CN1938423A - 选择性地分离和纯化rna的方法以及分离和纯化核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种从含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中选择性地分离和纯化RNA的方法，其中所述方法包括以下步骤：(1－a)吸附核酸；(1－b)洗涤；(1－c)进行脱氧核糖核酸酶处理；(1－d)洗涤；以及(1－e)通过回收液使RNA从核酸吸附性多孔膜解吸附，其中在步骤(1－c)中，每1cm2的多孔膜使用总量为130μL或更少的脱氧核糖核酸酶溶液。以及一种选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，该方法包括以下步骤：(2－a)吸附核酸；(2－b)用洗涤液进行洗涤；以及(2－c)使核酸从核酸吸附性多孔膜解吸附，其中所述洗涤液含有水溶性有机溶剂，浓度为50重量％或更低，且不含离液盐。

Description

选择性地分离和纯化RNA的方法以及分离和纯化核酸的方法
技术领域
本发明涉及用于选择性地分离和纯化RNA的方法。此外，本发明涉及用于分离和纯化核酸的方法。具体地说，本发明涉及从含有RNA和DNA的核酸混合物中分离和纯化RNA或DNA的方法。更具体地说，本发明涉及这样一种方法，该方法使用核酸分离纯化柱和压力差产生装置，从含有RNA和DNA的核酸混合物中分离和纯化RNA或DNA，其中所述核酸分离纯化柱包含有具有至少两个开口的容器，并且所述核酸分离纯化柱在该容器之内容纳有核酸吸附性多孔膜。
背景技术
各种形式的核酸应用于各个领域。例如，在重组核酸技术领域中，需要将核酸以探针、基因组核酸和质粒核酸的形式使用。
此外，在诊断学领域中，核酸以各种形式应用于各种目的。例如，在检测和诊断人类病原体时，常常使用核酸探针。同样，核酸也用于检测遗传性病症。核酸还用于检测食品污染物。此外，基于从绘制基因图谱到克隆和重组表达的各种原因，也常常用核酸对所关心的核酸进行定位、识别和分离。
在许多情况下，只有极微量的核酸可以利用，因此分离和纯化过程费时费力。这些费时费力的操作有时可能会导致核酸损失。
在从来自于血清、尿和细菌培养物的样品中纯化核酸时，还会碰到污染和假阳性结果的问题。
关于广为人知的分离和纯化方法，有这样一种方法，其中：将核酸吸附到二氧化硅、二氧化硅聚合物(silica polymer)、硅酸镁或类似的固相上，随后通过实施洗涤、解吸附和类似的操作对核酸进行分离和纯化(参见例如专利文献JPA-7-51065)。该方法具有优异的分离性能，但是，该方法在方便性、快速性和自动化适应性方面还存在不足，并且该方法存在如下问题：由于该方法所使用的工具和装置不符合自动化和小型化的要求，所以很难在工业化大规模生产过程中制造出性能相同的所述工具和装置(特别是吸附介质)；并且由于所述工具和装置不便于加工，所以它们难以被加工成各种形状。此外，由于材料具有脆性而要求其达到一定的厚度或更厚以获得机械强度，所以特别是在用脱氧核糖核酸酶使DNA降解以便从含有DNA和RNA的混合样品中选择性地回收RNA时，存在着例如这样的缺点：为了使脱氧核糖核酸酶在固相上均匀地发生作用，脱氧核糖核酸酶溶液的量必须达到一定的值或更高。由于脱氧核糖核酸酶相对较贵，所以在选择性地回收RNA的情况中，这将成为问题，而据预计，今后回收RNA的需求将会大幅增加。
此外，简单有效地分离和纯化核酸的方法之一是：使用一种使核酸吸附到固相上的溶液和一种使核酸从固相膜解吸附的溶液，所以有这样一种分离和纯化核酸的方法，该方法包括以下步骤：将核酸吸附到固相上以及使核酸从该固相上解吸附，所述固相在其表面上含有带羟基的有机聚合物(参见专利文献JPA-2003-128691和JPA-2004-49108)。但是该方法还需要作更多改进。
其它相关的用于分离和纯化核酸的已知方法的实例是：使用离心作用的方法、使用磁珠的方法和使用滤膜的方法。此外，人们已经提出了使用上述方法的核酸分离纯化装置。例如，有一种使用滤膜的核酸分离纯化装置，其中：把若干带有滤膜的滤管固定在台架上，并把含有核酸的样品溶液注入滤管中，在该装置内，将密封剂施加在台架的底部，并用气囊密封，以便减小内压；同时，从排出侧抽吸含有核酸的样品溶液，使样品溶液从所有滤管中通过，从而将核酸吸附到滤膜上；然后，注入洗涤液、回收液，并在减压条件下再次抽吸，从而也进行了洗涤和解吸附操作。人们已经提出了一种采取上述步骤的自动装置(例如，参见日本专利No.2832586)。
发明内容
然而，在分离和纯化核酸的相关方法中，还没有具体公开从混合物溶液(其中，DNA和RNA以混合状态存在)中高效高精确性地分离和纯化DNA或RNA的方法。
因此，本发明的第一个目的是提供更廉价的、用于从含有RNA和DNA的核酸混合物中选择性地分离和纯化RNA的方法，该方法包括：将试验样品中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上，以及通过洗涤和类似的操作，使RNA解吸附。更具体地说，本发明提供更廉价且在纯度方面优异的方法，用于从DNA和RNA的混合样品中选择性地回收RNA，其中该方法使用的核酸吸附性多孔膜具有优异的分离能力、良好的洗涤效率、简单快速的可使用性和良好的自动操作适用性，并且分离能力基本相同的所述多孔膜能够被批量生产出来。
此外，本发明的第二个目的是提供更廉价的分离和纯化方法，该方法从RNA和DNA的混合样品中选择性地回收RNA或DNA。
为了解决上述第一个问题，本发明人进行了深入的研究。结果，他们发现通过使用选择性地分离和纯化RNA的方法就可以解决上述问题。该方法包括以下步骤：使用核酸分离纯化柱，将含有RNA和DNA的核酸混合物吸附到多孔膜上以及使所述混合物从多孔膜解吸附。其中，所述核酸分离纯化柱包含有具有两个开口的容器，并且所述核酸分离纯化柱在该容器之内容纳有多孔膜。其中，所述方法包括用脱氧核糖核酸酶使多孔膜中的DNA降解的步骤，特别是可以在以下条件下实施该步骤：每1cm2的核酸吸附性多孔膜使用130μL或更少的脱氧核糖核酸酶溶液；由此完成本发明。也就是说，本发明包括以下内容：
(1)一种从含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中选择性地分离和纯化RNA的方法，
该方法使用包含具有至少两个开口的容器的核酸分离纯化柱，并且该柱在所述容器中容纳有溶液能穿过的核酸吸附性多孔膜，
其中，所述方法包括以下步骤：
(1-a)将核酸吸附到所述核酸吸附性多孔膜上；
(1-b)在核酸被吸附在所述核酸吸附性多孔膜上的期间，用洗涤液洗涤所述核酸吸附性多孔膜；
(1-c)对所述核酸吸附性多孔膜进行脱氧核糖核酸酶处理；
(1-d)用洗涤液洗涤所述核酸吸附性多孔膜；以及
(1-e)用回收液使RNA从所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，从而从该柱排出回收液，
其中，在步骤(1-c)中，每1cm2的所述核酸吸附性多孔膜使用总量为130μL或更少的脱氧核糖核酸酶溶液。
(2)如上述(1)所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中脱氧核糖核酸酶溶液中的脱氧核糖核酸酶浓度为10KunitzU/mL到10000Kunitz U/mL。
(3)如上述(1)或(2)所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜包含有机聚合物，核酸通过基本没有离子键参与的微弱的相互作用被吸附到该有机聚合物上。
(4)如上述(3)所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜具有羟基。
(5)如上述(1)到(4)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜包含由乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物经皂化而得到的有机材料。
(6)如上述(1)到(5)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜具有彼此不对称的正面区域和背面区域。
(7)如上述(1)到(6)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸混合物溶液是这样的溶液：该溶液是通过向将核酸溶解试剂加入试验样品中并与该试验样品混合而得到的混合物溶液中，另外再加入水溶性有机溶剂而得到的。
(8)如上述(7)所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述试验样品是培养的细胞。
(9)如上述(8)所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述培养细胞是漂浮型细胞。
(10)如上述(8)所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述培养细胞是粘着型细胞。
(11)如上述(7)所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述试验样品是动物组织。
(12)如上述(7)到(11)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，其中，在加入所述核酸溶解试剂之前或之后，将所述试验样品均化。
(13)如上述(7)到(12)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸溶解试剂包含以下试剂中的至少一种：离液盐、核酸稳定剂、表面活性剂、缓冲液以及消泡剂。
(14)如上述(13)所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述离液盐是盐酸胍和硫氰酸胍中的至少一种。
(15)如上述(7)到(14)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述水溶性有机溶剂包含以下试剂中的至少一种：甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体。
(16)如上述(1)到(15)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述洗涤液是这样的溶液：其包含选自甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体中的至少一种醇，
其中，所述洗涤液所包含的所述至少一种醇其含量为1重量％到100重量％。
(17)如上述(1)到(16)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述回收液是浓度为0.5 mol/L或更低的盐溶液。
(18)如上述(1)到(17)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，压力差产生装置是以可拆装的方式与核酸分离纯化柱的一个开口连接的泵。
(19)一种用于实施上述1到18中的任意一项所述方法的成套用具，该成套用具由核酸分离纯化柱和试剂构成。
(20)一种用于自动实施上述1到18中的任意一项所述方法的装置。
(21)一种用于自动使用如上述19所述的成套用具的装置。
此外，为了解决上述第二个问题，本发明人进行了深入的研究。结果他们发现：在包括以下步骤的分离和纯化核酸的方法中，可以通过使用醇浓度为50重量％或更低的洗涤液来洗脱DNA，从而选择性地分离和纯化RNA或DNA，所述步骤为：将含有RNA和DNA的核酸混合物吸附到多孔膜上以及使该混合物从多孔膜上解吸附，由此完成本发明。此外，在本发明中，通过使用盐浓度为0.5M或更低的溶液作为回收液，可以高纯度高收率地分离和纯化RNA。此外，为了达到本发明的效果，优选使用这样的多孔膜作为本发明中的多孔膜，其中，核酸是通过基本没有离子键参与的微弱的相互作用被吸附到该多孔膜上的。此外，优选使用包含具有两个开口的容器的核酸分离纯化柱，其中，该核酸分离纯化柱在所述容器的内部容纳有包含有机聚合物的多孔膜。也就是说，本发明包括以下内容：
(22)一种选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，该方法包括以下步骤：
(2-a)通过使含有RNA和DNA的核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜，从而将核酸吸附到所述核酸吸附性多孔膜上；
(2-b)在核酸被吸附在所述核酸吸附性多孔膜上的期间，使洗涤液穿过所述核酸吸附性多孔膜，从而对所述核酸吸附性多孔膜进行洗涤；以及
(2-c)通过使回收液穿过所述核酸吸附性多孔膜，从而使核酸从所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，
其中，所述洗涤液包含浓度为50重量％或更低的水溶性有机溶剂，并且所述洗涤液不含离液盐
(23)如上述(22)所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述洗涤液包含浓度为5重量％到40重量％的水溶性有机溶剂。
(24)如上述(22)或(23)所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜是包含有机聚合物的多孔膜，核酸通过基本没有离子键参与的微弱的相互作用被吸附到该有机聚合物上。
(25)如上述(22)到(24)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜是包含带有羟基的有机聚合物的多孔膜。
