相互作用进行吸附)、以及通过在进行步骤(1)至(3)之前在制备样品溶液的过程中获得白细胞团(leukocyte pallet)，可以从白细胞中分离和纯化出高收率和高纯度的RNA。本发明是基于这些发现而完成的。

[1]一种分离和纯化RNA的方法，该方法包括：

(1)使含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜，从而将所述核酸吸附在所述的多孔膜上；

(2)使洗涤液穿过所述的核酸吸附性多孔膜，从而在使所述核酸保持吸附的同时对所述多孔膜进行洗涤；以及

(3)使回收液穿过所述的核酸吸附性多孔膜，从而使所述核酸从所述的多孔膜上解吸附，

其中所述的核酸吸附性多孔膜是能够通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附核酸的多孔膜，以及

其中所述的含核酸的样品溶液是通过用于制备样品溶液的方法而得到的，所述方法包括：

(I)将试验样品注入容器中，所述试验样品含有：血液和白细胞中的至少一者、以及抗凝剂；

(II)向所述容器中加入溶血剂从而得到白细胞团；

(III)向所述白细胞团中加入核酸溶解性试剂从而得到混合物溶液；

(IV)向所述混合物溶液中加入水溶性有机溶剂从而得到含核酸的样品溶液。

[2]上述[1]中所述的分离和纯化RNA的方法，

其中所述溶血剂包括选自氯化铵、氯化钠、草酸铵和皂苷中的至少一种。

[3]上述[1]或[2]中所述的分离和纯化RNA的方法，

其中在步骤(II)中加入溶血剂之后，在0℃至35℃下进行温育。

[4]上述[1]至[3]中任意一项所述的分离和纯化RNA的方法，

其中所述核酸溶解性试剂包括选自离液盐、核酸稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和消泡剂中的至少一种。

[5]上述[4]中所述的分离和纯化RNA的方法，

其中所述离液盐为胍盐。

[6]上述[4]或[5]中所述的分离和纯化RNA的方法，

其中核酸稳定剂为还原剂。

[7]上述[4]至[6]中任意一项所述的分离和纯化RNA的方法，

其中所述表面活性剂包括非离子型表面活性剂。

[8]上述[1]至[7]中任意一项所述的分离和纯化RNA的方法，

其中所述含核酸的样品溶液、所述洗涤液和所述回收液中的至少一者是在加压条件下穿过所述的核酸吸附性多孔膜的。

[9]一种用于自动实施上述[1]至[8]中任意一项所述的分离和纯化RNA的方法的装置。

[10]一种用于实施上述[1]至[8]中任意一项所述的分离和纯化RNA的方法的成套用具，该成套用具包括：

(i)核酸分离纯化柱，其装有核酸吸附性多孔膜；以及

试剂，其包括：

(ii)溶血剂；

(iii)核酸溶解性试剂；

(iv)洗涤液；以及

(v)回收液。

[11]一种用于自动实施对上述[10]中所述的成套用具的使用的装置。

附图说明

图1是对根据本发明的方法分离和纯化的RNA进行琼脂糖凝胶电泳(TAE为展开缓冲剂)后而得到的照片；以及

图2是对RNA进行琼脂糖凝胶电泳(TAE为展开缓冲剂)后而得到的照片，所述RNA是从白细胞总数为1×10⁷的人类全血中获得的，并且是根据本发明的方法分离和纯化的，

其中，1表示从白细胞总数为5×10⁶的人类全血中获得的RNA；2表示从白细胞总数为1×10⁷的人类全血中获得的RNA；3表示以1kbPLUS Ladder(梯带)(由Invitrogen公司出品)；4和5表示从白细胞总数为1×10⁷的人类全血中获得的RNA。

本发明的最佳实施方式

本发明的用于分离和纯化RNA的方法至少包括下列步骤：

步骤(1)，使含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜，从而将核酸吸附到多孔膜上(下文称为“吸附步骤”)；

步骤(2)，使洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜，从而使得在核酸被吸附于所述多孔膜上的同时对该多孔膜进行洗涤(下文称为“洗涤步骤”)；以及

步骤(3)，使回收液穿过核酸吸附性多孔膜，从而使核酸从多孔膜上解吸附(下文称为“回收步骤”)。

优选的是，在上述步骤(1)、(2)和(3)中的每个步骤中，使含核酸的样品溶液、洗涤液和回收液在加压条件下穿过核酸吸附性多孔膜。更优选的是，在上述步骤(1)、(2)和(3)中的每个步骤中，向核酸分离纯化柱的第一个开口注入含核酸的样品溶液、洗涤液或回收液，并采用与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接的压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使每一种注入的溶液穿过核酸吸附性多孔膜，并由核酸分离纯化柱的另一个开口排出，其中所述核酸分离纯化柱包含具有至少两个开口的容器，并且所述核酸分离纯化柱在所述容器内容纳有核酸吸附性多孔膜。优选的是，使含核酸的样品溶液、洗涤液和回收液在加压条件下穿过上述多孔膜，从而使装置可以是小型自动化的。所施加的压力优选为约10kPa到300kPa、更优选为约40kPa到200kPa。

在上述步骤(1)至(3)中，可以在20分钟内或者(在优选条件下)在2分钟内完成从注入含核酸的样品溶液的第一步到在核酸分离纯化柱外得到RNA的步骤这一过程。此外，上述分离和纯化核酸的步骤可以以占试验样品中所含有的核酸总量的至少50质量％、或者(在优选的条件下)至少90质量％的收率得到核酸。(在本说明书中，质量比等同于重量比。)

此外，根据UV光-可见光分光光度计测定的值(260nm/280nm)，上述分离和纯化RNA的步骤可以回收得到纯度为1.8至2.2的RNA。因此，可以稳定地得到污染小而纯度高的RNA。在优选条件下，根据UV光-可见光分光光度计测定的值(260nm/280nm)，可以回收得到纯度为约2.0的RNA。

上述步骤中使用的压力差产生装置的例子包括：注射器、移液管、诸如蠕动泵之类的加压泵、诸如蒸发器之类的减压发生器。在这些装置中，注射器适合于手动操作，而泵适合于自动操作。

另外，移液管具有这样的优点：它可以用一只手来操作。优选的是，压力差产生装置以可拆装的方式与核酸分离纯化柱的一个开口相连。

通过样品溶液的制备工艺可得到本发明的样品溶液，所述制备工艺至少包括下列步骤：

步骤(I)，将试验样品注入到容器中，所述试验样品含有血液和白细胞中的任意一者，并且该试验样品还含有抗凝剂；

步骤(II)，向所述容器中加入溶血剂从而得到白细胞团；

步骤(III)，向所述白细胞团中加入核酸溶解性试剂从而得到混合物溶液；以及

步骤(IV)，向由步骤(III)得到的混合物溶液中加入水溶性有机溶剂从而得到含核酸的样品溶液。

根据上述这些步骤，红细胞在白细胞没有被破坏的条件下而被破坏，从而得到白细胞团。此外，通过使白细胞的细胞膜和核膜分解，可以得到其核酸分散于水溶液中的含核酸的样品溶液。

为了有效地分解白细胞的细胞膜和核膜，重要的是预先使红细胞破坏并除去。容易地将红细胞除去对于防止堵塞来说是重要的。

分解白细胞的细胞膜和核膜对于溶解待提取的核酸(尤其是RNA)来说是必要的也是重要的。

步骤(I)，将试验样品注入到容器中，所述试验样品含有血液和白细胞中的任意一者，并且该试验样品还含有抗凝剂

在本发明中，试验样品中含有血液和白细胞中的任意一者。血液的例子包括全血。另外，白细胞包括从全血中得到的那些白细胞。

本发明的试验样品中还含有抗凝剂。抗凝剂的例子一般包括EDTA、肝素、柠檬酸钠、氟化钠、ACD(酸性柠檬酸盐葡萄糖溶液)等，它们可以单独使用，或者可将它们中的两种或多种组合使用。抗凝剂的含量可以在其常规用量范围内。本发明不限于所述的这些抗凝剂，而且根据本发明的包括上述步骤(1)至(3)的分离和纯化RNA的方法，可以有效地进行RNA的分离和纯化，而与试验样品中所含的抗凝剂的种类无关。

含核酸的样品溶液中可以含有单一一种核酸，也可以含有两种或更多种不同种类的核酸。试验样品的数量可以是一个或者是多于一个(使用多个容器对多个试验样品进行平行操作)。对待回收的核酸的长度没有限定，但是，例如，可以使用几bp至几Mbp的任意长度的核酸。然而，从容易处理的角度考虑，核酸的长度一般来说在大约几bp至大约几百kbp的范围内。与常规的简单方法相比，本发明的核酸分离纯化方法可以快速地回收较长的核酸。通过本发明回收的核酸的长度优选为至少50kbp、更优选为至少70kbp、进一步优选为至少100kbp。

作为用于注入试验样品的容器，虽然没有限定，但是优选的是塑料管、玻璃小瓶、试管等。更优选的是不含核酸酶并且不具有热原的那些容器。

作为将试验样品注入到容器中时所采用的注入方法，虽然没有限定，但优选的是使用诸如移液管或滴管之类的实验室仪器。更优选的是不含核酸酶并且不具有热原的那些仪器。

对于向容器中进行的注入操作没有特别限定，而是可以使用任何方法或仪器。

步骤(II)，向所述容器中加入溶血剂从而得到白细胞团

在本发明中，加入溶血剂从而得到白细胞团。根据该步骤，可以在不破坏白细胞的条件下使红细胞破坏，并且可以主要得到白细胞团。

溶血剂的例子包括氯化铵、氯化钠、草酸铵和皂苷。通过使用含有选自上述物质中的至少一种的溶血剂，就可以在不破坏白细胞的条件下使红细胞破坏，而这是优选的。特别是，使用含有氯化铵的溶血剂是优选的。溶血剂的最佳浓度根据溶血剂种类的不同而不同，但是优选为0.1％至20％。在使用氯化铵的情况下，优选为0.8％至1.0％。

在全血的情况下，溶血剂的液体量优选为全血∶溶血剂＝1∶2至1∶20、更优选为1∶4至1∶10。

另外，优选的是在加入溶血剂后在0℃至35℃下温育。所述温育优选进行1分钟至30分钟、更优选进行5分钟至20分钟。

当将溶血剂加入到全血中时，在完成破坏红细胞之后，混浊的溶液会变得透明。当发生这种状况后，以300×g至3000×g的转速离心该溶液，从而可以得到白细胞团。

步骤(III)，向所述白细胞团中加入核酸溶解性试剂从而得到混合物溶液

在本发明中，使用核酸溶解性试剂来分解白细胞的细胞膜和核膜，并使用核酸溶解性试剂来溶解核酸。作为核酸溶解性试剂，优选使用含有选自离液盐、核酸稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和消泡剂中的至少一种的试剂。核酸溶解性试剂可以是溶液或者是干燥的物质，但优选使用核酸溶解性试剂的溶液。另外，核酸溶解性试剂可以含有除了离液盐、核酸稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和消泡剂之外的其它成分。

可以使用已知的离液盐作为所述的离液盐而没有特别限定。所述离液盐的例子包括胍盐、异硫氰酸钠、碘化钠和碘化钾。在这些物质中，从抑制RNase的角度考虑，优选为胍盐。胍盐的例子包括盐酸胍、异硫氰酸胍和胍的硫氰酸盐(硫氰酸胍)，并且其中盐酸胍或者胍的硫氰酸盐是优选的。这些盐可以单独使用，或者可将这些盐中的两种或更多种组合使用。

核酸溶解性试剂中的离液盐的浓度优选为0.5摩尔/L或更高，更优选为0.5摩尔/L到8摩尔/L，甚至更优选为1摩尔/L到6摩尔/L。

可以使用诸如尿素之类的离液物质来代替离液盐。

核酸溶解性试剂中优选含核酸稳定剂。可以使用核酸稳定剂来稳定试验样品中的核酸，这是优选的。更优选的是，核酸稳定剂与选自离液盐、表面活性剂、缓冲剂和消泡剂中的任何一者或多者共存。就这一点而言，可以提高最终所得的RNA收率和回收效率，从而可以使试验样品用量最少化并使操作加速，因此是优选的。

作为核酸稳定剂，可以提到的是其可以发生反应从而使核酸酶的活性失活的一类。根据试验样品的不同，存在其中含核酸酶的情况，核酸酶使核酸降解，结果当核酸被均化时，核酸酶与核酸发生反应，从而导致回收量显著降低。

可使用通常被用作还原剂的化合物作为具有使核酸酶活性失活的功能的核酸稳定剂。还原剂的例子包括：氢化化合物，例如，氢原子、碘化氢、硫化氢、氢化铝锂和硼氢化钠；高正电性金属，例如，碱金属、镁、钙、铝和锌，或它们的汞合金；有机氧化物，例如，醛类、糖类、甲酸和草酸；以及巯基化合物。在这些物质当中，巯基化合物是优选的。巯基化合物的例子包括N-乙酰半胱氨酸、巯基乙醇、烷基硫醇等。巯基化合物可以单独使用，或者可将巯基化合物中的两种或更多种组合使用。

在核酸溶解性试剂中，核酸稳定剂的浓度优选为0.1重量％到20重量％、更优选为0.3重量％到15重量％。在核酸溶解性试剂中，巯基化合物的浓度优选为0.1重量％到20重量％、更优选为0.5重量％到15重量％。

表面活性剂(例如)包括非离子型表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂。

本发明中，可优选使用非离子型表面活性剂和阳离子表面活性剂。特别优选使用非离子型表面活性剂，这是因为它可以更令人满意地改变环境的极性。

非离子型表面活性剂的例子包括聚氧化亚乙基烷基苯基醚类表面活性剂、聚氧化亚乙基烃基醚类表面活性剂和脂肪酸烷醇酰胺，并且优选为聚氧化亚乙基烃基醚类表面活性剂。聚氧化亚乙基(POE)烃基醚类表面活性剂的例子包括POE癸基醚、POE月桂基醚、POE十三烷基醚、POE亚烷基癸基醚、POE脱水山梨糖醇单月桂酸酯、POE脱水山梨糖醇单油酸酯、POE脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、四油酸聚氧化亚乙基山梨糖醇、POE烷基胺和POE炔二醇(POE acetyleneglycol)。

阳离子表面活性剂的例子包括溴化十六烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵和氯化十六烷基吡啶_。

这些表面活性剂可以单独使用或者可将它们中的两种或更多种组合使用。在核酸溶解性试剂中，表面活性剂的浓度优选为0.1重量％到20重量％。

使用pH优选为3到8、pH更优选为4到7、pH进一步优选为5到7的核酸溶解性试剂。

作为缓冲剂，可以提及常规pH缓冲剂(缓冲剂)，并且优选的是，可以提及生化pH缓冲剂。这种缓冲剂的例子包括含有以下物质的缓冲剂：柠檬酸盐、磷酸盐或乙酸盐、Tris-HCl、TE(Tris-HCl/EDTA)、TBE(三羟甲基氨基甲烷硼酸盐(Tris-Borate)/EDTA)、TAE(三羟甲基氨基甲烷乙酸盐(Tris-Acetate)/EDTA)；以及GUD缓冲剂。GUD缓冲剂的例子包括：MES(2-吗啉代乙磺酸)、Bis-Tris(双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷)、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、PIPES(哌嗪基-1，4-双(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)。

在核酸溶解性试剂中，上述这些缓冲剂的浓度优选为1毫摩尔/L至500毫摩尔/L。

消泡剂的例子包括：硅类消泡剂(例如，硅油、二甲基聚硅氧烷、有机硅乳液、改性聚硅氧烷和有机硅复合物等)、醇类消泡剂(例如，炔二醇、庚醇、乙基己醇、高碳醇和聚氧化亚烷基二醇等)、醚类消泡剂(例如，庚基溶纤剂和壬基溶纤剂-3-庚基山梨糖醇等)、脂肪油类消泡剂(例如，动物油脂和植物油脂等)、脂肪酸类消泡剂(例如，硬脂酸、油酸和棕榈酸等)、金属皂类消泡剂(例如，硬脂酸铝和硬脂酸钙等)、脂肪酸酯类消泡剂(例如，天然蜡和磷酸三丁酯等)、磷酸盐酯类消泡剂(例如，磷酸辛酯钠等)、胺类消泡剂(例如，二戊基胺等)、酰胺类消泡剂(例如，硬脂酸酰胺等)和其它消泡剂(例如，硫酸铁和矾土等)、等等。这些消泡剂可以单独使用，或者可将它们中的两种或更多种组合使用。特别优选的是，将硅类消泡剂和醇类消泡剂这两种化合物组合在一起使用。

在核酸溶解性试剂中，消泡剂的浓度优选为0.1重量％到10重量％。

此外，核酸溶解性试剂可含有水溶性有机溶剂。水溶性有机溶剂的例子包括丙酮、醇类、二甲基甲酰胺等。使用水溶性有机溶剂的目的是提高核酸溶解性试剂中所含的各种试剂的溶解度，这是优选的。在所述试剂中，醇类是优选的。关于醇，可以使用伯醇、仲醇和叔醇中的任意一种。更优选的是，可以使用甲醇、乙醇、丙醇及其异构体、以及丁醇及其异构体。这些水溶性有机溶剂可以单独使用，或者可将它们中的两种或更多种组合使用。在核酸溶解性试剂中，这些水溶性有机溶剂的浓度优选为1重量％到20重量％。

需要的是，对10个至1×10⁹个白细胞用50μl至1000μl的核酸溶解性试剂来处理。核酸溶解性试剂的液体量可以在使白细胞分解且不超过柱体积的范围内变化。

对混合白细胞和核酸溶解性试剂的方法没有特别限定。例如，在混合时，使用搅拌装置在30rpm到3000rpm的条件下搅拌1秒到3分钟是优选的。通过这样混合，可以有利地增加经分离和纯化的RNA的最终收率。另一方面，翻转混合(rollover-mixing)5次到30次也是优选的。此外，移液操作10次到50次也可以混匀，在这种情况下，通过简单的操作就可以提高经分离和纯化的RNA的最终收率，因此是优选的。

优选的是，对通过将核酸溶解性试剂加入到白细胞中而得到的混合物溶液进行均化处理。通过实施均化处理，提高了针对自动化处理的最佳程度，这是优选的。作为均化处理，可以进行(例如)超声波处理、使用尖锐的突出物进行处理、采过高速搅拌进行处理、穿过细小空间的挤出处理以及使用珠子(例如，玻璃珠、不锈钢珠和二氧化锆珠子等)进行处理。虽然对于实施这些处理没有特别限定，但是可以使用(例如)以下器材中的任意一种，所述器材有：诸如涡流混合器之类的混合器、转子-定子型匀浆器、Potter型匀浆器、Dounce型匀浆器等、或者诸如玻珠研磨机、研杵、弗氏压碎器、研磨机和桨式匀浆器之类的市售可得的匀浆器。当在加入核酸溶解性试剂之前进行均化处理时，可以用液氮冷冻试验样品，然后用玻珠研磨机或者压碎机、研钵、研磨机等进行处理。

步骤(IV)，向由步骤(III)得到的混合物溶液中加入水溶性有机溶剂从而得到含核酸的样品溶液

作为水溶性有机溶剂，优选使用醇类化合物，但不限于此。关于醇类化合物，可使用伯醇、仲醇和叔醇中的任意一种，并且可优选使用甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体。这些水溶性有机溶剂可以单独使用，或者可将它们中的两种或更多种组合使用。在含核酸的样品溶液(下文称为核酸混合物溶液)中，这些水溶性有机溶剂的最终浓度优选为5质量％至90质量％、更优选为15质量％至75质量％、进一步优选为15质量％至50质量％。通过使用最佳浓度的EtOH，在即使不用使用DNase的条件下也可以减少基因组DNA对所回收的样品的污染，从而以优良的效率和较高的纯度对RNA进行分离和纯化。当在加入水溶性有机溶剂之后进行混合时，优选的是使用搅拌装置在30rpm至3000rpm的速度下搅拌1秒钟至3分钟。通过这样混合，可提高经分离和纯化的RNA的最终收率。此外，将试管颠倒5次到30次进行混合也是优选的。此外，移液操作10次到50次也可混匀混合物。

此外，优选的是，所得到的核酸混合物溶液的表面张力为0.05J/m²或更低，粘度为1mPa到10000mPa，以及其比重为0.8到1.2。通过使用满足此范围要求的溶液，在使核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜后，可以容易地实施除去核酸混合物溶液废液的操作。

步骤(1)，使含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜，从而将核酸吸附到多孔膜上(吸附步骤)

下面将对(1)本发明使用的核酸吸附性多孔膜以及将核酸吸附到该核酸吸附性多孔膜上的步骤进行描述。

使用本发明的核酸吸附性多孔膜，其中溶液可从该多孔膜的内部通过。在本文中，“溶液可从其内部通过”是指：当在与多孔膜的一面接触的空间和与该多孔膜的另一面接触的空间之间存在压力差时，溶液可从高压空间向低压空间流动而穿过所述多孔膜。另一方面是指：当向所述多孔膜受到离心力时，溶液可以沿着离心力的方向穿过该多孔膜。

本发明的核酸吸附性多孔膜是通过该膜与核酸之间的相互作用来吸附核酸，其中，基本没有离子键的参与。这意味着在使用多孔膜的情况下，没有发生“离子化”，因此推测，核酸和多孔膜是通过改变周围的极性来互相吸引的。因此，核酸吸附性多孔膜优选具有优异的分离能力和良好的洗涤效率，并且优选能够分离和纯化核酸。更优选的是，核酸吸附性多孔膜是具有亲水性基团的多孔膜，并且推测，核酸的亲水性基团和多孔膜的亲水性基团通过改变周围的极性而互相吸引。

本文中，亲水性基团是指能在其与水之间发生相互作用的极性基团(原子团)，并且与吸附核酸有关的所有基团(原子团)都是合适的。关于亲水性基团，其与水之间相互作用的强度约为中等强度(参见由共立出版株式会社出版的《化学大词典》中所述的术语“亲水性基团”中的“亲水性不太强的基团”)是合适的，其例子包括羟基、羧基、氰基和氧化亚乙基。优选羟基。