(26)如上述(22)到(25)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜是这样的多孔膜：其包含由乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物经皂化而得到的有机材料。
(27)如上述(22)到(26)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜具有彼此不对称的正面区域和背面区域。
(28)如上述(22)到(27)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述样品溶液是这样的溶液：该溶液是通过向含有细胞或病毒的试验样品经核酸溶解试剂处理而得到的溶液中，加入水溶性有机溶剂而得到的。
(29)如上述(28)所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述试验样品是培养细胞。
(30)如上述(28)所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述试验样品是动物组织。
(31)如上述(28)到(30)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，在加入所述核酸溶解试剂之前或之后，将所述试验样品均化。
(32)如上述(28)所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述核酸溶解试剂包含以下试剂中的至少一种：离液盐、核酸稳定剂、表面活性剂、缓冲液以及消泡剂。
(33)如上述(32)所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述离液盐是盐酸胍和硫氰酸胍中的至少一种。
(34)如上述(22)到(33)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述水溶性有机溶剂是选自甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体中的至少一种醇。
(35)如上述(22)到(34)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述洗涤液是这样的溶液：其包含选自甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体中的至少一种醇，并且该醇的含量为5重量％到50重量％。
(36)如上述(22)到(35)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述洗涤液包含水溶性盐。
(37)如上述(36)所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述水溶性盐的浓度为10mmol/L或更高。
(38)如上述(36)或(37)所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述水溶性盐的浓度为10mmol/L到1mol/L。
(39)如上述(22)到(38)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述洗涤液是氯化物的含量为10mmol/L到1mol/L的溶液。
(40)如上述(22)到(39)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述回收液是这样的溶液：该溶液能够使被吸附的RNA从所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，并且该溶液的盐浓度为0.5mol/L或更低。
(41)如上述(22)到(40)中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，在步骤(2-a)、(2-b)和(2-c)中的每一步中，通过使用以下装置使所述含有核酸的样品溶液、所述洗涤液和所述回收液穿过所述核酸吸附性多孔膜，所述装置为：
(i)核酸分离纯化柱，该核酸分离纯化柱包含具有至少两个开口的容器，并且该核酸分离纯化柱在所述容器内容纳有溶液能穿过的核酸吸附性多孔膜；以及(ii)压力差产生装置。
其中，所述压力差产生装置是以可拆装的方式与核酸分离纯化柱的一个开口连接的泵。
(42)一种用于实施上述(22)到(41)中的任意一项所述方法的成套用具，该成套用具由核酸分离纯化柱和试剂构成。
(43)一种用于自动实施上述(22)到(41)中的任意一项所述方法的装置。
附图说明
图1是根据实施例1-1以及对比例1-1、1-2和1-3，用1％的琼脂糖凝胶使含有回收核酸的回收液进行电泳而得到的照片。
图2是根据对比例1-2，用1％的琼脂糖凝胶使含有回收核酸的回收液进行电泳而得到的照片。
图3是根据实施例1-1和对比例1-1，用1％的琼脂糖凝胶使含有回收核酸的回收液进行电泳而得到的照片。
图4是根据实施例1-3和对比例1-5，采用MOPS-甲酰胺电泳方法使含有回收核酸的回收液进行电泳而得到的照片。
图5是根据实施例1-4和对比例1-6，用1％的琼脂糖凝胶使含有回收核酸的回收液进行电泳而得到的照片。
图6是根据实施例1-5和对比例1-7、以及实施例1-6和对比例1-8，用1％的琼脂糖凝胶使含有回收核酸的回收液进行电泳而得到的照片。
图7是对经实施例2-2-1和实施例2-2-2纯化的核酸进行1％的琼脂糖凝胶电泳的结果的照片。
RNA表示RNA衍生带；DNA表示DNA衍生带；E10表示实施例1-1：脱氧核糖核酸酶溶液的量为10μL(26μL/cm2)；E20表示实施例1-1：脱氧核糖核酸酶溶液的量为20μL(52μL/cm2)；E40表示实施例1-1：脱氧核糖核酸酶溶液的量为40μL(104μL/cm2)；E80表示参考例1-1：脱氧核糖核酸酶溶液的量为80μL(208μL/cm2)；C1表示对比例1-1：脱氧核糖核酸酶溶液的量为0μL；C2-10表示对比例1-2：脱氧核糖核酸酶溶液的量为10μL(26μL/cm2)；C2-20表示对比例1-2：脱氧核糖核酸酶溶液的量为20μL(52μL/cm2)；C2-80表示对比例1-2：脱氧核糖核酸酶溶液的量为80μL(208μL/cm2)；C3表示对比例1-3：脱氧核糖核酸酶溶液的量为0μL；M表示RNA分子量标记；1表示实施例1-3；2表示对比例1-5；3表示实施例1-4：脱氧核糖核酸酶溶液的量为10μL(26μL/cm2)；4表示对比例1-6：脱氧核糖核酸酶溶液的量为80μL(208μL/cm2)；M2表示1kb Plus梯带；5表示实施例1-5中的小鼠脾脏，其中脱氧核糖核酸酶溶液的量为10μL(26μL/cm2)；6表示对比例1-7的小鼠脾脏，其中脱氧核糖核酸酶溶液的量为80μL(208μL/cm2)；7表示实施例1-6中的小鼠肝脏，其中脱氧核糖核酸酶溶液的量为10μL(26μL/cm2)；8表示对比例1-8中的小鼠肝脏，其中脱氧核糖核酸酶溶液的量为80μL(208μL/cm2)；M3表示1kb Plus梯带。
本发明的最佳实施方式
本发明的选择性地分离和纯化核酸的第一种方法使用包含具有至少两个开口的容器的核酸分离纯化柱，其中，所述核酸分离纯化柱在该容器内容纳有核酸吸附性多孔膜，并且含有DNA和RNA的核酸混合物溶液可以穿过所述多孔膜，该方法包括至少以下步骤：
(1-a)将核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上(以下称为“吸附步骤”)；
(1-b)在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期间，用洗涤液对该膜进行洗涤(以下称为“洗涤步骤1”)；
(1-c)对核酸吸附性多孔膜进行脱氧核糖核酸酶处理(在核酸吸附性多孔膜上进行脱氧核糖核酸酶反应)；
(1-d)使用洗涤液对核酸吸附性多孔膜进行洗涤(以下称为“洗涤步骤2”)；以及
(1-e)用回收液使RNA从核酸吸附性多孔膜的内部解吸附，并由所述柱的容器排出RNA(以下称为“回收步骤”)。
在步骤(1-a)、(1-b)、(1-c)、(1-d)和(1-e)中的每一步中，优选的是，使含有DNA和RNA的核酸混合物溶液、洗涤液、脱氧核糖核酸酶溶液或回收液在加压状态下穿过核酸吸附性多孔膜；更优选的是，向核酸分离纯化柱的第一个开口注入核酸混合物溶液、洗涤液、脱氧核糖核酸酶溶液或回收液，并采用与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接的压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使每一种注入的溶液穿过核酸吸附性多孔膜，并由核酸分离纯化柱的另一个开口排出，其中，该核酸分离纯化柱包含具有至少两个开口的容器，在该容器内容纳有核酸吸附性多孔膜。优选的是，使含有DNA和RNA的核酸混合物溶液、洗涤液、脱氧核糖核酸酶溶液或回收液在加压状态下穿过上述的多孔膜，从而使装置可以实现小型化和自动化。由泵产生的加压状态优选为10kPa到300kPa，并且更优选为40kPa到200kPa。
更优选的是，可以通过使用容纳有上述核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱、以如下步骤来分离和纯化RNA。
即，步骤(1-1)，向包含具有至少两个开口的容器的核酸分离纯化柱的第一个开口注入含有DNA和RNA的核酸混合物溶液，其中，核酸分离纯化柱在所述容器内容纳有核酸吸附性多孔膜，溶液可以穿过该膜；步骤(1-2)，使用压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接，从而使注入的含有DNA和RNA的核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜，并使注入的含有DNA和RNA的核酸混合物溶液从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，由此将核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；步骤(1-3)，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入洗涤液；步骤(1-4)，使用压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接，从而使注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜，并使注入的洗涤液从另一个开口排出，由此在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期间，洗涤该膜；步骤(1-5)，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入脱氧核糖核酸酶溶液，从而对核酸吸附性多孔膜进行脱氧核糖核酸酶处理；步骤(1-6)，使用压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接，从而使注入的脱氧核糖核酸酶溶液穿过核酸吸附性多孔膜，并从另一个开口排出所注入的脱氧核糖核酸酶溶液；步骤(1-7)，向核酸分离纯化柱的第一个开口注入洗涤液；步骤(1-8)，使用压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接，从而使注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜，并使注入的洗涤液从另一个开口排出，由此在RNA被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期间，洗涤该膜；步骤(1-9)，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入回收液；以及步骤(1-10)，使用压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接，从而使注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜，并使注入的回收液从另一个开口排出，并由此使RNA从核酸吸附性多孔膜上解吸附，并且将解吸附的RNA排出核酸分离纯化柱的容器。
在上述的RNA分离和纯化步骤中，从第一次注入核酸混合物溶液到在核酸分离纯化柱外得到RNA，这一过程可以在基本上少于20分钟的时间内结束。在非常充分的条件下，该过程可以在少于2分钟的时间内结束。
此外，在上述RNA的分离和纯化步骤中，可回收得到其纯度与紫外光-可见光分光光度计(260nm/280nm)的吸收度测量值1.8到2.2相对应的RNA。并且可以稳定地得到几乎不含杂质污染物的高纯度RNA。在非常充分的条件下，可回收得到其纯度与紫外光-可见光分光光度计(260nm/280nm)的吸收度测量值约2.0相对应的RNA。
此外，分离和纯化核酸的第二种方法包括至少以下步骤：步骤(2-a)，通过使含有RNA和DNA的核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜，从而将核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；步骤(2-b)，在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期间，通过使洗涤液穿过该膜，从而洗涤核酸吸附性多孔膜；以及步骤(2-c)，通过使回收液穿过核酸吸附性多孔膜，从而使核酸从多孔膜上解吸附。
在步骤(2-a)、(2-b)和(2-c)中的每一步中，优选的是，通过使用压力差产生装置，使含有DNA和RNA的核酸混合物溶液、洗涤液或回收液穿过核酸吸附性多孔膜。在步骤(2-a)、(2-b)和(2-c)中的每一步中，更优选的是，向包含具有至少两个开口的容器的核酸分离纯化柱的第一个开口注入含有核酸的样品溶液、洗涤液或回收液。其中，核酸分离纯化柱在该容器内容纳有核酸吸附性多孔膜，并且使用与所述柱的所述第一个开口连接的压力差产生装置，使所述柱的内部形成加压状态，从而使每一种注入的溶液都穿过核酸吸附性多孔膜，并从另一个开口排出。优选的是，使含有DNA和RNA的核酸混合物溶液、洗涤液或回收液在加压状态下穿过上述多孔膜，从而可以实现装置的小型化和自动化。由泵产生的加压状态优选为10kPa到300kPa，并且更优选为40kPa到200kPa。
更优选的是，可以使用容纳有上述核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱、以如下步骤来分离和纯化RNA和DNA。
即，步骤(2-1)，向包含具有至少两个开口的容器的核酸分离纯化柱的第一个开口注入含有DNA和RNA的核酸混合物溶液。其中，核酸分离纯化柱在所述容器内容纳有核酸吸附性多孔膜，溶液可以穿过该膜；步骤(2-2)，使用压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，该压力差产生装置与分离纯化柱的所述第一个开口连接，从而使所注入的含有DNA和RNA的核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜，并使注入的混合物溶液从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，由此将核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；步骤(2-3)，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入洗涤液；步骤(2-4)，使用压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接，从而使注入的洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜，并使注入的洗涤液从另一个开口排出，由此在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期间，洗涤该膜；步骤(2-5)，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入回收液；以及步骤(2-6)，使用压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接，从而使注入的回收液穿过核酸吸附性多孔膜，并使注入的回收液从另一个开口排出，由此使核酸从核酸吸附性多孔膜上解吸附，并将解吸附的核酸排出核酸分离纯化柱的容器。
在上述的分离和纯化核酸的步骤中，从第一次注入含有核酸的样品溶液到在核酸分离纯化柱外得到核酸，这一过程可以在基本上少于20分钟的时间内结束。在非常充分的条件下，该过程可以在少于2分钟的时间内结束。
此外，在上述分离和纯化核酸的步骤中，可回收这样的核酸：在含有DNA的情况下，可回收得到其纯度与紫外光-可见光分光光度计(260nm/280nm)的吸收度测量值1.6到2.0相对应的核酸；在含有RNA的情况下，可回收得到其纯度与紫外光-可见光分光光度计(260nm/280nm)的吸收度测量值1.8到2.2相对应的核酸。并且可以稳定地得到几乎不含杂质污染物的高纯度核酸。此外，可回收得到紫外光-可见光分光光度计(260nm/280nm)的吸收度测量值为约1.8的DNA和吸收度测量值为约2.0的RNA。
此外，在上述两种方法的步骤中，压力差产生装置的实例包括泵以及类似的能够增大压力的装置(例如注射器、移液管和Perista泵)、或蒸发器以及类似的能够减小压力的装置。在这些装置中，注射器和泵分别适用于手动操作和自动操作。
此外，移液管具有易于单手操作的优点。优选的是，压力差产生装置以可拆装的方式与核酸分离纯化柱的一个开口连接。
此外，在上述两种方法的步骤中，还可以优选进行的操作是，使用压力差产生装置使核酸分离纯化柱的内部形成减压状态，该压力差产生装置与分离纯化柱的另一个开口连接。此外还可以优选进行的操作是，对核酸分离纯化柱进行离心操作。
试验样品与含有DNA和RNA的核酸混合物溶液
本发明所使用的试验样品不受限制，只要试验样品中含有核酸即可，例如，其在诊断领域中包括：作为试验样品收集的体液(例如全血、血浆、血清、尿、排泄物、精液和唾液)，或者植物(或其一部分)、动物(或其一部分)、细菌、病毒、培养的细胞以及由生物材料(例如上述样品的裂解产物和匀浆)制成的溶液。培养细胞包括漂浮型细胞和粘着型细胞。漂浮型细胞是指这样的细胞：其漂浮在培养液中进行生长和增殖，并且不必粘着在容器壁上，例如，举出HL60，U937和HeLaS3等作为代表性的细胞株。粘着型细胞是指粘着在容器的底面上在培养液中进行生长和增殖的细胞。例如，举出NIH3T3、HEK293、HeLa、COS和CHO等作为代表性的细胞株。作为试验样品而使用的动物(或其一部分)可以是其组织。例如，可以使用由动物解剖或活体解剖而得到的组成生物个体的所有组织，例如，肝脏、肾脏、脾脏、脑、心脏、肺或胸腺。
使用含有试剂的水溶液处理这些试验样品。所述试剂能分解细胞膜和核膜，并溶解核酸，所以称之为核酸溶解试剂。由此可以使细胞膜和核膜分解，并且使核酸分散到水溶液中，从而得到核酸混合物溶液。
优选的是，按以下操作步骤得到核酸混合物溶液：
(I)向容器中注入试验样品；
(II)向容器中加入核酸溶解试剂，并由此将试验样品与核酸溶解试剂混合，从而得到混合物溶液；以及
(III)向上述得到的混合物溶液中加入水溶性有机溶剂。
核酸溶解试剂的实例包括选自离液盐(chaotropic salt)、核酸稳定剂、表面活性剂、缓冲液以及消泡剂中的至少一种。
关于离液盐，已知的离液盐都可以使用而不受任何特别限定。例如，可以使用胍盐、异硫氰酸钠、碘化钠和碘化钾。特别优选的是胍盐。胍盐的实例包括盐酸胍、异硫氰酸胍和胍的硫氰酸盐(硫氰酸胍)，并且特别优选的是盐酸胍或胍的硫氰酸盐。这些盐可单独使用，或者两种或多种组合使用。
核酸溶解试剂中的离液盐的浓度优选为0.5mol/L或更高，更优选为0.5mol/L到8mol/L，甚至更优选为1mol/L到6mol/L。
可以使用诸如脲之类的离液物质来代替离液盐。
核酸溶解试剂中优选含有核酸稳定剂。由于核酸稳定剂可以稳定试验样品中的核酸，所以优选使用核酸稳定剂。更优选的是，核酸稳定剂与选自离液盐、表面活性剂、缓冲剂和消泡剂中的任何一个或多个共存。通过如此混合，可以提高最终得到的RNA回收率和回收效率，从而可以使试验样品用量最少化并使操作加速。
关于核酸稳定剂，可举出这样的试剂：其可以发生反应使核酸酶的活性失活。根据试验样品的不同，存在这样的情况：其中含有核酸酶(能够使核酸降解)，结果当核酸被均化时，核酸酶与核酸发生反应，从而导致回收量显著降低。为了达到避免这种情况发生的目的，可以使具有使核酸酶失活的功能的稳定剂与核酸溶解溶液共存。结果，核酸的回收率和回收效率提高，而使得试验样品的用量最少化并使操作加速。
关于具有使核酸酶活性失活的功能的核酸稳定剂，可使用通常被用作还原剂的化合物。还原剂的实例包括：氢化化合物，例如，氢原子、碘化氢、硫化氢、氢化铝锂和硼氢化钠；高正电性金属，例如，碱金属、镁、钙、铝和锌，或它们的汞合金；有机氧化物，例如，醛类、糖类、甲酸和草酸；以及巯基化合物。在这些物质当中，巯基化合物是优选的。巯基化合物的实例包括N-乙酰半胱氨酸、巯基乙醇和烷基硫醇或类似的化合物。巯基化合物可以单独使用或者两种或多种组合使用。
在核酸溶解试剂中，核酸稳定剂的浓度优选为0.1重量％到20重量％，并且更优选为0.3重量％到15重量％。在核酸溶解试剂中，巯基化合物的浓度优选为0.1重量％到20重量％，并且更优选为0.5重量％到15重量％。
表面活性剂(例如)包括非离子型表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂。
在本发明中，可优选使用非离子型表面活性剂和阳离子表面活性剂。
非离子型表面活性剂包括聚氧亚乙基烷基苯基醚类表面活性剂、聚氧亚乙基烃基醚类表面活性剂和脂肪酸烷醇酰胺，并且优选为聚氧亚乙基烃基醚类表面活性剂。在聚氧亚乙基(POE)烃基醚类表面活性剂中，更优选的是，POE癸醚、POE月桂基醚、POE十三烷基醚、POE亚烷基癸醚、POE脱水山梨糖醇单月桂酸酯、POE脱水山梨糖醇单油酸酯、POE脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、四油酸聚氧乙烯山梨糖醇、POE烷基胺和POE炔二醇。
阳离子表面活性剂包括溴化十六烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵和氯化十六烷基吡啶。
这些表面活性剂可以单独使用或者两种或多种组合使用。在核酸溶解试剂中，表面活性剂的浓度优选为0.1重量％到20重量％。
所使用的核酸溶解试剂的pH优选为3到8，其pH更优选为4到7，其pH进一步优选为5到7。
关于缓冲液，可使用常规pH缓冲液(缓冲液)。优选使用生化pH缓冲液。这种缓冲液的实例包括含有以下物质的缓冲液：柠檬酸盐、磷酸盐或乙酸盐、Tris-HCl、TE(Tris-HCl/EDTA)、TBE(三羟甲基氨基甲烷硼酸盐(Tris-Borate)/EDTA)、TAE(三羟甲基氨基甲烷乙酸盐(Tris-Acetate)/EDTA)；以及GUD缓冲液。GUD缓冲液的实例包括MES(2-吗啉代乙磺酸)、Bis-Tris(双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷)、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、PIPES(哌嗪基-1，4-双(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、CAPS(N-环已基-3-氨基丙磺酸)、TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)。
在第一种方法所用的核酸溶解试剂中，上述这些缓冲液的浓度优选为1mmol/L到500mmol/L。在第二种方法所用的核酸溶解试剂中，上述这些缓冲液的浓度也优选为1mmol/L到500mmol/L。
关于消泡剂，可举出如下试剂：硅类消泡剂(例如，硅油、二甲基聚硅氧烷、有机硅乳液、改性聚硅氧烷和有机硅复合物等)、醇类消泡剂(例如，炔二醇、庚醇、乙基己醇、高碳醇和聚氧化亚烷基二醇等)、醚类消泡剂(例如，庚基溶纤剂和壬基溶纤剂-3-庚基山梨糖醇等)、脂肪和油类消泡剂(例如，动物油和植物油等)、脂肪酸类消泡剂(例如，硬脂酸、油酸和棕榈酸等)、金属皂类消泡剂(例如，硬脂酸铝和硬脂酸钙等)、脂肪酸酯类消泡剂(例如，天然蜡和磷酸三丁酯等)、磷酸盐酯类消泡剂(例如，辛基磷酸钠等)、胺类消泡剂(例如，二戊基胺等)、酰胺类消泡剂(例如，硬脂酸酰胺等)和其它消泡剂(例如，硫酸铁和矾土等)。这些消泡剂可以单独使用或者两种或多种组合使用。特别优选的是，将硅类消泡剂和醇类消泡剂这两种化合物组合在一起使用。
在核酸溶解试剂中，消泡剂的浓度优选为0.1重量％到10重量％。
此外，核酸溶解试剂可含有水溶性有机溶剂。水溶性有机溶剂的实例包括丙酮、三氯甲烷、醇类和二甲基甲酰胺。优选的是，使用这些试剂的作用是使核酸溶解试剂中所含的各种试剂的溶解度增加。在这些试剂中，醇类是优选的。关于醇，可使用伯醇、仲醇和叔醇中的任意一种。更优选的是，可使用甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体。这些水溶性有机溶剂可以单独使用或者两种或多种组合使用。在核酸溶解试剂中，这些水溶性有机溶剂的浓度优选为1重量％到20重量％。
优选的是，在加入核酸溶解试剂之前或之后，将试验样品均化。此外，优选的是，将加入核酸溶解试剂后所得到的溶液均化。通过均化，可较好地改善自动化适应性。可通过以下方式进行均化处理，例如，超声波处理、使用尖锐的突出物进行处理、通过高速搅拌进行处理、通过推压使样品穿过微孔进行处理以及使用珠子(例如，玻璃珠、不锈钢珠和二氧化锆珠子)进行处理。
对实施这些处理没有特殊的限定。例如，可使用以下任何器材：混合器(例如，涡流混合器)、匀浆器(例如，转子-定子式匀浆器、Potter匀浆器和Dounce匀浆器)、玻珠研磨机、研杵、弗氏压碎器、研磨机和浆式匀浆器等。当在加入核酸溶解试剂之前、在将试验样品放入液氮之后进行均化时，可使用研钵和研杵、玻珠研磨机、压碎机或粉碎机进行研磨或粉碎。
对均化后的待分析物与核酸溶解试剂所用的混合方法没有特殊的限定。例如，在混合时，使用搅拌器或混合器在30rpm到3000rpm的条件下混合1秒到3分钟是优选的。通过这样混合，可以极大地增加经分离和纯化的RNA或核酸的最终收率。另一方面，翻转混合(rollover-mixing)5到30次也是优选的。此外，移液操作10到50次也可以混匀，在这种情况下，通过简单的操作，就可以提高经分离和纯化的RNA和核酸的最终收率，因此是优选的。
当试验样品是类似于培养的细胞或酵母等时，每10个到1×108个细胞用50μL到1000μL的核酸溶解试剂进行处理是优选的。当试验样品是类似于动物或植物或某生物的组织时，每0.1mg到200mg的组织用50μL到1000μL的核酸溶解试剂进行处理是优选的。在试验样品是细菌的情况下，每0.1mL到10mL的细菌培养物用50μL到1000μL的核酸溶解试剂进行处理是优选的。在不超出柱体积并且达到完全溶解试验样品的条件下，可改变核酸溶解试剂的体积。