本文中，具有亲水性基团的多孔膜是指构成多孔膜的材料本身具有亲水性基团，或者是对构成多孔膜的材料进行处理或涂敷，从而引入亲水性基团。任意一种有机或无机材料都适合于作为构成多孔膜的材料。例如，可使用这样的多孔膜：由本身具有亲水性基团的有机材料构成的多孔膜；其中亲水性基团通过对构成多孔膜的、且不具有亲水性基团的有机材料进行处理而被引入的多孔膜；其中亲水性基团通过对构成多孔膜的、且不含亲水性基团的有机材料进行涂敷而被引入的多孔膜；由本身具有亲水性基团的无机材料构成的多孔膜；其中亲水性基团通过对构成多孔膜的、且不含亲水性基团的无机材料进行处理而被引入的多孔膜；其中亲水性基团通过对构成多孔膜的、且不含亲水性基团的无机材料进行涂敷而被向引入的多孔膜。然而，为了简化步骤，优选使用有机材料(例如有机聚合物)作为构成多孔膜的材料。

具有亲水性基团的多孔膜材料的例子包括：聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氧乙烯、醋酸纤维素和乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物，所述例子适合于构成多孔膜，但具体而言，可以优选使用由具有羟基的有机材料构成的多孔膜，特别是由具有羟基的有机聚合物构成的多孔膜。

关于由具有羟基的有机材料构成的多孔膜，具有多糖结构的材料是优选的，并且更优选使用由乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物构成的有机聚合物多孔膜。可优选使用的乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合物的例子包括：三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物；以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。特别优选是，可以使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合比(质量比)优选为99∶1到1∶99、更优选为90∶10到50∶50。

更优选的是，具有羟基的有机材料是在专利文献JP-A No.2003-128691中描述的醋酸纤维素的皂化物。在本文中所使用的醋酸纤维素的皂化物是指乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物经过了皂化处理，并且其例子包括：三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化物，三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化物，三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化物，以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化物。更优选的是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化物。三醋酸纤维素与二醋酸纤维素的混合比(质量比)优选为99∶1到1∶99、更优选为90∶10到50∶50。在这种情况下，这样就可以根据表面皂化处理的程度(表面皂化率)来控制多孔膜表面上的羟基含量(密度)。

为了提高核酸分离的效力，优选的是，使多孔膜的表面上具有含量(密度)更高的羟基。经皂化反应得到的有机材料的皂化率(表面皂化率)优选为至少5％到至多100％、更优选为至少10％到至多100％。

此外，为了增大其表面上具有羟基的有机聚合物的表面积，优选的是，对醋酸纤维素进行表面皂化处理。

其正面区域和背面区域彼此对称的多孔膜是合适的，但是可优选使用其正面区域和背面区域不对称的多孔膜。

本文中，皂化处理是指醋酸纤维素与皂化处理液(例如，氢氧化钠溶液)接触。结果，与皂化处理液接触的醋酸纤维素酯衍生物的酯基被水解，并且引入羟基，从而形成再生纤维素。因此，所制备的再生纤维素与起始纤维素二者在晶型方面是不同的。为了改变表面皂化率，通过改变氢氧化钠的浓度或氢氧化钠的处理时间来实施皂化处理。通过NMR(例如，检测羰基峰值的减少程度)可容易地确定表面皂化率。

向不含羟基的有机材料的多孔膜引入羟基的方法是把在聚合物主链或侧链上具有羟基的接枝聚合物链键合到多孔膜上。用于将接枝聚合物链键合到多孔膜有机材料中的方法包括以下两种：例如，使接枝聚合物链与多孔膜化学键合的方法；以及使用多孔膜作为起始物，使具有双键(能发生聚合反应)的化合物聚合，从而形成接枝聚合物链的方法。

首先，在使多孔膜与接枝聚合物链化学键合的方法中，使用在聚合物的末端或侧链上具有能够与多孔膜发生反应的官能团的聚合物，所述聚合物通过其官能团与多孔膜的官能团之间的化学反应而与多孔膜接枝。对能与多孔膜发生反应的官能团没有特别限定，只要它能与多孔膜的官能团反应即可。其例子包括：硅烷偶联基(例如烷氧基硅烷)、异氰酸基、氨基、羟基、羧基、磺酸基、磷酸基、环氧基、烯丙基、甲基丙烯酰基和丙烯酰基等。作为在聚合物末端或侧链上具有反应性官能团的聚合物，特别有用的化合物的例子包括：在其末端具有三烷氧基甲硅烷基的聚合物、在其末端具有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具有环氧基的聚合物以及在其末端具有异氰酸基的聚合物。对在此使用的聚合物没有特别限定，只要其具有参与吸附核酸的亲水性基团即可，其具体例子包括：聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基丙烯酸羟乙酯和它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其盐、聚氧乙烯以及类似物。

通过使用多孔膜作为起始点、使具有可聚合的双键的化合物进行聚合而形成接枝聚合物链的方法通常被称为表面接枝聚合法。表面接枝聚合法是指这样的方法：其中通过等离子体辐射、光辐射、加热或类似的方法，在多孔膜表面上形成活性部位，从而将与多孔膜接触排列的、具有双键的可聚合化合物通过聚合反应而连接到该多孔膜上。用于形成与多孔膜相连的接枝聚合物链的化合物必须同时具有可聚合的双键和参与吸附核酸的亲水性基团这两个特征。可以使用具有亲水性基团的聚合物、具有亲水性基团的低聚物和具有亲水性基团的单体中的任何一种作为这种化合物，只要其分子中具有双键即可。特别有用的化合物是具有亲水性基团的单体。具有亲水性基团的、特别有用的单体的具体例子包括以下单体。例如，特别适合使用的是诸如丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、单甲基丙烯酸甘油酯之类的具有羟基的单体。此外，还适合使用的是诸如丙烯酸、甲基丙烯酸之类的具有羧基的单体，或其碱金属盐和胺盐。

可以涂敷具有亲水性基团的材料来作为另一种把亲水性基团引入到由不具有亲水性基团的有机材料构成的多孔膜中的方法。对用于涂敷的材料没有特别限定，只要其具有参与核酸吸附的亲水性基团即可，但是从易于操作的角度考虑，所述材料优选为有机材料的聚合物。聚合物的例子包括聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基丙烯酸羟乙酯以及它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸以及它们的盐、聚氧乙烯、醋酸纤维素以及乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物，但优选为具有多糖结构的聚合物。

此外，可以将醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物涂敷到不具有亲水性基团的有机材料多孔膜上，然后对所涂敷的醋酸纤维素或乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理。在这种情况下，皂化率优选为约至少5％到至多100％，皂化率更优选为约至少10％到至多100％。

作为具有亲水性基团的无机材料的多孔膜，可以提及含有二氧化硅化合物的多孔膜。作为含有二氧化硅化合物的多孔膜，可以提及玻璃滤膜。此外，可以提及日本专利No.30583442中所述的二氧化硅多孔薄膜。这种二氧化硅多孔薄膜可按以下方法制备：把能够形成双分子膜的阳离子两性物质的展开液铺展到基材上，通过除去液体膜中的溶剂而在基材上制成由两性物质构成的多层双分子层薄膜，使多层双分子层薄膜与含有二氧化硅化合物的溶液接触，然后取出并移走所述的多层双分子层薄膜。

作为向不具有亲水性基团的无机材料多孔膜中引入亲水性基团的方法，有两种方法：一种方法是把多孔膜和接枝聚合物链化学键合；另一种方法是使用分子内具有双键的、含有亲水性基团的单体，并使用多孔膜作为起始点进行聚合而形成接枝聚合物链。

当多孔膜与具有亲水性基团的接枝聚合物链化学键合时，能够与接枝聚合物链的末端官能团发生反应的官能团被引入到无机材料中，并且使接枝聚合物链被化学键合到该官能团上。此外，当接枝聚合物链是使用分子内具有双键的、具有亲水性基团的单体并使用多孔膜作为起始点而聚合形成的时候，将在具有双键的化合物进行聚合时作为起始点的官能团引入到无机材料中。

作为具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有双键并含有亲水性基团的单体，可以适当地使用在上述关于向不具有亲水性基团的有机材料多孔膜中引入亲水性基团的方法中所述的具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有双键并含有亲水性基团的单体。

向不具有亲水性基团的无机材料多孔膜中引入亲水性基团的另一种方法是在其上涂敷具有亲水性基团的材料。对于涂敷所用的材料没有限定，只要其具有参与吸附核酸的亲水性基团即可，但为了易于操作，优选为有机材料的聚合物。该聚合物的例子包括：聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基丙烯酸羟乙酯以及它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其盐、聚氧乙烯、醋酸纤维素以及乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物等。

对于不具有亲水性基团的无机材料多孔膜，将醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合物涂敷于其上，然后可以将经涂敷的醋酸纤维素和乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合物皂化。在这种情况下，皂化率优选为至少5％到至多100％、更优选为至少10％到至多100％。

不具有亲水性基团的无机材料多孔膜的例子包括由金属(例如铝)以及陶瓷(例如玻璃、水泥和陶)制成的多孔膜，或者由新型陶瓷、硅和活性炭等经过加工而制成的多孔膜。

所述的核酸吸附性多孔膜能够使溶液从其内部穿过，并且其厚度优选为10μm至500μm。更优选的厚度为50μm至250μm。从易于洗涤的角度考虑，更优选的是厚度较薄。

溶液可从其内部穿过的核酸吸附性多孔膜的最小孔径优选为大于或等于0.22μm。更优选的是，最小孔径为大于或等于0.5μm。此外，使用最大孔径与最小孔径之比为2或更大的多孔膜是优选的。结果，可得到用于吸附核酸的足够的表面积，并且孔不容易被堵。最大孔径与最小孔径的更优选的比值为5或更大。

溶液可从其内部穿过的核酸吸附性多孔膜的孔隙率优选为50％至95％、更优选为65％至80％。此外，其泡点优选为0.1kgf/cm²到10kgf/cm²、更优选为0.2kgf/cm²到4kgf/cm²。

溶液可从其内部穿过的核酸吸附性多孔膜的压力损失优选为0.1kPa至100kPa。结果，核酸吸附性多孔膜在加压状态下，可获得均匀的压力。压力损失更优选为0.5kPa到50kPa。在本文中，术语“压力损失”是指水每通过100μm厚的膜所需的最小压力。

溶液可从其内部通过的核酸吸附性多孔膜的水的渗滤量(水在25℃、1kg/cm²的压力下通过时的渗滤量)优选为每1分钟每平方厘米膜1mL到5000mL。水的渗滤量(水在25℃、1kg/cm²的压力下通过时的渗滤量)更优选为每1分钟每平方厘米膜5mL到1000mL。