向混合物溶液中另外加入水溶性有机溶剂是优选的，所述混合物溶液是通过将核酸溶解试剂加入试验样品中并与试验样品混合而得到的。关于水溶性有机溶剂，使用醇类化合物是优选的，但不限于该类化合物。关于醇类化合物，可使用伯醇、仲醇和叔醇中的任意一种，并且优选使用甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体。这些水溶性有机溶剂可单独使用或者两种或多种组合使用。在核酸溶解试剂中，这些水溶性有机溶剂最终的浓度优选为5重量％到90重量％。
例如，在加入水溶性有机溶剂后进行混合时，优选在以下条件下使用搅拌装置：搅拌速度为30rpm到3000rpm，搅拌时间为1秒到3分钟。通过这样混合，可提高经分离和纯化的RNA或核酸的最终收率。将试管颠倒5到30次也是优选的。此外，移液操作10到50次也可混匀，在这种情况下，通过简单的操作，就可以提高经分离和纯化的RNA和核酸的最终收率，因此是优选的。
此外，优选的是，所得到的核酸混合物溶液的表面张力为0.05J/m2或更低，粘度为1mPa到10000mPa，以及其比重为0.8到1.2。通过使用满足此范围要求的溶液，在使核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜后，可以容易地实施去除核酸混合物溶液废液的操作。将核酸吸附到核酸吸附性多孔膜的步骤(1-a)和(2-a)
(吸附步骤)
以下对本发明所使用的核酸吸附性多孔膜以及将核酸吸附到核酸吸附性多孔膜的步骤(1-a)和(2-a)进行描述。
使用本发明的核酸吸附性多孔膜，其中溶液可从该多孔膜的内部通过。在本文中，“溶液可从其内部通过”是指：当在与多孔膜的一面接触的空间和与该多孔膜的另一面接触的空间之间存在压力差时，溶液可从高压空间向低压空间流动而穿过所述多孔膜；另一方面是指：当向所述多孔膜施加离心力时，溶液可以沿着离心力的方向穿过该多孔膜。
本发明的核酸吸附性多孔膜是通过该膜与核酸之间的相互作用来吸附核酸，其中，基本没有离子键的参与。这意味着在使用多孔膜的情况下，没有发生离子化，因此推测，核酸和多孔膜是通过改变周围的极性来互相吸引的。因此，核酸吸附性多孔膜优选具有优异的分离能力和良好的洗涤效率，并且优选能够分离和纯化核酸。更优选的是，核酸吸附性多孔膜是具有亲水性基团的多孔膜，并且推测，核酸的亲水性基团和多孔膜的亲水性基团通过改变周围的极性而互相吸引。
其中，亲水性基团是指能在其与水之间发生相互作用的极性基团(原子团)，并且与吸附核酸有关的所有基团(原子团)都是合适的。关于亲水性基团，其与水之间相互作用的强度约为中等强度(参见由共立出版株式会社出版的《化学大词典》中所述的术语“亲水性基团”中的“亲水性不太强的基团”)是合适的，其实例包括羟基、羧基、氰基和氧化亚乙基。优选羟基。
其中，具有亲水性基团的多孔膜是指构成多孔膜的材料其本身具有亲水性基团，或者是对构成多孔膜的材料进行处理或涂敷，从而引入亲水性基团。任意一种有机或无机材料都适合于作为构成多孔膜的材料。例如，可使用如下多孔膜：由其本身具有亲水性基团的有机材料构成的多孔膜；通过对构成多孔膜的、且不含亲水性基团的有机材料进行处理，从而向其中引入亲水性基团而得到的多孔膜；通过对构成多孔膜的、且不含亲水性基团的有机材料进行涂敷，从而向其中引入亲水性基团而得到的多孔膜；由其本身具有亲水性基团的无机材料构成的多孔膜；通过对构成多孔膜的、且不含亲水性基团的无机材料进行处理，从而向其中引入亲水性基团而得到的多孔膜；通过对构成多孔膜的、且不含亲水性基团的无机材料进行涂敷，从而向其中引入亲水性基团而得到的多孔膜。然而，为了简化步骤，优选使用有机材料(例如有机聚合物)作为构成多孔膜的材料。
具有亲水性基团的多孔膜材料的实例包括：聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氧乙烯、醋酸纤维素和乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物，所述实例适合于构成多孔膜。但具体而言，可以优选使用由具有羟基的有机材料构成的多孔膜，特别是由具有羟基的有机聚合物构成的多孔膜。
关于由具有羟基的有机材料构成的多孔膜，具有多糖结构的材料是优选的，并且更优选使用由乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物构成的有机聚合物多孔膜。可优选使用的乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合物的实例包括：三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物；三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物；以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。特别是，可以更优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。特别是，三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合比(质量比)优选为99∶1到1∶99，并且更优选为90∶10到50∶50。
更优选的是，具有羟基的有机材料是日本专利申请公开No.2003-128691中披露的醋酸纤维素的皂化反应物。在本文中所使用的醋酸纤维素的皂化反应物是指乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物经过了皂化处理，并且其可优选使用的实例包括：三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化反应物，三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化反应物，三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化反应物，以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化反应物。特别优选的是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化反应物。三醋酸纤维素与二醋酸纤维素的混合比(质量比)优选为99∶1到1∶99，并且更优选为90∶10到50∶50。这样就可以根据表面皂化处理的程度(表面皂化度)来控制多孔膜的表面上的羟基含量(密度)。
为了提高核酸分离的效能，优选的是，使多孔膜的表面上具有含量(密度)更高的羟基。经皂化反应得到的有机材料其皂化度优选为5％到100％，并且更优选为10％到100％。
此外，为了增大其表面上具有羟基的有机聚合物的表面积，优选的是，对醋酸纤维素的表面进行皂化处理。
其正面区域和背面区域彼此对称的多孔膜是合适的，但是可优选使用其正面区域和背面区域不对称的多孔膜。
在本文中，皂化处理是指醋酸纤维素与皂化处理液(例如，氢氧化钠溶液)接触。结果，醋酸纤维素酯衍生物的酯基与皂化处理液接触而被水解，并且引入羟基，从而形成再生纤维素。因此，所制备的再生纤维素与起始纤维素二者在晶形方面是不同的。为了改变表面皂化度，通过改变氢氧化钠的浓度或氢氧化钠的处理时间来实施皂化处理。通过NMR、IR或XPS(例如，检测羧基峰值的减少程度)来确定表面皂化度。
向不含羟基的有机材料的多孔膜引入羟基的方法是把在聚合物主链或侧链上具有羟基的接枝聚合物链键合到多孔膜上。用于将接枝聚合物链键合到多孔膜有机材料中的方法包括以下两种：例如，使接枝聚合物链与多孔膜化学键合的方法；以及使用多孔膜作为起始件，使具有双键(能发生聚合反应)的化合物聚合，从而形成接枝聚合物链的方法。
首先，在多孔膜和接枝聚合物链化学键合的方法中，使用在聚合物的末端或侧链上具有能够与多孔膜发生反应的官能团这样的聚合物，所述聚合物通过其官能团与多孔膜的官能团之间的化学反应而被接枝。对能与多孔膜发生反应的官能团没有特别限定，只要它能与多孔膜的官能团反应即可，并且其实例包括硅烷偶联基(例如烷氧基硅烷)、异氰酸基、氨基、羟基、羧基、磺酸基、磷酸基、环氧基、烯丙基、甲基丙烯酰基和丙烯酰基等。
特别有用的在聚合物末端或侧链上具有反应性官能团的化合物的实例包括：在其末端具有三烷氧基甲硅烷基的聚合物、在其末端具有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具有环氧基的聚合物以及在其末端具有异氰酸基的聚合物。对在此使用的聚合物没有特别限定，只要其具有参与吸附核酸的亲水性基团即可，其示例性的实例包括聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基丙烯酸羟乙酯和它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其盐、聚氧乙烯以及类似物。
通过使用多孔膜作为起始点、使具有可聚合的双键的化合物进行聚合而形成接枝聚合物链的方法通常被称为表面接枝聚合法。表面接枝聚合法是指这样一种方法：其中通过等离子体辐射、光辐射、加热或类似的方法，在基材表面上形成活性部位，从而将与多孔膜接触的、具有双键的可聚合化合物通过聚合反应而连接到多孔膜上。
用于形成与基材相连的接枝聚合物链的化合物必须同时具有可聚合的双键和参与吸附核酸的亲水性基团这两个特征。可以使用具有亲水性基团的聚合物、具有亲水性基团的低聚物和具有亲水性基团的单体中的任何一种作为这种化合物，只要其分子中具有双键即可。特别有用的化合物是具有亲水性基团的单体。
可以用以下单体作为具有亲水性基团的、特别有用的单体的示例性实例。例如，特别适合使用的是丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、单甲基丙烯酸甘油酯以及类似的具有羟基的单体。此外，还适合使用的是丙烯酸、甲基丙烯酸以及类似的具有羧基的单体，或其碱金属盐和胺盐。
关于另一种把亲水性基团引入到由不具有亲水性基团的有机材料构成的多孔膜中的方法，可以用具有亲水性基团的材料进行涂敷。对用于涂敷的材料没有特别限定，只要其具有参与核酸吸附的亲水性基团即可。但是为了易于操作，所述材料优选为有机材料的聚合物。聚合物的实例包括聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基丙烯酸羟乙酯以及它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸以及它们的盐、聚氧乙烯、醋酸纤维素以及乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物，但优选为具有多糖结构的聚合物。
可供选用的另一种方式是：可将醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物涂敷到不具有亲水性基团的有机材料多孔膜上，然后对所涂敷的醋酸纤维素或乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理。在这种情况下，皂化率优选为约至少5％到至多100％，皂化率更优选为约至少10％到至多100％。
关于具有亲水性基团的无机材料的多孔膜，可举例为含有二氧化硅化合物的多孔膜。关于含有二氧化硅化合物的多孔膜，可举例为玻璃滤膜，也可举例为日本专利No.3,058,3442所述的二氧化硅多孔薄膜。这种二氧化硅多孔薄膜可按以下方法制备：把能够形成双分子层的阳离子两性物质的展开液分散到基材上，通过除去液体膜中的溶剂，而在基材上制成两性物质的多层双分子层薄膜，使多层双分子层薄膜与含有二氧化硅化合物的溶液接触，然后取出并移走所述的多层双分子层薄膜。
关于向不具有亲水性基团的无机材料多孔膜引入亲水性基团的方法，存在着如下方法：一种方法是把多孔膜和接枝聚合物链化学键合；以及另一种方法是使用分子内具有双键的、含有亲水性基团的单体，并使用多孔膜作为起始点进行聚合而形成接枝聚合物链。
在通过化学键合作用将多孔膜和接枝聚合物链连接起来时，可向无机材料中引入能够与接枝聚合物链的末端官能团发生反应的官能团，并且使接枝聚合物链被化学键合到该官能团上。此外，当接枝聚合物链是使用分子内具有双键的、含有亲水性基团的单体并使用多孔膜作为起始点而聚合形成的时候，将在具有双键的化合物进行聚合时作为起始点的官能团插入到无机材料中。
关于具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有双键并含有亲水性基团的单体，使用在上述关于向不具有亲水性基团的有机材料多孔膜中引入亲水性基团的方法中所述的具有亲水性基团的接枝聚合物以及分子内具有双键并含有亲水性基团的单体是合适的。
向不具有亲水性基团的无机材料多孔膜中引入亲水性基团的另一种方法是在其上涂敷具有亲水性基团的材料。涂敷所用的材料不受限制，只要其具有参与核酸吸附的羟基即可；但为了易于操作，优选为有机材料的聚合物。聚合物的实例包括聚丙烯酸羟乙酯和聚甲基丙烯酸羟乙酯以及它们的盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯及其盐、聚氧乙烯、醋酸纤维素以及乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物。
对于不含亲水性基团的无机材料多孔膜，将醋酸纤维素或乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合物涂敷于其上，然后可以将经涂敷的醋酸纤维素和乙酰值互不相同的醋酸纤维素混合物皂化。在这种情况下，表面皂化度优选为至少5％到至多100％。表面皂化度更优选为至少10％到至多100％。
不具有亲水性基团的无机材料多孔膜的实例包括：由铝和类似的金属、玻璃、水泥、陶和类似的陶瓷制成的多孔膜，或者由新型陶瓷、硅和活性炭等逐步加工(stepping)而制成的多孔膜。