溶液可从其内部通过的核酸吸附性多孔膜的核酸吸附量优选为每1mg的多孔膜0.1μg或更多。核酸吸附量更优选为每1mg的多孔膜0.9μg或更多。

溶液可从其内部通过的核酸吸附性多孔膜具有这样的纤维素衍生物：在将边长为5mm的正方形多孔膜浸渍在5mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内(不含1小时)不溶解，但是在48小时以内(不含48小时)溶解。此外，具有下述特征的纤维素衍生物是优选的，所述特征为：在将边长为5mm的正方形多孔膜浸渍在5mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内(不含1小时)溶解，但是在将所述膜浸渍在5mL二氯甲烷中时，该纤维素衍生物在24小时以内(不含24小时)不溶解。在这些纤维素衍生物中，更优选的是这样的纤维素衍生物：在将边长为5mm的正方形多孔膜浸渍在5mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内(不含1小时)溶解，但是在将所述膜浸渍在5mL二氯甲烷中时，该纤维素衍生物在24小时以内(不含24小时)不溶解。

在核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，优选的是，使核酸混合物溶液从多孔膜的一侧流到另一侧，从而使溶液与多孔膜均匀接触。在核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，优选的是，使核酸混合物溶液以从较大孔径向较小孔径的方式穿过核酸吸附性多孔膜，从而使孔不容易被堵塞。

当核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，流速优选为：每单位膜面积(cm²)2μL/秒到1500μL/秒，从而使溶液与多孔膜达到合适的接触时间。当溶液与多孔膜的接触时间太短时，则不能得到充分的分离和纯化的效果；当接触时间太长时，则从可操作性来说不是优选的。流速优选为：每单位膜面积(cm²)5μL/秒到700μL/秒。

此外，溶液可从其内部穿过的核酸吸附性多孔膜可以以一层的方式使用，但也可以以多层的方式使用。核酸吸附性多孔膜的多层可以彼此相同或不同。

多层核酸吸附性多孔膜可以包含无机材料核酸吸附性多孔膜和有机材料核酸吸附性多孔膜的组合。例如，其可以是玻璃滤膜和再生纤维素多孔膜的组合。此外，多层核酸吸附性多孔膜可以包含无机材料核酸吸附性多孔膜和有机材料核酸吸附性多孔膜的组合。例如，可以提及玻璃滤膜和尼龙(或聚砜)的组合。

可优选使用这样的核酸分离纯化柱：该核酸分离纯化柱包含具有至少两个开口的容器，并且核酸分离纯化柱在该容器内容纳有核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可穿过该多孔膜。此外，可优选使用这样的核酸分离纯化柱：该核酸分离纯化柱包含具有至少两个开口的容器，并且核酸分离纯化柱在该容器内容纳有多层核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可穿过该多孔膜。在这种情况下，容纳在具有至少两个开口的容器中的多层核酸吸附性多孔膜可彼此相同或不同。

除了包含具有至少两个开口的容器(其中，核酸分离纯化柱在所述容器内容纳有核酸吸附性多孔膜，如上所述，溶液可以穿过该膜)以外，核酸分离纯化柱应该不包含其它组件。可用于容器的材料的例子包括：塑料，例如，聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚氯乙烯。此外，可优选使用可生物降解的材料。此外，容器可以是透明的或有颜色的。

可使用这样的核酸分离纯化柱，该柱具有用于区分各个核酸分离纯化柱的装置。用于区分各个核酸分离纯化柱的装置可包括条形码、二维条形码、磁带、IC卡等。

此外，可使用具有这种结构的核酸分离纯化柱，所述结构使得可以很容易地从所述具有至少两个开口的容器中取出核酸吸附性多孔膜。

步骤(2)，使洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜，从而在核酸被吸附于所述多孔膜上的同时对该多孔膜进行洗涤(洗涤步骤)

下面将对(2)使洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜从而在RNA被吸附于所述多孔膜上的同时对该多孔膜进行洗涤的步骤进行描述。

通过洗涤步骤，提高了最终获得的RNA的收率和纯度，并且可以使含有所需RNA的试验样品的用量达到最少。此外，通过自动进行洗涤操作和回收操作，可以简单快速地实施所述操作。为了加快速度，可以通过洗涤一次来完成洗涤步骤，如果纯度更为重要，则优选进行多次洗涤。

在洗涤步骤中，使用试管、移液管、自动注入装置或具有类似功能的供料装置，将洗涤液提供给容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱。将洗涤液从核酸分离纯化柱的第一个开口(含核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)供入。使用与所述第一个开口连接的压力差产生装置(例如，滴液管、注射器、泵和电动移液管等)，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜，并从不同于所述第一个开口的另一个开口排出洗涤液。此外，洗涤液可由第一个开口供入并由该第一开口排出。此外，洗涤液可由不同于所述第一个开口(含核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)的另一个开口供入，并由该同一开口排出。在这些方式中，更优选的方式如下：由核酸分离纯化柱的第一个开口供入、穿过核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一个开口的另一个开口排出，这是因为该方式具有优异的洗涤效率。

在洗涤操作中，洗涤液的量优选为2μL/mm²或更多。当使用大量的洗涤液时，可改善洗涤效果，但为了保持可操作性并防止样品被排出，其用量优选为200μL/mm²或更少。

在洗涤步骤中，在使洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜时，流速优选为：每单位膜面积(cm²)2μL/秒到1500μL/秒，更优选为：每单位膜面积(cm²)5μL/秒到700μL/秒。通常，降低通过速度以延长时间，从而使洗涤进行得更充分。但是，优选的是，通过采用本发明所用的上述范围，可以在不降低洗涤效率的条件下快速地实施分离和纯化RNA的步骤。

在洗涤步骤中，洗涤液的温度优选为4℃到70℃。此外，更优选的是，洗涤液温度为室温。除了实施洗涤步骤之外，同时还可以采用超声波或机械振动对核酸分离纯化柱进行搅动。另一方面，可通过实施离心操作来进行洗涤。

在洗涤步骤中，洗涤液优选为这样的溶液：其含有水溶性有机溶液和水溶性盐中的至少一种。洗涤液必须具有的能力是能够洗出核酸混合物溶液中的杂质，该杂质是与核酸一起被吸附到核酸吸附性多孔膜上的。就这一方面而言，洗涤液必须具有这样的成分：该成分仅使杂质从核酸吸附性多孔膜上解吸附，但不会使核酸解吸附。为达到所述目的，由于核酸极难溶于水溶性有机溶剂(例如醇类)，因此水溶性有机溶剂适于在使核酸保持吸附的同时使其它物质解吸附。此外，加入水溶性盐可以增强核酸的吸附效果，因此可以改进选择性除去杂质和不需要物质的操作。

可以使用醇类作为洗涤液中所含的水溶性有机溶剂。醇类的例子包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和丁醇。对于丙醇而言，异丙醇和正丙醇中的任何一种都是合适的；对于丁醇而言，直链或支链中的任何一种都是合适的。可以使用多种所述的醇。在这些醇中，优选使用乙醇。

在洗涤液中，水溶性有机溶剂的量优选为1重量％到100重量％，、更优选为5重量％到40重量％。在此范围内，DNA污染物不会增多，并且目的RNA不会从多孔膜上解吸附，因此，可以得到高纯度和高收率的RNA，这是优选的。

同样，洗涤液中所含有的水溶性盐优选为卤化物的盐，并且在卤化物中，氯化物是优选的。此外，具有单价或二价阳离子的水溶性盐是优选的。特别优选的是碱金属盐和碱土金属盐。在这些金属盐中，钠盐、钾盐和锂盐是优选的，并且钠盐是最优选的。

当在洗涤液中含有水溶性盐时，水溶性盐的浓度优选为大于或等于10毫摩尔/L。只要水溶性盐的浓度的最大量在不会对杂质的溶解度造成影响的范围内即可，但是其浓度优选为小于或等于1摩尔/L、更优选为小于或等于0.1摩尔/L。特别是，当水溶性盐为氯化钠时，氯化钠的浓度为大于或等于20毫摩尔/L是特别优选的。

通过将水溶性盐调节至所述的浓度范围内，就可以有效地洗涤基因组DNA，减少基因组DNA对所回收的样品的污染，并且在使RNA保持吸附在膜上的同时，在即使不使用DNase的条件下也可以以良好的效率和较高纯度来分离和纯化RNA。

优选的是，洗涤液中不含有离液物质。结果，可以降低离液物质混入回收步骤(3)中的可能性。在离液物质混入回收步骤(3)中的情况下，该物质通常会抑制RT-PCR反应等的酶反应，因此，考虑到之后进行的酶反应，理想的情况是洗涤液中不含离液物质。此外，离液物质具有腐蚀性和有害性，鉴于这些性质，为了安全起见，不要求实验人员使用离液物质是特别有利的。

在本文中，离液物质是指上文所述的尿素、氯化胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸钠、碘化钠、碘化钾等。

一般来说，洗涤液对柱或者类似的容器具有较高的润湿性，因此在核酸分离纯化过程中的洗涤步骤期间，洗涤液有时保留在容器中，结果洗涤步骤之后的回收步骤受到洗涤液污染，从而导致核酸纯度降低并使随后步骤中的反应性降低。因此，当使用柱或类似的容器进行核酸的吸附和解吸附时，重要的是，在吸附或洗涤中使用的溶液(即，洗涤液)不能保留在柱内，这样它就不会对以下的步骤产生影响。

因此，为了防止洗涤步骤中使用的洗涤液对回收步骤中使用的回收液造成污染，并由此保持柱内的洗涤液残留量为最小，优选的是洗涤液的表面张力小于0.035 J/m²。当表面张力较低时，可改善洗涤液对柱的润湿性能并且可控制残留溶液的体积。

然而，为了提高洗涤效率，可增加水的比例，但在这种情况下，洗涤液的表面张力增大并且残留溶液的量增多。当洗涤液的表面张力为0.035J/m²或更大时，可通过增强柱的斥水性从而控制残留溶液的量。通过增强柱的斥水性，而形成液滴，并且可通过液滴的向下流动来控制残留溶液的量。用于增强斥水性的方法的例子包括：在柱表面上涂敷防水剂(例如硅)；在柱成形时，混入防水剂(例如硅)；以及类似的方法，但不限于此。

通过使用本发明的核酸吸附性多孔膜可以使洗涤步骤简单化。(a)可使洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜的次数减少到一次。(b)可在室温下实施洗涤步骤。(c)在洗涤后，也可以立即进行随后的步骤。(d)也可将上述(a)、(b)和(c)中的一者或两者或多者组合起来。在相关方法中，为了快速地除去洗涤液中所含的有机溶剂，经常需要干燥步骤，但是由于本发明中所使用的核酸吸附性多孔膜是薄膜，因此可以省略干燥步骤。

在相关的RNA分离纯化方法中，存在以下的问题：在实施洗涤步骤时，洗涤液经常溅散并附着在其它部位上，从而造成样品玷污(污染)。通过设计核酸分离纯化柱和废液容器的形状，可以抑制洗涤步骤中的这类污染，其中，在所述柱内，核酸吸附性多孔膜被容纳在具有两个开口的容器中。

在洗涤步骤中可以使用DNase。作为在使用DNase时从含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中选择性地分离和纯化RNA的方法，可以通过以下过程实施该方法：使混合物溶液穿过容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱，其中核酸被吸附在所述的多孔膜上(吸附步骤)，然后进行洗涤(洗涤步骤1)，并经DNase处理。此外，在经过DNase处理之后可以进行洗涤以除去诸如DNase或者其它蛋白质的盐之类的残留物(洗涤步骤2)。