溶液可从其内部通过、并且其厚度为10μm到500μm的核酸吸附性多孔膜是优选的。更优选的是，核酸吸附性多孔膜的厚度为50μm到250μm。为了容易洗涤，核酸吸附性多孔膜的厚度优选为较薄。
最小孔径为0.22μm或更大的、溶液可从其内部通过的核酸吸附性多孔膜是优选的。更优选的是，核酸吸附性多孔膜的最小孔径为0.5μm或更大。此外，优选使用最大孔径与最小孔径之比为2或更大的多孔膜。结果，可得到足够的用于吸附核酸的表面积，并且孔不容易被堵。最大孔径与最小孔径之比更优选为5或更大。
孔隙率为50％到95％的、溶液可从其内部通过的核酸吸附性多孔膜是优选的；孔隙率更优选为65％到80％。此外，泡点为0.1kgf/cm2到10kgf/cm2的核酸吸附性多孔膜是优选的；泡点更优选为0.2kgf/cm2到4kgf/cm2。
压力损失为0.1kPa到100kPa的、溶液可从其内部通过的核酸吸附性多孔膜是优选的。结果，核酸吸附性多孔膜在加压状态下，可获得均匀的压力。压力损失更优选为0.5kPa到50kPa。在本文中，术语“压力损失”是指水每通过100μm的膜厚所需的最小压力。
溶液可从其内部通过的并且水的渗滤量(水在1kg/cm2的压力、25℃下通过时的渗滤量)为每1分钟每1cm2的膜1mL到5000mL的核酸吸附性多孔膜是优选的。水的渗滤量(水在1kg/cm2的压力、25℃下通过时的渗滤量)更优选为每1分钟每1cm2的膜5mL到1000mL。
溶液可从其内部通过的并且核酸吸附量为每1mg的多孔膜0.1μg或更多的核酸吸附性多孔膜是优选的。核酸吸附量更优选为每1mg的多孔膜0.9μg或更多。
其所含的纤维素衍生物具有下述特征的、可使溶液从其内部通过的核酸吸附性多孔膜是优选的，所述纤维素衍生物的特征为：在将边长为5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内(不含1小时)不溶解，但是在48小时以内(不含48小时)溶解。此外，具有下述特征的纤维素衍生物是优选的，所述特征为：在将边长为5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内(不含1小时)溶解，但是在将所述膜浸在5mL二氯甲烷中时，该纤维素衍生物在24小时以内(不含24小时)不溶解。其中更优选的是这样的纤维素衍生物：在将边长为5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中时，该纤维素衍生物在1小时以内(不含1小时)溶解，但是在将所述膜浸在5mL二氯甲烷中时，该纤维素衍生物在24小时以内(不含24小时)不溶解。
在核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，优选的是，使核酸混合物溶液从多孔膜的一侧流到另一侧，从而使溶液与多孔膜均匀接触。在核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，为了使孔不容易被堵，优选的是，使核酸混合物溶液以从较大孔径向较小孔径的方式穿过核酸吸附性多孔膜。
当核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜时，流速优选为：每单位膜面积(cm2)2μL/秒到1500μL/秒，从而使溶液与多孔膜达到合适的接触时间。如果溶液与多孔膜的接触时间太短，则不能得到充分的分离和纯化的效果；而如果时间太长，则从可操作性来说不是优选的。流速优选为：每单位膜面积(cm2)5μL/秒到700μL/秒。
此外，溶液可从其内部通过的核酸吸附性多孔膜可以以一层的方式被使用，但也可以以多层的方式使用。核酸吸附性多孔膜的多层可以彼此相同或互不相同。
多层核酸吸附性多孔膜可以包含无机材料核酸吸附性多孔膜和有机材料核酸吸附性多孔膜的组合。例如，其可以是玻璃滤膜和再生纤维素多孔膜的组合。此外，多层核酸吸附性多孔膜可以包含无机材料核酸吸附性多孔膜和有机材料核酸吸附性多孔膜的组合，例如，其可以是玻璃滤膜和尼龙(或聚砜)多孔膜的组合。
可优选使用这样的核酸分离纯化柱：该核酸分离纯化柱包含具有至少两个开口的容器，并且核酸分离纯化柱在该容器内容纳有核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可穿过该多孔膜。此外，可优选使用这样的核酸分离纯化柱：该核酸分离纯化柱包含具有至少两个开口的容器，并且核酸分离纯化柱在该容器内容纳有多层核酸吸附性多孔膜，上文所述的溶液可穿过该多孔膜。在这种情况下，具有至少两个开口的、并容纳有多层核酸吸附性多孔膜的容器可彼此相同或互不相同。
除了包含具有至少两个开口的容器以外，核酸分离纯化柱应该不包含其它组件，其中，核酸分离纯化柱在所述容器内容纳有核酸吸附性多孔膜，如上所述，溶液可以穿过该膜。可使用的容器材料的实例包括：塑料，例如，聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚氯乙烯。此外，优选使用可生物降解的材料。此外，容器可以是透明的或有颜色的。
可使用这样的核酸分离纯化柱，该柱具有用于区分各个核酸分离纯化柱的装置。用于区分各个核酸分离纯化柱的装置可包括条形码、二维条形码、磁带和IC卡。
此外，可使用具有这种结构的核酸分离纯化柱，所述结构使得可以很容易地从所述具有至少两个开口的容器中取出核酸吸附性多孔膜。
在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期间，使用洗涤液对该膜进行洗涤的步骤(1-b)和(2-b)
以下描述步骤(1-b)和(2-b)：在核酸被吸附在核酸吸附性多孔膜上的期间，使用洗涤液对该膜进行洗涤。
以下首先描述本发明的第一种方法中的洗涤步骤(1-b)。通过洗涤步骤，使最终获得的RNA的回收率和纯度提高，并且使含有所需RNA的试验样品的用量达到最少。此外，通过自动进行洗涤步骤和回收步骤，可以简单快速地实施所述步骤。为了加快速度，可以通过洗涤一次来完成洗涤步骤。如果纯度更为重要，则优选进行多次洗涤。
在洗涤步骤中，使用试管、移液管、自动注入装置或具有类似功能的供料装置，将洗涤液提供给容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱。将洗涤液从核酸分离纯化柱的第一个开口(含有核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)供入，并且使用与所述第一个开口连接的压力差产生装置(例如，滴液管、注射器、泵和电动移液管等)。由此使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜，并从不同于所述第一个开口的另一个开口排出洗涤液。此外，洗涤液可由第一个开口供入并由该第一开口排出。此外，洗涤液可由不同于所述第一个开口(含有核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)的另一个开口供入，并由该同一开口排出。在这些方式中，非常优选的方式如下：洗涤液由核酸分离纯化柱的第一个开口供入、穿过核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一个开口的另一个开口排出，这是因为该方式具有优异的洗涤效率。
在洗涤操作中，洗涤液的量优选为2μL/mm2或更多。当使用大量的洗涤液时，可改善洗涤效果，但为了保持可操作性并防止样品被排出，其用量优选为200μL/mm2或更少。
在洗涤过程中，在使洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜时，流速优选为：每单位膜面积(cm2)2μL/秒到1500μL/秒，更优选为：每单位膜面积(cm2)5μL/秒到700μL/秒。通常，降低流速以延长时间，从而使洗涤进行得更充分。但是，优选的是，通过使用本发明的上述范围，可以使分离和纯化RNA的步骤快速地实施，而不会降低洗涤效率。
在洗涤步骤中，洗涤液的温度优选为4℃到70℃。此外，更优选的是，洗涤液温度为室温。在进行洗涤步骤的同时可对核酸分离纯化柱通过超声波或机械振动进行搅动。另一方面，可通过实施离心操作来进行洗涤。
在洗涤步骤中，洗涤液优选为这样的溶液：其含有水溶性有机溶液和水溶性盐中的至少一种。洗涤液必须具有的能力是能够洗出核酸混合物溶液中的杂质，该杂质是与核酸一起被吸附到核酸吸附性多孔膜上的。在这一方面，洗涤液必须具有这样的成分：该成分仅使杂质从核酸吸附性多孔膜上解吸附，但不会使核酸解吸附。为达到所述目的，由于核酸极难溶于水溶性有机溶剂(例如醇类)，因此水溶性有机溶剂适合于保留核酸而使其它物质解吸附。此外，加入水溶性盐可以增强核酸的吸附效果，因此可以使除去杂质和不需要物质的操作的选择性得以提高。
关于洗涤液中所含的水溶性有机溶剂，可以使用醇类。醇类的实例包括甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和丁醇。对于丙醇而言，异丙醇和正丙醇中的任何一种都是合适的；对于丁醇而言，直链或支链中的任何一种都是合适的。可以使用所述醇中的两种或多种。在这些醇中，乙醇是优选的。
在洗涤液中，水溶性有机溶剂的量优选为1重量％到100重量％，并且更优选为5重量％到40重量％。在此范围内，DNA污染物不会增多，并且目的RNA不会从多孔膜上解吸附。因此，RNA可以以优选的高纯度和高收率的方式得到。
然而，对于水溶性盐来说，卤化物的盐是优选的，并且在卤化物中，氯化物是优选的。此外，具有单价或二价阳离子的水溶性盐是优选的。特别优选的是碱金属盐和碱土金属盐。在这些金属盐中，钠盐、钾盐和锂盐是优选的，并且钠盐是最优选的。
当洗涤液中含有水溶性盐时，水溶性盐的浓度优选为至少10mmol/L，其上限为不影响杂质溶解性的程度，该浓度优选为0.1mol/L到1mol/L，但该浓度不受此限定。特别是，氯化钠的浓度优选为20mmol/L或更高。
洗涤液的特征是其中不含离液物质。所以，可减少离液物质混入回收步骤(1-e)中的可能性。在离液物质混入回收步骤(1-e)中的情况下，该物质通常会抑制RT-PCR反应或类似的酶反应。因此，考虑到之后的酶反应，理想的情况是洗涤液中不含离液物质。此外，离液物质具有腐蚀性和有害性，鉴于这些性质，为了安全起见，不要求实验人员使用离液物质是特别有利的。
在本文中，离液物质是指上文所述的脲、氯化胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸钠、碘化钠和碘化钾等。
其次，以下描述本发明的第二种方法中的洗涤步骤(2-b)。
根据本发明，洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜，由此将DNA洗脱出来，并且仅使RNA吸附在多孔膜上，因此允许试验样品(其中含有所需核酸)的用量较少。也就是说，当洗涤液被滴加到多孔膜上时，可以将DNA分离出来。
本发明的洗涤液是含有水溶性有机溶剂的水溶液，水溶性有机溶剂的浓度为50重量％或更低，并且其浓度优选为1重量％到50重量％。洗涤液必须具有的能力是能够洗掉样品溶液中的杂质，该杂质是与核酸一起被吸附在核酸吸附性多孔膜上的。在这一方面，洗涤液必须具有这样的成分：该成分仅使杂质从核酸吸附性多孔膜上解吸附，但不会使核酸解吸附。
在洗涤液中水溶性有机溶剂的比例过高的情况下，洗涤步骤不能洗脱出DNA。因此，在回收液回收的RNA溶液中，DNA污染物增加。此外，在洗涤步骤中水溶性有机溶剂太少的情况下，不仅会使DNA从多孔膜上解吸附，还会使RNA从多孔膜上解吸附，这将使回收液中的RNA含量降低。在这一方面，洗涤液中水溶性有机溶剂的含量为50重量％或更低，并且优选为5重量％到40重量％。
例如，洗涤液中含有的水溶性有机溶剂包括醇类，例如，甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇和丁醇。在这些醇中，优选的是乙醇。
本发明的洗涤液还优选含有水溶性盐。关于水溶性盐，诸如卤化物的盐是优选的。并且在这些卤化物中，氯化物是优选的。此外，含有一价阳离子或二价阳离子的水溶性盐是优选的。特别优选的是碱金属盐和碱土金属盐。在这些金属盐中，钠盐、钾盐和锂盐是优选的，并且钠盐是最优选的。
当洗涤液中含有水溶性盐时，水溶性盐的浓度优选为至少10mmol/L，其上限为不影响杂质溶解性的程度，该浓度优选为1mol/L或更少，并且更优选为0.1mol/L，但该浓度不受此限定。更优选的是，水溶性盐为氯化钠，氯化钠的含量为20mmol/L或更高。
此外，洗涤液的特点是其中不含离液物质。所以，可减少洗涤步骤后离液物质被混入回收步骤(2-c)中的可能性。在离液物质混入回收步骤(2-c)中的回收步骤中，该物质有时会抑制PCR反应或类似的酶反应。因此，考虑到之后的酶反应，理想的情况是洗涤液中不含离液物质。此外，离液物质具有腐蚀性和有害性，鉴于这些方面，为了操作的安全性，实验人员在不必要时不使用离液物质是特别有利的。由于洗涤液中不含离液物质，所以可回收得到其纯度与紫外光-可见光分光光度计(260nm/230nm)所测得的吸收度测量值大于1.5相对应的RNA或核酸。此外，可回收得到紫外光-可见光分光光度计(260nm/230nm)吸收度测量值约为2.0的RNA或核酸。
在本文中，离液物质是指上文所述的脲、氯化胍、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、异硫氰酸钠、碘化钠和碘化钾等。
在洗涤步骤中，使用试管、移液管、自动注入装置或具有类似功能的供料装置，将洗涤液提供给容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱。将洗涤液从核酸分离纯化柱的第一个开口(含有核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)供入，并且使用与所述第一个开口连接的压力差产生装置(例如，滴液管、注射器、泵和电动移液管等)。由此使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜，并从不同于所述第一个开口的另一个开口排出洗涤液。此外，洗涤液可由第一个开口供入并由该第一开口排出。此外，洗涤液可由不同于所述第一个开口(含有核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)的另一个开口供入，并由该同一开口排出。在这些方式中，非常优选的方式如下：洗涤液由核酸分离纯化柱的第一个开口供入、穿过核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一个开口的另一个开口排出，这是因为该方式具有优异的洗涤效率。
在洗涤步骤中，洗涤液的量优选为2μL/mm2或更多。当使用大量洗涤液时，可改善洗涤效果，但为了保持可操作性并防止样品被排出，其用量优选为200μL/mm2或更少。
在洗涤操作中，在使洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜时，流速优选为：每单位膜面积(cm2)2μL/秒到1500μL/秒，更优选为5μL/秒到700μL/秒。当洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜的流速被降低时，可进行充分地洗涤。但是，加速核酸分离和纯化的操作是重要的，因此选择上述范围。
在洗涤步骤中，洗涤液的温度优选为4℃到70℃。此外，更优选的是洗涤液的温度为室温。此外，在洗涤步骤中，还可以在通过机械振动和超声波或者通过离心操作来搅动核酸分离纯化柱的条件下进行洗涤。
由于洗涤液对柱或者类似的容器具有高度的润湿性，所以在核酸分离纯化过程中的洗涤步骤期间，洗涤液常常保留在容器中，结果洗涤步骤之后的回收步骤受到洗涤液污染，从而导致核酸纯度降低并使随后步骤中的反应性降低。因此，在本发明的第一种方法和第二种方法中，当使用柱或类似的容器进行核酸的吸附和解吸附时，重要的是，在吸附或洗涤中使用的溶液、特别是洗涤液不能保留在柱内，这样它就不会对以下的步骤产生影响。
因此，为了防止洗涤步骤中使用的洗涤液对随后步骤中使用的回收液造成污染，并由此保持柱内的洗涤液残留量为最小，洗涤液的表面张力小于0.035J/m2是理想的。当表面张力小时，可改善洗涤液对柱的润湿性能并且可控制残留溶液的体积。
然而，为了提高洗涤效率，可增加水的比例，但在这种情况下，洗涤液的表面张力增大并且残留溶液的量增多。当洗涤液的表面张力为0.035J/m2或更大时，可通过增强柱的斥水性从而控制残留溶液的量。通过增强柱的斥水性，而形成液滴，并且可通过液滴的向下流动来控制残留溶液的量。用于增强斥水性的方法的实例包括：在柱表面上涂敷防水剂(例如硅)；在柱成形时，混入防水剂(例如硅)；以及类似的方法，但不限于此。
此外，通过自动进行洗涤和回收操作，可以更容易更快速地进行操作。为了加速操作，可通过洗涤一次来完成洗涤步骤。但是如果纯度更重要，则优选为洗涤数次。
使用本发明的核酸吸附性多孔膜，可以使本发明的第一种方法和第二种方法中的洗涤步骤简化。(1)可使洗涤液穿过核酸吸附性多孔膜的次数减少到一次；(2)可在室温下实施洗涤步骤；(3)在洗涤后，也可以立即将回收液注入到柱内；(4)也可将上述(1)、(2)和(3)中的一个或两个或多个组合起来。在相关方法中，为了快速地除去洗涤液中所含的有机溶剂，经常需要干燥步骤。但是由于本发明中所使用的核酸吸附性多孔膜是薄膜，因此可以省略干燥步骤。
在RNA和核酸的分离和纯化的相关方法中，存在以下的问题：在实施洗涤步骤时，洗涤液经常溅散并附着在其它部位上，从而造成样品玷污(污染)。通过设计核酸分离纯化柱的形状和废水容器的形状，可以抑制洗涤步骤中的这类污染，其中，在所述柱内，核酸吸附性多孔膜被容纳在具有两个开口的容器中。
对核酸吸附性多孔膜进行脱氧核糖核酸酶处理的步骤(1-c)
以下描述对核酸吸附性多孔膜进行脱氧核糖核酸酶处理的步骤(1-c)(使脱氧核糖核酸酶在核酸吸附性多孔膜上发生反应的步骤)。为了从含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中选择性地分离和纯化RNA，使混合物溶液穿过容纳有核酸吸附性多孔膜(核酸被吸附在其上(吸附步骤))的核酸分离纯化柱，然后进行洗涤(洗涤步骤1)，并进行脱氧核糖核酸酶处理的步骤。
对脱氧核糖核酸酶没有特别限定，并可使用任何脱氧核糖核酸酶。例如，可使用来自于动物(例如牛)的胰脱氧核糖核酸酶I、以及重组或合成的脱氧核糖核酸酶。
对于进行脱氧核糖核酸酶处理情况中的脱氧核糖核酸酶溶液(以下也称为脱氧核糖核酸酶反应溶液)，可加入适合于使脱氧核糖核酸酶活化的二价阳离子，例如，Mg2+、Ca2+或Mn2+。为了使RNA或核酸保持吸附在核酸吸附性多孔膜上，一价阳离子(例如，Na+、Li+或K+)可与脱氧核糖核酸酶共存。此外，为了调节脱氧核糖核酸酶反应的pH，优选加入常规缓冲液。该缓冲液的实例包括Tris-HCl、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、磷酸盐、硼酸盐和柠檬酸盐。
在本发明的方法中，对核酸分离纯化柱内容纳的核酸吸附性多孔膜进行脱氧核糖核酸酶处理的步骤在以下条件下实施：每1cm2的核酸吸附性多孔膜使用总量为130μL或更少的脱氧核糖核酸酶溶液。市售可得的(例如)RNeasy Mini Kit(由Qiagen公司制造)需要80μL的脱氧核糖核酸酶溶液(每1cm2的核酸吸附性多孔膜使用208μL的脱氧核糖核酸酶溶液)。因此，本发明可以成本更加有效地进行纯化。此外，在对核酸分离纯化柱内容纳的核酸吸附性多孔膜进行脱氧核糖核酸酶处理的步骤中，脱氧核糖核酸酶的浓度优选为至少10Kunitz U/mL到至多10000Kunitz U/mL，并且更优选为至少50Kunitz U/mL到至多5000Kunitz U/mL。此外，此处使用的表示活性的计量单位Kunitz U被定义为：“1Kunitz U是指在25℃、pH5.0并使用DNA作为底物的条件下，使1mL反应溶液每一分钟的吸收度测量值A260增加0.001这样的脱氧核糖核酸酶活性”。此外，在对核酸分离纯化柱中的核酸吸附性多孔膜进行脱氧核糖核酸酶处理的步骤中，处理时间优选为5秒到360分钟，但这取决于含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中的DNA的量以及处理用脱氧核糖核酸酶的浓度；处理时间更优选为30秒到180分钟。此外，在对核酸分离纯化柱中的核酸吸附性多孔膜进行脱氧核糖核酸酶处理的步骤中，适合的温度为4℃或更高，并且优选的温度为10℃到50℃，为了提高反应效率，较高的温度(例如，50℃到70℃)也是可以的。此外，表达方式“使脱氧核糖核酸酶在核酸吸附性多孔膜上发生作用”是指脱氧核糖核酸酶与核酸吸附性多孔膜上吸附有核酸的部分发生反应，表达方式“在核酸吸附性多孔膜上”不限于仅指在核酸吸附性多孔膜的上面，而且还包括多孔膜的孔内，或者膜背面上的出口处或类似的地方。
使用洗涤液对核酸吸附性多孔膜进行洗涤的步骤(1-d)(洗涤步骤2)
在实施步骤(1-c)之后，使用洗涤液来进行洗涤核酸吸附性多孔膜的步骤(1-d)。根据步骤(1-b)实施步骤(1-d)。可以将步骤(1-d)实施一次或多次。
使用回收液使RNA从核酸吸附性多孔膜上解吸附，并将RNA排出核酸分离纯化柱的容器的步骤(1-e)(回收步骤)
以下描述通过使RNA从核酸吸附性多孔膜上解吸附来回收RNA的过程(1-e)。
在回收过程中，使用试管、移液管、自动注入装置或具有类似功能的供料装置将回收液供给容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱。将回收液由核酸分离纯化柱的第一个开口(含有核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)供入，并且使用与所述第一个开口连接的压力差产生装置(例如，滴液管、注射器、泵和电动移液管等)。由此使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使回收液穿过核酸吸附性多孔膜，并从不同于所述第一个开口的另一个开口排出回收液。此外，回收液可由第一个开口供入并由该第一个开口排出。此外，回收液可由不同于所述第一个开口(含有核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)的另一个开口供入，并由该同一开口排出。在这些方式中，非常优选的方式如下：回收液由核酸分离纯化柱的第一个开口供入、穿过核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一个开口的另一个开口排出，这是因为该方式具有优异的回收效率。
考虑到由试验样品制备的核酸混合物溶液的体积，可通过控制回收液的体积来进行RNA的解吸附。含有经分离和纯化的核酸的回收液的用量与所使用的试验样品的量有关。概括而言，回收液通常的用量为几十微升到几百微升，但是由于试验样品的用量极少，或者另一方面，需要分离和纯化大量的RNA，所以回收液的量可在1微升到几十毫升之间变化。
关于回收液，可优选使用经纯化的蒸馏水、Tris/EDTA缓冲液以及类似的溶液。此外，当将回收的核酸进行RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)时，可使用用于RT-PCR的缓冲液(例如，含有最终浓度为75mmol/L的KCl、50mmol/L的Tris-HCl、3.0mmol/L的MgCl2以及10mmol/L的DDT的水溶液)。
回收液的pH优选为pH1到pH10，更优选为pH2到pH7。特别是离子强度和盐浓度会对被吸附RNA的洗脱产生影响。回收液的离子强度优选为500mmol/L。盐浓度优选为0.5mol/L或更低，盐浓度更优选为0.01mmol/L到50mmol/L。由此使RNA的收率提高，并且可回收大量的RNA。
参照含有核酸的初始样品溶液的体积来减小回收液的体积，可以得到含有浓缩核酸的回收液。优选的是，(回收液的体积)∶(样品溶液的体积)＝1∶100到99∶100，并且更优选的是，(回收液的体积)∶(样品溶液的体积)＝1∶10到9∶10。由此，可以方便地浓缩RNA，而无需在核酸分离纯化之后的步骤中实施浓缩操作。通过这些方法，可提供一种用于得到RNA溶液的方法，该溶液中的RNA浓度比试验样品中的高。
此外，在另一方面，通过在回收液的体积大于含有核酸的初始样品溶液的体积的条件下使RNA解吸附，可得到含有所需浓度的RNA的回收液，并且可得到RNA的浓度适合于下步操作(例如，RT-PCR或类似的操作)的回收液。优选的是，(回收液的体积)∶(样品溶液的体积)＝1∶1到50∶1，并且更优选的是，(回收液的体积)∶(样品溶液的体积)＝1∶1到5∶1。由此可得到这样的优点，即避免在核酸分离纯化之后进行繁琐的浓度调整操作。此外，通过使用足量的回收液，可以使从多孔膜回收的RNA的回收率提高。
并且，通过随着目的不同而改变回收液的温度，可以方便地回收RNA。例如，可以通过将回收液的温度改变为0℃到10℃之后，使RNA从多孔膜上解吸附，由此通过抑制核糖核酸酶的活性，来阻止RNA降解，而不是加入能够抑制酶的降解作用的某种试剂或采取能够抑制酶的降解作用的特殊操作，因此可以方便有效地得到RNA溶液。
此外，在回收液的温度被设定为10℃到35℃时，可在通常的室温条件下进行RNA的回收，并通过使其解吸附来分离和纯化RNA，而无需复杂的步骤。
此外，在另一方面，通过将回收液的温度升高到较高温度(例如，35℃到70℃)，可方便地使RNA从多孔膜上解吸附，并具有高回收率，而无需借助于复杂的操作。
对回收液注入的次数没有限定，注入次数可以是一次或两次或多次。通常，在方便快捷地分离和纯化RNA时，可通过注入一次的回收方式来进行此操作，但是在回收大量RNA时，在某些情况下，回收液可被注入两次或多次。
在回收步骤中，可将RNA回收液配制成在后续步骤中可以使用的组合物。经分离和纯化的RNA有时被应用于RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)方法中。在此情况下，经分离和纯化的RNA溶液必须使用适合于RT-PCR方法的缓冲液来进行稀释。通过在这种方法的回收步骤中使用适合于RT-PCR方法的缓冲液，可方便快捷地转入随后的RT-PCR步骤。
并且，在回收步骤中，可加入用于阻止RNA(被回收在RNA回收液中)降解的稳定剂。作为稳定剂，可加入抗菌剂、杀真菌剂、核酸降解抑制剂以及类似的试剂。作为核酸酶抑制剂，可举例为EDTA及类似的试剂。此外，作为另一个实施方案，可预先向回收容器中加入稳定剂。
并且，对回收步骤中所使用的回收容器没有特别限定，可使用由在260nm处没有吸收的原料制成的回收容器。在此情况下，无需把回收的RNA溶液转移到其它容器就可测量该溶液的浓度。关于在260nm处没有吸收的原料，例如，可使用石英玻璃和类似的原料，但该原料不限于此。
在上述方法中使用的用于选择性地分离和纯化RNA的核酸分离纯化柱以及步骤(1-a)到(1-e)中的每一步所使用的试剂可作为成套用具使用。
如上文所公开，对于通过使用在具有至少两个开口的容器中容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱、以及压力差产生装置，从含有核酸的试验样品中分离和纯化RNA的方法，其中可使用自动装置来实施该方法。所述自动装置可自动进行该方法所包括的步骤。此外，可以使用可自动使用上述成套用具的自动装置来实施所述方法。结果，不仅可使操作简化并加速，而且不管操作者的技能如何，都可以得到特定水平的RNA。
自动装置的实例如下：该装置通过使用核酸吸附性多孔膜被装在容器(该容器具有至少两个开口)中的核酸分离纯化柱以及压力差产生装置从含有核酸的试验样品中自动进行分离和纯化RNA的步骤。但本发明的自动装置不限于此。