对DNase没有特别限定，并可以使用任何DNase。例如，可以使用来自于动物(例如牛)的胰DNaseI、以及通过基因技术制备的重组DNase。

在进行DNase处理的情况下，对于DNase溶液(以下也称为DNase反应溶液)，可加入适合于使DNase活化的二价阳离子，例如镁离子、钙离子、锰离子。

此外，DNase反应溶液中可以含有缓冲剂，以满足针对DNase活性所需的最佳pH。通常所用的缓冲剂的实例包括Tris-HCl、HEPES、磷酸盐缓冲剂等。

在本发明的方法中，当设计对核酸分离纯化柱中的核酸吸附性多孔膜进行DNase处理的步骤时，DNase溶液的总量优选为每1cm²的核酸吸附性多孔膜上5μl至550μl、更优选为10μl至350μl。此外，在对核酸分离纯化柱内所容纳的核酸吸附性多孔膜进行DNase处理的步骤中，DNase溶液中DNase的浓度(下文简称为DNase浓度)优选为至少10Kunitz U/mL到至多10000Kunitz U/mL、更优选为至少50Kunitz U/mL到至多5000 Kunitz U/mL。此外，此处使用的表示活性的计量单位Kunitz U被定义为：“1Kunitz U是指在25℃、pH5.0并使用DNA作为底物的条件下，使1mL反应溶液每一分钟的吸光度A₂₆₀增加0.001的DNase活性”。此外，在对核酸分离纯化柱中的核酸吸附性多孔膜进行DNase处理的步骤中，处理时间优选为5秒到360分钟，但这取决于含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中的DNA的量以及处理用DNase的浓度；处理时间更优选为30秒到180分钟。此外，在对核酸分离纯化柱中的核酸吸附性多孔膜进行DNase处理的步骤中，适合的温度为4℃或更高，并且优选的温度为10℃到50℃，为了提高反应效率，较高的温度(例如，50℃到70℃)也是可以的。此外，表述“使DNase在核酸吸附性多孔膜上发生作用”是指DNase与核酸吸附性多孔膜上吸附有核酸的部分发生反应，表述“在核酸吸附性多孔膜上”不限于仅指在核酸吸附性多孔膜的上面，而且还包括多孔膜的孔内，或者膜背面的孔的出口处或类似的地方。

此外，可以向DNase反应溶液中加入由属于元素周期表中第II族的金属形成的盐、钠盐、锂盐、钾盐等，以便使核酸保持吸附在核酸吸附性多孔膜上。作为由属于元素周期表中第II族的金属形成的盐，可优选使用镁盐，作为镁盐，氯化镁或者硫酸镁是更优选的。当使用镁盐时，可以单独使用氯化镁和硫酸镁中的任意一者，或者这两者都可被使用。优选使用氯化镁和硫酸镁是因为它们既具有令人满意的使DNase活性得以表现的功能又具有令人满意的使核酸保持吸附在核酸吸附性多孔膜上的功能。当使用氯化镁和硫酸镁时，其浓度优选为10毫摩尔/L至500毫摩尔/L、更优选为10毫摩尔/L至200毫摩尔/L。

步骤(3)，使回收液穿过核酸吸附性多孔膜，从而使核酸从多孔膜上解吸附(回收步骤)

下面将对(3)使回收液穿过核酸吸附性多孔膜从而使核酸从多孔膜上解吸附的步骤进行描述。

通过使用试管、移液管、自动注入装置或具有类似功能的供料装置将回收液供给容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱。将回收液由核酸分离纯化柱的第一个开口(含核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)供入，并且使用与所述第一个开口连接的压力差产生装置(例如，滴液管、注射器、泵和电动移液管等)，由此使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使回收液穿过核酸吸附性多孔膜，并从不同于所述第一个开口的另一个开口排出回收液。此外，回收液可由第一个开口供入并由该第一个开口排出。此外，回收液可由不同于所述第一个开口(含核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)的另一个开口供入，并由该同一开口排出。在这些方式中，更优选的方式如下：由核酸分离纯化柱的第一个开口供入、穿过核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一个开口的另一个开口排出，这是因为该方式具有优异的回收效率。

考虑到由试验样品制备的核酸混合物溶液的体积，可通过控制回收液的体积来进行RNA的解吸附。含有经分离和纯化的核酸的回收液的量(即，由所述柱内的容器排出并回收得到的RNA溶液的量)与当时所使用的试验样品的量有关。概括而言，回收液常规用量为几十微升到几百微升，但是由于试验样品的用量极少，或者所需的待分离和纯化的RNA量的较大，所以回收液的量可以在1微升到几十毫升之间变化。

可优选使用经纯化的蒸馏水、Tris缓冲剂、Tris/EDTA缓冲剂等作为回收液。此外，当在回收步骤后将回收的核酸进行RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)时，可使用用于RT-PCR的缓冲剂溶液(例如，含有最终浓度为75亳摩尔/L的KCl、50毫摩尔/L的Tris-HCl、3.0毫摩尔/L的MgCl₂以及10毫摩尔/L的DDT的水溶液)。

回收液的pH优选为pH1到pH10。考虑到RNA的稳定性，中性至酸性的pH是优选的，因此pH2到pH7是优选的。特别是离子强度和盐浓度会对被吸附RNA的洗脱产生影响。回收液的离子强度优选为500毫摩尔/L或更低。盐浓度优选为0.5摩尔/L或更低、更优选为0.01毫摩尔/L到50毫摩尔/L。由此使RNA的收率提高，并且可以回收大量的RNA。

通过参照初始的核酸混合物溶液的体积来减小回收液的体积，可以得到含有浓缩RNA的回收液。优选的是，(回收液的体积)∶(核酸混合物溶液的体积)＝1∶100到99∶100；更优选的是，(回收液的体积)∶(核酸混合物溶液的体积)＝1∶10到9∶10。由此，可以方便地浓缩RNA，而无需在核酸分离纯化之后的步骤中实施浓缩操作。通过这些方法，可提供一种用于得到RNA溶液的方法，该溶液中的RNA浓度比试验样品中的高。

此外，另一方面，通过在回收液的体积大于初始核酸混合物溶液的体积的条件下使RNA解吸附，可得到含有所需浓度的RNA的回收液，并且可得到其中RNA的浓度适合于下步操作(例如，RT-PCR或类似的操作)的回收液。优选的是，(回收液的体积)∶(核酸混合物溶液的体积)＝1∶1到50∶1；更优选的是，(回收液的体积)∶(核酸混合物溶液的体积)＝1∶1到5∶1。由此可具有这样的优点，即避免在核酸分离纯化之后进行繁琐的浓度调节操作。此外，通过使用足量的回收液，可以使从多孔膜回收的RNA的收率提高。

并且，通过根据目的的不同来改变回收液的温度，可以方便地回收RNA。例如，可以通过将回收液的温度改变为0℃到10℃之后，使RNA从多孔膜上解吸附，由此通过抑制核糖核酸酶的活性，来防止RNA降解，而不是加入能够抑制酶的降解作用的某种试剂或采取能够抑制酶的降解作用的特殊操作，因此可以方便有效地得到RNA溶液。

此外，在回收液的温度被设定为10℃到35℃时，可以在通常的室温条件下进行RNA的回收，并通过使其解吸附来分离和纯化RNA，而无需复杂的步骤。

此外，另一方面，通过将回收液的温度升高到较高温度(例如，35℃到70℃)，可方便地使RNA从多孔膜上解吸附，并具有较高的收率，而无需借助于复杂的操作。

对回收液注入的次数没有限定，但是注入次数可以是一次或多次。通常，在方便快捷地分离和纯化RNA时，可以进行一次注入回收液的操作，但是在回收大量RNA时，可以多次注入回收液。

在回收步骤中，可以将RNA回收液制成可以在后续步骤中使用的组合物。经分离和纯化的RNA有时被应用于RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)方法中。在这种情况下，经分离和纯化的RNA溶液必须使用适合于RT-PCR方法的缓冲剂溶液来进行稀释。通过在根据所述方法的回收步骤中使用适合于RT-PCR方法的缓冲剂，可以方便快捷地进入随后的RT-PCR步骤。

并且，在回收步骤中，可以在RNA由所述柱排放出来并被回收于回收液中之后加入用于防止RNA降解的稳定剂。可加入抗菌剂、杀真菌剂、核酸降解抑制剂以及类似的试剂作为稳定剂。作为核酸酶抑制剂，具体可以提及EDTA及类似的试剂。此外，作为另一个实施方案，可预先向回收容器中加入稳定剂。

对在回收步骤中使用的回收容器没有特别限定，但是可以使用由对在260nm处的光无吸收的原料制成的回收容器。在这种情况下，无需把回收的RNA溶液转移到其它容器就可测量该溶液的浓度。对在260nm处的光无吸收的原料的例子包括石英玻璃等，但并不限于此。

<成套用具>

可以将用于实施上文所述的本发明的RNA分离纯化方法的所述柱、试剂等制成成套用具。具体而言，该成套用具包含：(i)核酸分离纯化柱，该柱同时容纳有核酸吸附性多孔膜和试剂，例如(ii)溶血剂、(iii)核酸稳定剂、(iv)洗涤液以及(v)回收液。

<自动装置>

如上所述，可以通过使用自动装置(该自动装置可以自动进行本发明的方法所包括的各个步骤)来实施用于从含核酸的试验样品中分离和纯化RNA的方法(该方法使用了在具有至少两个开口的容器内容纳核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱、以及压力差产生装置)。此外，可以使用能够自动使用所述成套用具的自动装置来进行本发明的方法。结果，不仅操作简单和快速，而且还可以在不受操作者操作技能影响的条件下得到一定浓度的RNA。

下面具体说明自动装置，该自动装置通过使用在具有至少两个开口的容器内容纳核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱、以及压力差产生装置来自动地实施从含核酸的试验样品中分离和纯化RNA的步骤，但是本发明的自动装置不限于此。

自动装置是一种用于自动地实施分离和纯化操作来分离和纯化RNA的装置，其实施的分离和纯化操作包括以下步骤：使用容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱，其中所述多孔膜可以使溶液从其内部穿过；将含有DNA和RNA的核酸混合物溶液注入核酸分离纯化柱中，从而通过加压使核酸混合物溶液中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；将洗涤液注入核酸分离纯化柱中，从而通过加压除去杂质；将回收液注入注入核酸分离纯化柱中，使得被吸附的RNA从核酸吸附性多孔膜上解吸附并回收解吸附的RNA和回收液。所述自动装置包含：负载机构，其用于保持核酸分离纯化柱、废液容器和回收容器，其中所述废液容器用于容纳样品溶液和洗涤液的排放溶液，所述回收容器用于容纳含有回收的RNA的回收液(RNA溶液)；压缩空气供给机构，其用于把压缩空气引入到核酸分离纯化柱中；以及注入机构，其用于把洗涤液和回收液注入到核酸分离纯化柱中。