如下一种用于选择性地分离和纯化RNA、并自动实施分离和纯化操作的自动装置是优选的，该操作包括以下步骤：使用容纳有核酸吸附性多孔膜(溶液可从其内部通过)的核酸分离纯化柱；将含有DNA和RNA的核酸混合物溶液注入核酸分离纯化柱中，从而通过加压将核酸混合物溶液中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；然后，向核酸分离纯化柱内注入洗涤液，从而通过加压除去杂质；向核酸分离纯化柱内注入脱氧核糖核酸酶，从而对核酸吸附性多孔膜进行脱氧核糖核酸酶处理，并且通过加压使脱氧核糖核酸酶穿过核酸吸附性多孔膜的内部；然后，向核酸分离纯化柱内注入洗涤液，从而通过加压除去DNA的降解产物；然后，向核酸分离纯化柱内注入回收液，从而使被吸附的RNA从核酸吸附性多孔膜上解吸附，并且将解吸附的RNA与回收液一起回收；其中该自动装置包括：支承机构，用于支撑核酸分离纯化柱；废液容器，用于容纳核酸混合物溶液残余物和脱氧核糖核酸酶洗脱液以及洗涤液；以及回收容器，用于容纳含有回收RNA的回收液；压缩空气供给机构，用于将压缩空气引入核酸分离纯化柱；以及注入机构，用于向核酸分离纯化柱内注入洗涤液、脱氧核糖核酸酶和回收液。
所述支承机构优选包括：被安装在主体装置上的立架；承载于立架上并可上下移动的柱支架，该柱支架支承着核酸分离纯化柱；以及用于支承废液容器和回收容器的容器支架，该废液容器和回收容器在柱支架的下方相对于核酸分离纯化柱可互换位置。
所述的压缩空气供给机构优选包括：从下缘部喷射压缩空气的气嘴；压头，用于承载气嘴、并用于使气嘴可以相对于由柱支架支承的核酸分离纯化柱而上下移动；以及位于压头中的定位装置，该定位装置对位于支承机构的台架中的核酸分离纯化柱进行定位。
此外，所述的注入机构优选包括：注入洗涤液的洗涤液注入嘴；注入脱氧核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶注入嘴；注入回收液的回收液注入嘴；注入嘴移动板，该移动板能够在由支承机构支承的核酸分离纯化柱上依次移动并支承洗涤液注入嘴、脱氧核糖核酸酶注入嘴和回收液注入嘴；洗涤液供给泵，用于从容纳有洗涤液的洗涤液瓶子中抽吸洗涤液并把洗涤液供给洗涤液注入嘴；脱氧核糖核酸酶供给泵，用于从容纳有脱氧核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶瓶子中抽吸脱氧核糖核酸酶并把脱氧核糖核酸酶供给脱氧核糖核酸酶注入嘴；以及回收液供给泵，用于从容纳有回收液的回收液瓶子中抽吸回收液并把回收液供给回收液注入嘴。
本发明的自动装置(例如上述自动装置)可以具有紧凑的结构，该自动装置包括：核酸分离纯化柱；支承机构，用于支承废液容器和回收容器；压缩空气供给机构，用于把压缩空气引入核酸分离纯化柱中；以及注入机构，其分别把洗涤液、脱氧核糖核酸酶和回收液注入核酸分离纯化柱中；自动进行以下分离和纯化RNA的步骤的机构，所述步骤为：向容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱内注入含有核酸的核酸混合物溶液，从而通过加压将核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；注入洗涤液，从而除去杂质；向核酸分离纯化柱内注入脱氧核糖核酸酶，从而使脱氧核糖核酸酶在核酸吸附性多孔膜上发生作用，并通过加压使脱氧核糖核酸酶穿过核酸吸附性多孔膜的内部；注入洗涤液，从而通过加压除去DNA的降解产物；注入回收液，从而使被吸附的RNA从核酸吸附性多孔膜上解吸附，并回收解吸附的RNA，该机构可以在短时间内、高效自动地从含有核酸的混合物溶液中分离和纯化RNA。
此外，当支承机构包括立架、柱支架(该柱支架可上下移动，并支承核酸分离纯化柱)以及容器支架(该容器支架支承废液容器和回收容器，并可使所述容器交换位置)时，就可固定核酸分离纯化柱和上述这两个容器，并可使废液容器和回收容器容易地互换。
此外，当压缩空气供给机构包括：气嘴、用于上下移动气嘴的压头以及用于确定核酸分离纯化柱的位置的定位装置时，通过简单的机构就可稳妥地供给压缩空气。
此外，当注入机构包括洗涤液注入嘴、脱氧核糖核酸酶注入嘴、回收液注入嘴、能够在核酸分离纯化柱上依次移动的注入嘴移动板、通过从洗涤液瓶子中抽吸洗涤液从而把洗涤液供给洗涤液注入嘴的洗涤液供给泵以及通过从回收液瓶子中抽吸回收液从而把回收液供给回收液注入嘴的回收液供给泵时，就可以通过简单的机构依次注入洗涤液和回收液。
使用回收液使RNA从核酸吸附性多孔膜上解吸附，以及回收RNA的步骤(2-c)
通过使RNA从核酸吸附性多孔膜上解吸附来回收RNA的步骤(2-c)如下所示。
在回收步骤中，使用试管、移液管、自动注入装置或具有相似功能的供料装置，可将回收液供入容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱中。将回收液由核酸分离纯化柱的第一个开口(含有核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)供入，并且使用与所述第一个开口连接的压力差产生装置(例如，滴液管、注射器、泵和电动移液管等)，由此，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使回收液穿过核酸吸附性多孔膜，并从不同于所述第一个开口的另一个开口排出回收液。此外，回收液可由第一个开口供入并由该第一个开口排出。此外，回收液可由不同于所述第一个开口(含有核酸的核酸混合物溶液已通过该开口注入)的另一个开口供入，并由该同一开口排出。在这些方式中，非常优选的方式如下：回收液由核酸分离纯化柱的第一个开口供入、穿过核酸吸附性多孔膜并由不同于所述第一个开口的另一个开口排出，这是因为该方式具有优异的回收效率。
考虑到由试验样品制备的含有核酸的样品溶液的体积，可通过控制回收液的体积来使核酸解吸附。含有经分离和纯化的核酸的回收液的用量与被回收的试验样品的用量有关。一般情况下，回收液通常的用量为几十微升到几百微升，但是由于试验样品的用量极少，或者另一方面，需要分离和纯化大量的核酸，所以回收液的量可在1微升到几十毫升之间变化。
关于回收液，可优选使用经纯化的蒸馏水、Tris/EDTA缓冲液以及类似的溶液。此外，在使回收的核酸进行PCR(聚合酶链式反应)时，可使用用于PCR的缓冲液(例如，含有最终浓度为50mmol/L的KCl、10mmol/L的Tris-HCl以及1.5mmol/L的MgCl2的水溶液)。
回收液的pH优选为pH2到pH11，更优选为pH5到pH9。此外，回收液的离子强度优选为500mmol/L或更低。更优选的是，盐浓度为50mmol/L到0.1mmol/L。特别是离子强度和盐浓度会对吸附核酸的洗脱产生影响。优选的是，回收液的离子强度为290mmol/L或更低，并且盐浓度为90mmol/L或更低。由此使核酸的回收百分率提高，并且由此可回收大量的核酸。
通过参照含有核酸的初始样品溶液的体积来减小回收液的体，可得到含有浓缩核酸的回收液。优选的是，(回收液的体积)∶(样品溶液的体积)＝1∶100到99∶100，并且更优选的是，(回收液的体积)∶(样品溶液的体积)＝1∶10到9∶10。由此，可以方便地浓缩核酸，而无需在核酸分离纯化之后的步骤中实施浓缩操作。通过这些方法，可提供一种用于得到核酸溶液的方法，该溶液中的核酸浓度比试验样品中的高。
此外，在另一方面，通过在回收液的体积大于含有核酸的初始样品溶液的体积的条件下使核酸解吸附，可得到具有所需浓度的核酸回收液，并且可得到核酸浓度适合于下步操作(例如，PCR或类似的操作)的回收液。优选的是，(回收液的体积)∶(样品溶液的体积)＝1∶1到50∶1，并且更优选的是，(回收液的体积)∶(样品溶液的体积)＝1∶1到5∶1。由此可得到这样的优点，即避免在核酸分离纯化之后进行繁琐的浓度调整操作。此外，通过使用足量的回收液，可以提高从多孔膜回收的核酸的回收率。
此外，通过随着目的不同而改变回收液的温度，可以方便地回收核酸。例如，通过将回收液的温度改变为0℃到10℃之后，使核酸从多孔膜上解吸附，由此通过抑制核酸酶的活性，来阻止核酸降解，而不是通过加入能够抑制酶的降解作用的某种试剂或采取能够抑制酶的降解作用的特殊操作，因此可方便有效地得到核酸溶液。
此外，在回收液的温度被设定为10℃到35℃时，可在通常的室温条件下进行核酸的回收，并通过使核酸解吸附来进行分离和纯化，而无需复杂的步骤。
此外，作为另一种方法，通过将回收液的温度升高到较高温度(例如，35℃到70℃)，可方便地使核酸从多孔膜上解吸附，并具有高回收率，而无需借助于复杂的操作。
对回收液注入的次数没有限定，并且可以注入一次或两次或多次。通常，在方便快捷地分离和纯化核酸时，可通过单一一次的回收来进行此操作，但是在回收大量核酸时，在某些情况下，回收液被注入两次或多次。
在回收步骤中，可将核酸回收液配制成在后续步骤中可以使用的组合物。经分离和纯化的核酸通常使用PCR(聚合酶链式反应)方法扩增。在此情况下，经分离和纯化的核酸溶液必须使用适合于PCR方法的缓冲液来进行稀释。通过在这种方法的回收步骤中使用适合于PCR方法的缓冲液，可以方便快捷地转入随后的PCR步骤中。
并且，在回收步骤中，可加入用于阻止核酸(被回收在核酸回收液中)降解的稳定剂。作为稳定剂，可加入抗菌剂、杀真菌剂、核酸酶抑制剂以及类似的试剂。作为核酸酶抑制剂，可举例出EDTA及类似的试剂。此外，作为另一个实施方案，可预先向回收容器中加入稳定剂。
此外，对回收步骤中所使用的回收容器没有特别限定，可使用由在260nm处没有吸收的原料制成的回收容器。在此情况下，无需把溶液转移到其它容器就可测量回收的核酸溶液的浓度。作为在260nm处没有吸收的原料，例如，可使用石英玻璃和类似的原料，但该原料不限此。
如上文所公开，对于通过使用其中核酸吸附性多孔膜被装在容器(该容器具有至少两个开口)中的核酸分离纯化柱、以及压力差产生装置，来从含有核酸的试验样品中分离和纯化核酸的方法，其中可使用自动装置来实施该方法。所述自动装置可自动进行该方法所包括的步骤。结果，不仅可使操作简化并加速，而且不管操作者的技能如何，都可以得到特定水平的核酸。
自动装置的实例如下：该装置通过使用其中核酸吸附性多孔膜被装在容器(该容器具有至少两个开口)中的核酸分离纯化柱、以及压力差产生装置，而从含有核酸的试验样品中自动进行分离和纯化核酸的步骤。但本发明的自动装置不限于此。
用于选择性地分离和纯化核酸、并自动实施分离和纯化操作的自动装置，其操作包括以下步骤：使用容纳有核酸吸附性多孔膜(溶液可从其内部通过)的核酸分离纯化柱；将含有核酸的核酸混合物溶液注入核酸分离纯化柱中，从而通过加压使核酸混合物溶液中的核酸被吸附到核酸吸附性多孔膜上；然后，向核酸分离纯化柱内注入洗涤液，从而通过加压除去杂质；向核酸分离纯化柱内注入回收液，从而使被吸附的核酸从核酸吸附性多孔膜上解吸附，并且将解吸附的核酸与回收液一起回收；该自动装置的特征在于其包括：支承机构，用于支撑核酸分离纯化柱；废液容器，用于容纳样品溶液的洗脱液和洗涤液；以及回收容器，用于容纳含有回收核酸的回收液；压缩空气供给机构，用于将压缩空气引入核酸分离纯化柱；以及注入机构，用于向核酸分离纯化柱内注入洗涤液和回收液。
实施例
通过以下实施例详细描述本发明，但本发明不限于以下实施例。
实施例1
(1-1)核酸分离纯化柱的制备
制备核酸分离纯化柱，该柱具有容纳核酸吸附性多孔膜的部分(内径为7mm)。
(1-2)关于核酸吸附性多孔膜，使用经皂化的三醋酸纤维素多孔膜，并且将核酸吸附性多孔膜装在如上述(1-1)中制备的核酸分离纯化柱的核酸吸附性多孔膜的容纳部分中。
实施例1-1
(1-3)核酸溶解试剂、洗涤液和回收液的制备
根据以下所示的配方，制备核酸溶解试剂A-1、洗涤液A-1和回收液A-1。
(核酸溶解试剂A-1)
盐酸胍(由Life Technologies公司生产)    382g
Tris(由Life Technologies公司生产)      12.1g
TritonX-100(由ICN生物化学公司生产)    10g
蒸馏水                                定容到1000ml
在使用核酸溶解试剂A-1之前，即刻加入1.0体积％的2-巯基乙醇。
(洗涤液A-1)
10mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)             30体积％的乙醇
(回收液A-1)
1mmol/L Tris-HCl(pH 6.5)
(1-4)核酸混合物溶液的制备
在3 7℃下、在5％CO2的存在下对人急性早幼粒白血病细胞(HL60)培养液(RPMI1640-10％胎牛血清)进行温育。将细胞制成含有1×106个细胞时，用不含Ca2+和Mg2+的PBS溶液洗涤。将制备的300g细胞在4℃下使用水平转子(swing rotor)离心5分钟，使飘浮细胞沉淀，并除去上清液。通过轻叩而使细胞悬浮，向其中加入350μL的核酸溶解试剂A-1，并使用涡流混合器搅拌1分钟。然后，向其中加入350μL的70体积％的乙醇，并使用涡流混合器搅拌5秒种，由此得到实施例1-1使用的核酸混合物溶液。
(1-5)分离和纯化RNA的操作