此外，所述自动装置是一种用于通过自动地实施分离和纯化操作来选择性地分离和纯化RNA的装置，所述分离和纯化操作包括以下步骤：在洗涤步骤中将DNase注入到核酸分离纯化柱中，从而使核酸吸附性多孔膜与DNase发生作用；在通过加压使DNase从内部穿过核酸吸附性多孔膜后，将洗涤液注入到核酸分离纯化柱中；将洗涤液注入到核酸分离纯化柱中，以通过加压除去杂质；在除去降解的DNA后通过加压将回收液注入到核酸分离纯化柱中，使被吸附的RNA从核酸吸附性多孔膜上解吸附并回收已解吸附的RNA和回收液。优选的是，所述自动装置包含：负载机构，其用于保持核酸分离纯化柱、废液容器和回收容器，其中所述废液容器容纳有核酸混合物溶液残留物、被排放的DNase溶液和洗涤液，所述回收容器容纳有含有回收的RNA的回收溶液；压缩空气供给机构，其用于把压缩空气引入核酸分离纯化柱中；以及注入机构，其用于把洗涤液、DNase和回收液注入到核酸分离纯化柱中。

所述的负载机构优选包含：被安装在主体装置上的立架；承载于立架上并可上下移动的柱支架，该柱支架支承着核酸分离纯化柱；以及用于支承废液容器和回收容器的容器支架，该废液容器和回收容器在柱支架的下方相对于核酸分离纯化柱可互换位置。

所述的压缩空气供给机构优选包含：从底部喷射压缩空气的气嘴；压头，用于通过承载气嘴使气嘴以相对于由柱支架支承的核酸分离纯化柱而上下移动；以及安装在压头中的定位装置，该定位装置对位于负载机构的台架中的核酸分离纯化柱进行定位。

此外，所述的注入机构优选包含：注入洗涤液的洗涤液注入嘴；注入回收液的回收液注入嘴；注入嘴移动板，该移动板能够在由负载机构支承的核酸分离纯化柱上依次移动并支承DNase注入嘴(如果需要的话)；洗涤液供给泵，其通过从容纳有洗涤液的洗涤液瓶子中抽吸洗涤液而将洗涤液供入洗涤液注入嘴；回收液供给泵，其通过从容纳有回收液的回收液瓶子中抽吸回收液而将回收液供入回收液注入嘴；如果需要的话，所述注入机构还包含DNase供给泵，其通过从容纳有DNase的DNase瓶子中抽吸DNase而将DNase供入DNase注入嘴。

根据本发明的自动装置(例如上述自动装置)，其包含：核酸分离纯化柱；负载机构，其用于支承废液容器和回收容器；压缩空气供给机构，其用于把压缩空气引入核酸分离纯化柱中；以及注入机构，其分别把洗涤液、回收液和(如果需要的话)DNase注入核酸分离纯化柱中；所述的自动进行分离和纯化RNA的操作包括以下步骤：向容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱内注入含核酸的样品溶液，从而通过加压将核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；注入洗涤液，从而洗涤和排出杂质；注入回收液，从而使被吸附的RNA从核酸吸附性多孔膜上解吸附；并回收解吸附的RNA，因此该机构可以在短时间内、高效自动地分离和纯化混合物溶液中所含有的RNA，并且该机构可以以紧凑方式构造而成。

此外，当负载机构是由立架、柱支架(其可以上下移动，并支承核酸分离纯化柱)以及容器支架(其支承废液容器和回收容器，并可使所述容器交换位置)构成时，就可以设定核酸分离纯化柱和上述这两个容器，并可以使废液容器和回收容器容易地互换。

此外，当压缩空气供给机构是由气嘴、用于上下移动气嘴的压头以及用于确定核酸分离纯化柱的位置的定位装置构成时，使用简单的机构就可以可靠地供给压缩空气。

此外，当注入机构是由洗涤液注入嘴、回收液注入嘴、能够在核酸分离纯化柱上依次移动的注入嘴移动板、通过从洗涤液瓶子中抽吸洗涤液从而把洗涤液供入洗涤液注入嘴的洗涤液供给泵以及通过从回收液瓶子中抽吸回收液从而把回收液供入回收液注入嘴的回收液供给泵构成时，就可以通过使用简单的机构依次注入洗涤液和回收液。

实施例

下面根据实施例对本发明进行详细说明，但是本发明不限于下列这些实施例。

[实施例1]

(1)核酸分离纯化柱的制备

制备内径为7mm并且能够容纳800μl溶液的核酸分离纯化柱，该核酸分离纯化柱具有用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分。

(2)关于核酸吸附性多孔膜，使用经皂化的三醋酸纤维素多孔膜，并且将核酸吸附性多孔膜装在上述(1)中制备的核酸分离纯化柱的用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分中。

(3)溶血剂、核酸溶解性试剂、洗涤液和回收液的制备

根据下述所示配方来制备溶血剂A、核酸溶解性试剂A1和A2、洗涤液A和回收液A。

(溶血剂A)

氯化铵 150毫摩尔/L

碳酸氢钠 10毫摩尔/L

EDTA(pH8.0) 0.1毫摩尔/L

(核酸溶解性试剂A1)

硫氰酸胍(由Wako Pure Chemical Industries 3.5毫摩尔/L株式会社生产)

BisTris(由Dojindo Laboratories生产)0.25毫摩尔/L

用盐酸将pH调节为6.5

在即将使用核酸溶解性试剂A1之前，加入1.0体积％的2-巯基乙醇。

(核酸溶解性试剂A2)

吐温20(由Wako Pure Chemical Industries 15质量％

株式会社生产)

BisTris(由Dojindo Laboratories生产)0.1毫摩尔/L

用盐酸将pH调节为6.0

(洗涤液A)

Tris-HCl(pH7.5) 10毫摩尔/L

氯化钠 100毫摩尔/L

乙醇 30体积％

(回收液A)

Tris-HCl(pH6.5) 1毫摩尔/L

(4)核酸混合物溶液的制备

将经过作为抗凝剂的EDTA-2Na处理的人类全血(白细胞总数分别为3×10⁶、1×10⁷、1.5×10⁷、3×10⁷和4×10⁷)转移至50mL的锥形管中，向其中分别加入其量为各管中全血量的5倍的溶血剂A，并在冰上温育15分钟。在温育过程中，进行两次涡流混合。待确认血液悬浮液变透明之后，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。在除去上清液之后，向上述锥形管容器中加入其量为初始全血量的2倍的溶血剂A。进行5秒钟轻微的涡流混合以使细胞悬浮，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。向上述所得到的白细胞团中加入350μl的核酸溶解性试剂A1，并将所得样品转移至1.5mL的微管中。通过1分钟的涡流混合使白细胞溶解。此时，加入175μl的核酸溶解性试剂A2，并使用涡流混合器搅拌15秒钟。然后再加入175μl的99.5体积％或更高的特级乙醇，并使用涡流混合器搅拌1分钟。

(5)分离和纯化RNA的操作

将由上述操作得到的核酸混合物溶液注入到由上述(1)和(2)制备的具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。通过使所注入的含核酸的混合物样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，使得所注入的含核酸的样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。接下来，将750μl的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。同样的操作重复3次。接着，将50μl的回收液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出，由此回收洗脱液。对于白细胞数目不同的所有样品而言，对每个样品所进行的分离和纯化RNA的操作所需要的时间均少于5分钟。

(6)所回收的核酸的产量和纯度

由实施例1回收的RNA的产量和纯度(260/280)如表1所示。

表1

白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280
白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280	3×10⁶	1.8	2.0
1×10⁷	2.3	2.0	3×10⁶	1.8	2.0
1×10⁷	2.3	2.0	1.5×10⁷	3.8	2.0
3×10⁷	5.6	2.0	1.5×10⁷	3.8	2.0
3×10⁷	5.6	2.0	4×10⁷	8.4	2.0

由此，可以方便地从白细胞中回收得到高纯度的RNA。

[实施例2]

(7)核酸分离纯化柱的制备

制备内径为7mm并且能够容纳7ml溶液的核酸分离纯化柱，该核酸分离纯化柱具有用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分。

(8)关于核酸吸附性多孔膜，使用经皂化的三醋酸纤维素多孔膜，并且将核酸吸附性多孔膜装在上述(7)中制备的核酸分离纯化柱的用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分中。

(9)溶血剂、核酸溶解性试剂、洗涤液和回收液的制备

按照与实施例1相同的方式，制备溶血剂A、核酸溶解性试剂A1和A2、洗涤液A和回收液A。

(10)核酸混合物溶液的制备

将经过作为抗凝剂的EDTA-2Na处理的人类全血(白细胞总数分别为1.5×10⁷、3×10⁷、6×10⁷和8×10⁷)转移至50mL的锥形管中，向其中分别加入其量为各管中全血量的5倍的溶血剂A，并在冰上温育15分钟。在温育过程中，进行两次涡流混合。待确认血液悬浮液变透明之后，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。在除去上清液之后，向上述锥形管容器中加入其量为初始全血量的2倍的溶血剂A。进行5秒钟轻微的涡流混合以使细胞悬浮，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。向上述所得到的白细胞团中加入2mL的核酸溶解性试剂A1，并通过1分钟的涡流混合使白细胞溶解。此时，加入1mL的核酸溶解性试剂A2，并使用涡流混合器搅拌15秒钟。然后再加入1mL的99.5体积％或更高的特级乙醇，并使用涡流混合器搅拌1分钟。

(11)分离和纯化核酸的操作

将由上述操作得到的核酸混合物溶液注入到由上述(7)和(8)制备的具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。通过使所注入的含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，使得所注入的含核酸的样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。接下来，将4.5mL的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。同样的操作重复3次。接着，将500μl的回收液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出，由此回收洗脱液。对于白细胞数目不同的所有样品而言，对每个样品所进行的分离和纯化RNA的操作所需要的时间均少于8分钟。

(12)所回收的核酸的产量和纯度

由实施例2回收的RNA的产量和纯度(260/280)如表2所示。

表2

白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280
白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280	1.5×10⁷	7.2	2.0
3×10⁷	14.6	2.0	1.5×10⁷	7.2	2.0
3×10⁷	14.6	2.0	6×10⁷	22.6	2.0
8×10⁷	38.4	2.0	6×10⁷	22.6	2.0

由此，可以方便地从白细胞中回收得到高纯度的RNA。

[实施例3]

(13)核酸分离纯化柱的制备

制备内径为20mm并且能够容纳10mL溶液的核酸分离纯化柱，该核酸分离纯化柱具有用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分。

(14)关于核酸吸附性多孔膜，使用经皂化的三醋酸纤维素多孔膜，并且将核酸吸附性多孔膜装在上述(13)中制备的核酸分离纯化柱的用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分中。

(15)溶血剂、核酸溶解性试剂、洗涤液和回收液的制备

(16)核酸混合物溶液的制备

将经过作为抗凝剂的EDTA-2Na处理的人类全血(白细胞总数分别为1×10⁷、3×10⁷和6×10⁷)转移至50mL的锥形管中，向其中分别加入其量为各管中全血量的5倍的溶血剂A，并在冰上温育15分钟。在温育过程中，进行两次涡流混合。待确认血液悬浮液变透明之后，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。在除去上清液之后，向上述锥形管容器中加入其量为初始全血量的2倍的溶血剂A。进行5秒钟轻微的涡流混合以使细胞悬浮，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。向上述所得到的白细胞团中加入2mL的核酸溶解性试剂A1，并通过1分钟的涡流混合使白细胞溶解。此时，加入1mL的核酸溶解性试剂A2，并使用涡流混合器搅拌15秒钟。然后再加入1mL的99.5体积％或更高的特级乙醇，并使用涡流混合器搅拌1分钟。

(17)分离和纯化RNA的操作

将由上述操作得到的核酸混合物溶液注入到由上述(13)和(14)制备的具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。通过使所注入的含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，使得所注入的含核酸的样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。接下来，将4.5mL的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。同样的操作重复3次。接着，将500μl的回收液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出，由此回收洗脱液。对于白细胞数目不同的所有样品而言，对每1个样品所进行的分离和纯化RNA的操作所需要的时间均少于1分半钟。

(18)所回收的核酸的产量和纯度

由实施例3回收的RNA的产量和纯度(260/280)如表3所示。

表3

白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280
白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280	1×10⁷	4.6	2.0
3×10⁷	10.7	2.0	1×10⁷	4.6	2.0
3×10⁷	10.7	2.0	6×10⁷	17.7	2.0

由此，可以方便地从白细胞中回收得到高纯度的RNA。

[实施例4]

(19)核酸分离纯化柱的制备

(20)关于核酸吸附性多孔膜，使用经皂化的三醋酸纤维素多孔膜，并且将核酸吸附性多孔膜装在上述(19)中制备的核酸分离纯化柱的用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分中。

(21)溶血剂、核酸溶解性试剂、洗涤液和回收液的制备

使用由QIAGEN公司生产的QIAamp RNA血液迷你型成套用具所带有的溶液。

(溶血剂)缓冲剂EL：含有氯化铵

(核酸溶解性试剂)RTL：含有硫氰酸胍

(洗涤液-1)RW1

(洗涤液-2)RPE(含有80体积％的EtOH)

(回收液)不含RNase的水

(22)核酸混合物溶液的制备

将经过作为抗凝剂的EDTA-2Na处理的人类全血(白细胞总数为1×10⁷)转移至50mL的锥形管中，向其中分别加入其量为锥形管中全血量的5倍的缓冲剂EL，并在冰上温育15分钟。在温育过程中，进行两次涡流混合。待确认血液悬浮液变透明之后，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。在除去上清液之后，向上述锥形管容器中加入其量为初始全血量的2倍的溶血剂A。进行5秒钟轻微的涡流混合以使细胞悬浮，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。将上述得到的白细胞团转移至1.5mL的微管中，并加入350μL的RLT。通过1分钟的涡流混合使白细胞溶解。此时，加入350μL的70体积％或更高的特级乙醇，并使用涡流混合器搅拌1分钟。

(23)分离和纯化RNA的操作

将由上述操作得到的核酸混合物溶液注入到由上述(19)和(20)制备的具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。通过使所注入的含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，使得所注入的含核酸的样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。接下来，将750μL的洗涤液-1注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。接着，将500μl的洗涤液-2注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。同样的操作重复2次。接着，将50μl的回收液注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出，由此回收洗脱液。分离和纯化RNA的操作所需要的时间少于1分钟。该次操作时间甚至少于实施例1的操作时间。

(24)所回收的核酸的产量和纯度

由实施例4回收的RNA的产量和纯度(260/280)如表4所示。

表4

白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280
白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280	1×10⁷	2.8	1.9

因此，虽然使用的是由QIAGEN公司生产的QIAamp RNA血液迷你型成套用具所带有的溶液，但仍可以方便地从白细胞中回收得到高纯度的RNA。

[实施例5]

(25)柱、溶血剂、核酸溶解性试剂、洗涤液和回收液的制备

按照与实施例1相同的方式来制备柱、溶血剂A、核酸溶解性试剂A1和A2、洗涤液A以及回收液A。

(26)核酸混合物溶液的制备

将经过作为抗凝剂的EDTA-2Na处理的人类全血(白细胞总数为5×10⁶和1×10⁷)转移至50mL的锥形管中，向其中分别加入其量为各锥形管中全血量的5倍的溶血剂A，并在冰上温育15分钟。在温育过程中，进行两次涡流混合。待确认血液悬浮液变透明之后，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。在除去上清液之后，向上述锥形管容器中加入其量为初始全血量的2倍的溶血剂A。进行5秒钟轻微的涡流混合以使细胞悬浮，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。向上述所得到的白细胞团中加入350μL核酸溶解性试剂A1，并通过1分钟的涡流混合使白细胞溶解。此时，加入175μL核酸溶解性试剂A2，并使用涡流混合器搅拌15秒钟。然后再加入175μL的99.5体积％或更高的特级乙醇，并使用涡流混合器搅拌1分钟。

(27)分离和纯化RNA的操作

将由上述操作得到的核酸混合物溶液注入到由上述(25)制备的具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。通过使所注入的含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，使得所注入的含核酸的样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。接下来，将750μL的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。在取下压力差产生装置后，将40μl(104μl/cm²)的DNase溶液(使用了由Promega公司制造的RQ1不含RNase的DNase，其酶活性为500Kunitz U/L)施加到所述膜上，并在室温下静置5分钟。将如上文所述的同样的洗涤操作重复2次。接着，将50μl的回收液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，并将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出，由此回收洗脱液。对具有各种数目的白细胞的各样品而言，对每1个样品进行分离和纯化RNA的操作所需要的时间均少于6分钟，这段时间包括了DNase反应的时间。

(28)所回收的核酸的产量和纯度

由实施例5回收的RNA的产量和纯度(260/280)如表5所示。

表5

白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280
白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280	5×10⁶	1.0	2.0
1×10⁷	2.0	2.0	5×10⁶	1.0	2.0

(29)对所回收的核酸进行电泳

对由实施例5回收的RNA的电泳图谱如图1所示。通过经过DNase处理将DNA完全除去可以得到纯度较高的RNA。

[实施例6]

(30)柱、溶血剂、核酸溶解性试剂、洗涤液和回收液的制备

按照与实施例1相同的方式来制备柱、溶血剂A、核酸溶解性试剂A1、洗涤液A以及回收液A。

(31)核酸混合物溶液的制备

将经过作为抗凝剂的EDTA-2Na处理的人类全血(白细胞总数为1.5×10⁷)转移至50mL的锥形管中，向其中分别加入其量为锥形管中全血量的5倍的溶血剂A，并在冰上温育15分钟。在温育过程中，进行两次涡流混合。待确认血液悬浮液变透明之后，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。在除去上清液之后，向上述锥形管容器中加入其量为初始全血量的2倍的溶血剂A。进行5秒钟轻微的涡流混合以使细胞悬浮，在4℃下以400×g的速度离心10分钟，然后将上清液完全除去。向上述所得到的白细胞团中加入520μL核酸溶解性试剂A1，并采用移液操作使该白细胞团松散。通过1分钟的涡流混合使白细胞溶解。此时，加入173μl的99.5体积％或更高的特级乙醇(即，使乙醇浓度为25体积％)，并用涡流混合器搅拌1分钟。此外，以相同的方式制备样品溶液，不同之处在于分别加入223μl、250μl和280μl的99.5体积％或更高的特级乙醇来代替173μl的99.5体积％或更高的特级乙醇。换言之，乙醇的浓度分别为25体积％、30体积％、32.5体积％和35体积％，然后用涡流混合器搅拌1分钟。

(32)分离和纯化RNA的操作

将由上述操作得到的核酸混合物溶液注入到由上述(30)制备的具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。通过使所注入的含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，使得所注入的含核酸的样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。接下来，将750μL的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。同样的操作重复3次。接着，将50μl的回收液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，并将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出，由此回收洗脱液。回收操作重复2次。对具有一定数目的白细胞的各样品而言，对每1个样品进行分离和纯化RNA的操作所需要的时间均少于2分钟。

(33)所回收的核酸的产量和纯度

RNA的产量和纯度(260/280)列于表6中。

表6

乙醇的浓度(体积％)	RNA的产量[μg](第1次回收)	RNA的产量[μg](第2次回收)	260/280
乙醇的浓度(体积％)	RNA的产量[μg](第1次回收)	RNA的产量[μg](第2次回收)	260/280	25	1.7	1.8	2.0
30	5.5	1.4	2.0	25	1.7	1.8	2.0
30	5.5	1.4	2.0	32.5	6.2	1.1	2.1
35	5.4	1.1	2.1	32.5	6.2	1.1	2.1

因此，使用任何浓度的乙醇都可以方便地从白细胞中回收得到高纯度的RNA。

[实施例7]

(34)核酸分离纯化柱的制备

(35)关于核酸吸附性多孔膜，使用经皂化的三醋酸纤维素多孔膜，并且将三片核酸吸附性多孔膜以一片在另一片之上的方式装在上述(34)中制备的核酸分离纯化柱的用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分中。

(36)溶血剂、核酸溶解性试剂A1、洗涤液和回收液的制备

按照与实施例1相同的方式，制备溶血剂A、核酸溶解性试剂A1、洗涤液A和回收液A。

(37)核酸混合物溶液的制备

将经过作为抗凝剂的EDTA-2Na处理的人类全血(白细胞总数为1×10⁷)转移至50mL的锥形管中，向其中分别加入其量为锥形管中全血量的5倍的溶血剂A，并在冰上温育15分钟。在温育过程中，进行两次涡流混合。待确认血液悬浮液变透明之后，在4℃下以2000×g的速度离心2分钟，然后将上清液完全除去。在除去上清液之后，向上述锥形管容器中加入其量为初始全血量的2倍的溶血剂A。进行5秒钟轻微的涡流混合以使细胞悬浮，在4℃下以2000×g的速度离心2分钟，然后将上清液完全除去。向上述所得到的白细胞团中加入520μL核酸溶解性试剂A1，并采用移液操作使该白细胞团松散。通过30秒钟的涡流混合使白细胞溶解。此时，加入250μl的99.5体积％或更高的特级乙醇(即，使乙醇浓度为32.5体积％)，并用涡流混合器搅拌5分钟。

(38)分离和纯化RNA的操作

将由上述操作得到的核酸混合物溶液注入到由上述(34)和(35)制备的具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。通过使所注入的含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，使得所注入的含核酸的样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。接下来，将750μL的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。在取下压力差产生装置后，将120μl(312μl/cm²)的DNase溶液(使用了由Sigma公司制造的扩增级DNaseI，其酶活性为500Kunitz U/L)施加到所述膜上，并室温下静置15分钟。将如上文所述的同样的洗涤操作重复2次。接着，将50μl的回收液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，并将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(160kPa)。被注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出，由此回收洗脱液。对具有一定数目的白细胞的各样品而言，对每1个样品进行分离和纯化RNA的操作所需要的时间均少于16.5分钟，这段时间包括了DNase反应的时间。

(39)所回收的核酸的产量和纯度

由实施例7回收的RNA的产量和纯度(260/280)如表7所示。

表7

白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280
白细胞的数目	RNA的产量[μg]	260/280	1×10⁷	4.7	2.2
1×10⁷	5.0	2.2	1×10⁷	4.7	2.2

(40)对所回收的核酸进行电泳

对由实施例7回收的RNA的电泳图谱如图2所示。通过经过DNase处理将DNA完全除去可以得到纯度较高的RNA。

[实施例8]

(41)柱、溶血剂、核酸溶解性试剂A1、洗涤液A和回收液A的制备

按照与实施例7相同的方式来制备柱、溶血剂A、核酸溶解性试剂A1、洗涤液A以及回收液A。

(42)DNase反应溶液的制备

根据以下所示配方来制备DNase反应溶液A1。

(DNase反应溶液A1相应于镁的最终浓度为2毫摩尔/L)

扩增级DNaseI(由Invitrogen公司生产)20U

1×DNaseI反应缓冲剂

Tris-HCl(pH8.4) 20毫摩尔/L

MgCl₂ 2毫摩尔/L

KCl 50毫摩尔/L

(43)核酸混合物溶液的制备

将经过作为抗凝剂的EDTA-2Na处理的人类全血(白细胞总数为1×10⁷、2×10⁷和3×10⁷)转移至50mL的锥形管中，向其中分别加入其量为各锥形管中全血量的5倍的溶血剂A，并在冰上温育15分钟。在温育过程中，进行两次涡流混合。待确认血液悬浮液变透明之后，在4℃下以2000×g的速度离心2分钟，然后将上清液完全除去。在除去上清液之后，向上述锥形管容器中加入其量为初始全血量的2倍的溶血剂A。进行5秒钟轻微的涡流混合以使细胞悬浮，在4℃下以2000×g的速度离心2分钟，然后将上清液完全除去。向上述所得到的白细胞团中加入520μL核酸溶解性试剂A1，并通过使用涡流混合器搅拌30秒钟使白细胞溶解。此时，加入250μL的99.5体积％或更高的特级乙醇。换言之，乙醇的浓度为32.5体积％，然后使用涡流混合器将所得溶液搅拌30秒钟。

(44)分离和纯化RNA的操作

将由上述操作得到的核酸混合物溶液注入到由上述(41)制备的具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。通过使所注入的含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，使得所注入的含核酸的样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。接下来，将750μL的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。向所述的第一个开口注入40μl的DNase溶液A1，并将所得混合物在室温下温育15分钟。然后，将750μl的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，接着将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。同样的操作重复2次。接着，将50μl的回收液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，并将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。被注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出，由此回收洗脱液。对具有各种数目的白细胞的各样品而言，对每1个样品进行分离和纯化RNA的操作所需要的时间均少于18分钟，这段时间包括了DNase反应的时间。

(45)所回收的核酸的产量和纯度

由实施例8回收的RNA的产量和纯度(260/280)如表8所示。

表8

白细胞的数目	DNase反应溶液中镁的浓度[毫摩尔/L]	RNA的产量[μg]	260/280
白细胞的数目	DNase反应溶液中镁的浓度[毫摩尔/L]	RNA的产量[μg]	260/280	1×10⁷	2	4.5	2.2
2×10⁷	2	7.0	2.2	1×10⁷	2	4.5	2.2
2×10⁷	2	7.0	2.2	3×10⁷	2	10.6	2.2

因此，通过DNase处理可以完全除去DNA，并且可以方便地从白细胞中回收得到高纯度的RNA。

[实施例9]

(46)柱、溶血剂、核酸溶解性试剂A1、洗涤液A和回收液A的制备

(47)DNase反应溶液的制备

根据以下所示配方来制备DNase反应溶液A2。

(DNase反应溶液A2相应于镁的最终浓度为102毫摩尔/L)

扩增级DNase I(由Invitrogen公司生产)20U

1×DNase I反应缓冲剂

Tris-HCl(pH8.4) 20毫摩尔/L

MgCl₂ 2毫摩尔/L

KCl 50毫摩尔/L

1M MgCl₂ 0.1摩尔/L

(48)核酸混合物溶液的制备

将经过作为抗凝剂的EDTA-2Na处理的人类全血(白细胞总数为1×10⁷、2×10⁷和3×10⁷)转移至50mL的锥形管中，向其中分别加入其量为各锥形管中全血量的5倍的溶血剂A，并在冰上温育15分钟。在温育过程中，进行两次涡流混合。待确认血液悬浮液变透明之后，在4℃下以2000×g的速度离心2分钟，然后将上清液完全除去。在除去上清液之后，向上述锥形管容器中加入其量为初始全血量的2倍的溶血剂A。进行5秒钟轻微的涡流混合以使细胞悬浮，在4℃下以2000×g的速度离心2分钟，然后将上清液完全除去。向上述所得到的白细胞团中加入520μL核酸溶解性试剂A1，并通过使用涡流混合器搅拌30秒钟使白细胞溶解。此时，加入250μL的99.5体积％或更高的特级乙醇。换言之，乙醇的浓度变为32.5体积％，然后使用涡流混合器将所得溶液搅拌30秒钟。

(49)分离和纯化RNA的操作

将由上述操作得到的核酸混合物溶液注入到由上述(46)制备的具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。通过使所注入的含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，使得所注入的含核酸的样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。接下来，将750μL的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。向所述的第一个开口注入40μl的DNase溶液A2，并将所得混合物在室温下温育15分钟。然后，将750μl的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，接着将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。同样的操作重复2次。接着，将50μl的回收液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，并将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。被注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出，由此回收洗脱液。对具有各种数目的白细胞的各样品中，对每1个样品进行分离和纯化RNA的操作所需要的时间均少于17分钟，这段时间包括了DNase反应的时间。

(50)所回收的核酸的产量和纯度

由实施例9回收的RNA的产量和纯度(260/280)如表9所示。

表9

白细胞的数目	DNase反应溶液中镁的浓度[毫摩尔/L]	RNA的产量[μg]	260/280
白细胞的数目	DNase反应溶液中镁的浓度[毫摩尔/L]	RNA的产量[μg]	260/280	1×10⁷	102	4.7	2.2
2×10⁷	102	9.0	2.2	1×10⁷	102	4.7	2.2
2×10⁷	102	9.0	2.2	3×10⁷	102	11.4	2.1

[实施例10]

(51)柱、溶血剂、核酸溶解性试剂A1、洗涤液A和回收液A的制备

(52)DNase反应溶液的制备

根据以下所示配方来制备DNase反应溶液A3。

(DNase反应溶液A3相应于镁的最终浓度为102毫摩尔/L)

扩增级DNase I(由Invitrogen公司生产)20U

1×DNase I反应缓冲剂

Tris-HCl(pH8.4) 20毫摩尔/L

MgCl₂ 2毫摩尔/L

KCl 50毫摩尔/L

1M MgSO₄ 0.1摩尔/L

(53)核酸混合物溶液的制备

将经过作为抗凝剂的EDTA-2Na处理的人类全血(白细胞总数为2×10⁷和3×10⁷)转移至50mL的锥形管中，向其中分别加入其量为各锥形管中全血量的5倍的溶血剂A，并在冰上温育15分钟。在温育过程中，进行两次涡流混合。待确认血液悬浮液变透明之后，在4℃下以2000×g的速度离心2分钟，然后将上清液完全除去。在除去上清液之后，向上述锥形管容器中加入其量为初始全血量的2倍的溶血剂A。进行5秒钟轻微的涡流混合以使细胞悬浮，在4℃下以2000×g的速度离心2分钟，然后将上清液完全除去。向上述所得到的白细胞团中加入520μL核酸溶解性试剂A1，并通过使用涡流混合器搅拌30秒钟使白细胞溶解。此时，加入250μL的99.5体积％或更高的特级乙醇。换言之，乙醇的浓度变为32.5体积％，然后使用涡流混合器将所得溶液搅拌30秒钟。

(54)分离和纯化RNA的操作

将由上述操作得到的核酸混合物溶液注入到由上述(34)和(35)制备的具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。通过使所注入的含核酸的样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，使得所注入的含核酸的样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。接下来，将750μL的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。向所述的第一个开口注入40μl的DNase溶液A3，并将所得混合物在室温下温育15分钟。然后，将750μl的洗涤液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，接着将压力差产生装置与该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。被注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出。同样的操作重复2次。接着，将50μl的回收液A注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，并将压力差产生装置与核酸分离纯化柱的该第一个开口连接，从而使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态。被注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜并从另一个开口排出，由此回收洗脱液。对具有各种数目的白细胞的各样品而言，对每1个样品进行分离和纯化RNA的操作所需要的时间均少于18分钟，这段时间包括了DNase反应的时间。

(55)所回收的核酸的产量和纯度

由实施例10回收的RNA的产量和纯度(260/280)如表10所示。

表10

白细胞的数目	DNase反应溶液中镁的浓度[毫摩尔/L]	RNA的产量[μg]	260/280
白细胞的数目	DNase反应溶液中镁的浓度[毫摩尔/L]	RNA的产量[μg]	260/280	2×10⁷	102	8.4	2.1
3×10⁷	102	13.3	2.2	2×10⁷	102	8.4	2.1

工业实用性

根据本发明，通过从血液中分离出白细胞团从而可以以较高的效率和较高的纯度来得到(例如)RNA水溶液形式的RNA。

此外，根据本发明的分离和纯化RNA的方法，可以以优异的分离能力、方便性、快速性和自动操作能力来从试验样品中分离和纯化RNA。

本申请中已经要求外国优先权的每一份外国专利申请的全部公开内容都以引用方式并入本文，就如同这些内容被全部列出一样。

Claims

1.一种分离和纯化RNA的方法，该方法包括：

其中所述的核酸吸附性多孔膜是能够通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附核酸的多孔膜，并且

(II)向所述容器中加入溶血剂从而得到白细胞团；

(III)向所述白细胞团中加入核酸溶解性试剂从而得到混合物溶液；和

2.根据权利要求1中所述的分离和纯化RNA的方法，

3.根据权利要求1或2所述的分离和纯化RNA的方法，

其中在所述的步骤(II)中加入所述的溶血剂之后，在0℃至35℃下进行温育。

4.根据权利要求1至3中任意一项所述的分离和纯化RNA的方法，

5.根据权利要求4所述的分离和纯化RNA的方法，

其中所述离液盐为胍盐。

6.根据权利要求4或5所述的分离和纯化RNA的方法，

其中所述核酸稳定剂为还原剂。

7.根据权利要求4至6中任意一项所述的分离和纯化RNA的方法，

其中所述表面活性剂包括非离子型表面活性剂。

8.根据权利要求1至7中任意一项所述的分离和纯化RNA的方法，

9.一种用于自动实施根据权利要求1至8中任意一项所述的分离和纯化RNA的方法的装置。

10.一种用于实施根据权利要求1至8中任意一项所述的分离和纯化RNA的方法的成套用具，该成套用具包括：

(i)核酸分离纯化柱，其装有核酸吸附性多孔膜；以及

试剂，该试剂包括：

(ii)溶血剂；

(iii)核酸溶解性试剂；

(iv)洗涤液；以及

(v)回收液。

11.一种用于自动实施对根据权利要求10所述的成套用具的使用的装置。