将由上述(1-4)得到的核酸混合物溶液注入容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱(由(1-1)和(1-2)制备)的第一个开口中，然后将压力差产生装置(注射器泵)与所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(260kPa)，通过使所注入的核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜，从而使注入的核酸混合物溶液与核酸吸附性多孔膜接触，并由另一个开口排出所述溶液。在取下压力差产生装置后，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入500μL的洗涤液A-1，然后将压力差产生装置(注射器泵)与所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(260kPa)，从而使注入的洗涤液A-1穿过核酸吸附性多孔膜，并由另一个开口排出所述溶液(洗涤步骤1)。在取下压力差产生装置后，将10μL(26μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液(使用由Qiagen公司生产的RNase-Free DNaseSet341Kunitz U/mL，并根据其附带的使用说明制成脱氧核糖核酸酶溶液)施加到多孔膜上，并让酶作用15分钟。以相同的方式重复2次洗涤操作(洗涤步骤2)。此外，在取下压力差产生装置后，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入100μL的回收液A-1，并将压力差产生装置(注射器泵)与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(260kPa)，从而使注入的回收液A-1穿过核酸吸附性多孔膜，并由另一个开口排出所述溶液，由此回收洗脱液。
此外，以相同的方式实施分离和纯化RNA的操作，但是将脱氧核糖核酸酶溶液的量由10μL改变为20μL和40μL。此外，作为参考例，以相同的方式实施分离和纯化RNA的操作，但是将脱氧核糖核酸酶溶液的量由10μL改变为80μL。
对比例1-1
除了不施加脱氧核糖核酸酶溶液以外，以与实施例1-1相同的操作方式来提取RNA。在这种情况下，关于洗涤步骤，仅将洗涤步骤1以相同的方式重复3次，这与实施例1-1中洗涤步骤1和2总共重复3次不同。
对比例1-2
按照与使用由Qiagen公司生产的RNeasy Mini Kit的试剂盒所述同样的程序，以与实施例1-1相同的操作方式从培养细胞(1×106个)中提取RNA。根据以下3种方案来采用脱氧核糖核酸酶溶液的用量，所述方案为：80μL(208μL/cm2)、以及20μL(52μL/cm2)和10μL(26μL/cm2)。
对比例1-3
除了不施加脱氧核糖核酸酶溶液以外，以与对比例1-2相同的操作方式来提取RNA。此时，根据不进行脱氧核糖核酸酶处理的RNeasy Mini Kit的方案来实施所述操作。
(1-6)回收核酸的琼脂糖凝胶电泳
图1到图3显示了根据实施例1-1和对比例1-1、1-2和1-3，使用1％的琼脂糖凝胶使含有回收核酸的回收液进行电泳的结果。
在对比例1-2中，需要80μL(208μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液。但在实施例1-1中，即使脱氧核糖核酸酶溶液的用量比对比例1-2中的少，也可以使DNA降解。并且在实施例1-1中没有检测到对比例1-1中所检测到的DNA衍生带。令人惊奇的是，在使用仅为10μL(26μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液的情况下，本发明也可以使DNA降解。
由上述结果发现：在本发明中，即使脱氧核糖核酸酶溶液的用量很少，也可以通过使含有DNA和RNA的混合物溶液中的DNA降解来选择性地回收RNA。
实施例1-2
使用Hela细胞作为粘着型细胞，通过如下的在盘(on-dish)溶解法得到核酸混合物溶液。
在培养细胞用的平板上，在37℃下、在5％CO2的存在下，在培养液(MEM-10％胎牛血清)中温育Hela细胞。在从培养细胞用的平板上除去培养液后，每1.5×106个Hela细胞加入350μL的核酸溶解试剂A-1，以得到细胞被溶解的溶液。通过移液操作搅动该溶液，并将该溶液回收到另一个容器中。
向所得的回收溶液中加入350μL的70体积％乙醇。并使用涡流混合器进行搅拌，从而得到核酸混合物溶液。对得到的核酸混合物溶液实施分离和纯化RNA的操作，该操作与实施例1-1中的(1-5)相同。此外，在分离和纯化RNA的操作中，脱氧核糖核酸酶溶液的用量为10μL。
实施例1-3
使用Hela细胞作为粘着型细胞，在按如下方式进行胰蛋白酶消化后，得到核酸混合物溶液。
在温育粘着型细胞用的容器上，在37℃下、在5％CO2的存在下，在培养液(MEM-10％胎牛血清)中温育Hela细胞。在从容器中除去培养液后，加入0.25％的胰蛋白酶进行处理，从而使粘着型细胞呈片状从细胞培养容器上剥落下来，并计数细胞数目。使用用于离心细胞的离心机，使混合物在1000转下离心3分钟，由此除去上清液以收集Hela细胞。离心后，向每5×105个细胞中加入350μL核酸溶解试剂A-1。使用涡流混合器强力搅拌该溶液达1分钟，以便溶解细胞。向所述溶液中加入350μL的70体积％乙醇，并使用涡流混合器搅拌5秒钟，以得到核酸混合物溶液。对得到的核酸混合物溶液实施分离和纯化RNA的操作，该操作与实施例1-1中的(1-5)相同。此外，在分离和纯化RNA的操作过程中所使用的脱氧核糖核酸酶溶液的量为10μL。
对比例1-4
使用市售的RNeasy Mini Kit(由Qiagen公司生产)试剂盒，根据与该试剂盒所述相同的操作程序，进行从实施例1-2的核酸混合物溶液中分离和纯化RNA的操作。此外，在分离和纯化RNA的操作过程中，使用80μL的脱氧核糖核酸酶溶液。
对比例1-5
使用实施例1-3中的核酸混合物溶液，以与对比例1-4相同的操作方式来实施分离和纯化RNA的操作过程。
对实施例1-2和实施例1-3，以及对比例1-4和对比例1-5中的含有回收核酸的回收液中的RNA回收量进行测量。使用260nm波长处的吸收度进行测量。结果显示在表1-1中。
表1-1
        实施例         对比例
序号 RNA的回收量(μg) 序号 RNA的回收量(μg)
在盘溶解法(1.5×106) 实施例1-2 28.9 对比例1-4 24.2
胰酶消化方法(5×105) 实施例1-3 13.5 对比例1-5 11.9
然后，使用MOPS-甲酰胺电泳，使实施例1-3和对比例1-5中的含有回收核酸的回收液进行电泳。结果显示在图4中。
在图4中，与泳道2所代表的使用市售可得的纯化用试剂盒的对比例1-5比较，对实施例1-3中的回收核酸进行电泳而得到的泳道1具有其纯度和对比例1-5中的相同、但却没有RNA降解物的高质量RNA。
此外，如表1-2所示，与使用市售可得的试剂盒的对比例比较而言，使用本发明的选择性地分离和纯化RNA的方法的实施例，其得到的RNA的质量与之相同，但回收量更大。
实施例1-4
(1-7)核酸溶解试剂B-1(B-1-1和B-1-2)、洗涤液B-1以及回收液B-1的制备
根据以下所示的配方，制备核酸溶解试剂、洗涤液和回收液。
(核酸溶解试剂B-1-1)
硫氰酸胍(由和光纯药工业株式会社生产)       3.5mol/L
BisTris(由日本株式会社同仁化学研究所生产)  0.25mol/L
使用盐酸制成pH6.5的溶液
在使用核酸溶解试剂B-1-1之前，加入1.0体积％的2-巯基乙醇。
(核酸溶解试剂B-1-2)
土温20(由和光纯药工业株式会社生产)           15重量％
BisTris(由日本株式会社同仁化学研究所生产)    0.1mol/L
使用盐酸制成pH6.0的溶液
(洗涤液B-1)
Tris-HCl(pH7.5)                              10mmol/L
氯化钠                                       0.5mol/L
乙醇                                         10体积％
(回收液B-1)
Tris-HCl(pH6.5)                              1mmol/L
(1-8)核酸混合物溶液的制备
将在液氮条件下速冻的小鼠肝脏切成小块，并取5mg在1.5ml的试管中温育。向试管中加入350μL的核酸溶解试剂B-1-1，并将其放入转子-定子匀浆器(商品名为Polytron，由KINEMATICA公司制造)中，直到混合物变均匀。然后在室温下，将溶液在8000×g的条件下离心3分钟。并将上清液转移到一个新的1.5ml试管中(尽量不带组织碎片)。向上清液中加入175μL的核酸溶解试剂B-1-2，并使用涡流混合器搅拌15秒钟。此外，将175μL的99.5体积％或更高纯度的乙醇加入其中，并使用涡流混合器搅拌1分钟。
(1-9)分离和纯化RNA的操作
将由上述(1-8)得到的核酸混合物溶液注入包括核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱(如上述(1-1)和(1-2)所述)中，然后将压力差产生装置(注射器泵)与该柱的第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(260kPa)，通过使所注入的核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜，从而使核酸混合物溶液与核酸吸附性多孔膜接触，并从另一个开口排出所述溶液。此外，在取下压力差产生装置后，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入500μL的洗涤液B-1，然后将压力差产生装置(注射器泵)与该柱的所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(120kPa)，从而使注入的洗涤液B-1穿过核酸吸附性多孔膜，并从另一个开口排出所述溶液(洗涤步骤1)。在取下压力差产生装置后，将10μL(26μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液(使用由Promega公司生产的RQ1 RNase-FreeDNase 500 Kunitz U/mL，该反应溶液中含有40mM的Tris-HCl(pH8.0)、5mM的HEPES、10mM的MgSO4、5mM的MgCl2、6mM的CaCl2，以及25％的甘油)施加到所述多孔膜上，并让酶作用5分钟。洗涤操作(洗涤步骤2)以相同的方式重复两次。此外，在取下压力差产生装置后，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入100μL的回收液B-1，并且将压力差产生装置(注射器泵)与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(120kPa)，从而使注入的回收液B-1穿过核酸吸附性多孔膜，并从另一个开口排出所述溶液，由此回收洗脱液。
对比例1-6
使用RNeasy Mini Kit(由Qiagen公司生产)试剂盒，按照与该试剂盒所述相同的操作程序，利用步骤(1-8)中的小鼠肝脏来进行RNA的提取。根据该方案，脱氧核糖核酸酶溶液的用量为80μL(208μL/cm2)。
对实施例1-4和对比例1-6中得到的含有回收核酸的回收液测量RNA的回收量。使用在260nm波长处的吸收度进行测量。结果显示在表1-2中。
表1-2
    RNA的回收量(μg)
    实施例1-4     21.6
    对比例1-6     18.8
使用1％琼脂糖电泳，使含有实施例1-4和对比例1-6中的回收核酸的回收液进行电泳。结果显示在图5中。
在图5所示的电泳结果中，泳道4所代表的对比例1-6需要80μL(208μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液，但泳道3所代表的实施例1-4表明，使用仅为10μL(26μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液就使DNA降解了。与对比例1-6比较而言，实施例1-4得到了纯度与之相同的、但是却没有RNA降解物的高质量RNA。
此外，根据表1-2，与使用市售可得的纯化用试剂盒的对比例比较而言，使用本发明的选择性地分离和纯化RNA的方法的实施例得到了质量与之相同而回收量更大的RNA。
由上所述，可以发现，即使在使用动物组织作为试验样品的情况下，使用少量脱氧核糖核酸酶溶液也可以使含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中的DNA降解，由此选择性地回收RNA。
实施例1-5
(1-10)核酸混合物溶液的制备
将在液氮条件下速冻的小鼠脾脏切成小块，并取10mg在2ml的Safe Lock试管(由Eppendorf公司制造)中进行温育。向试管中加入350μL的核酸溶解试剂B-1-1以及直径为5mm的二氧化锆小球。使用被设定为20Hz的TissueLyzer匀浆器(由Qiagen公司制造)均化3分钟，共进行两次，使所述溶液均匀化。在室温下，将该溶液在8000×g的条件下离心3分钟。并将上清液转移到一个新的1.5ml试管中(尽量不带组织碎片)。向上清液中加入175μL的核酸溶解试剂B-1-2，并使用涡流混合器搅拌15秒钟。此外，将175μL的99.5体积％或更高纯度的乙醇加入其中，并使用涡流混合器搅拌1分钟。
(1-11)分离和纯化RNA的操作
以与(1-9)相同的操作方式来回收RNA。以相同的方式，将10μL(26μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液(使用由Promega公司生产的RQ1 RNase-Free DNase 500 Kunitz U/mL)施加到所述膜上。
对比例1-7
使用RNeasy Mini Kit(由Qiagen公司生产)试剂盒，按照与该试剂盒所述相同的操作程序，利用与步骤(1-10)相同的小鼠脾脏的均化方式来实施RNA的提取。根据该方案，使用80μL(2081μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液。
使用1％琼脂糖电泳，使含有实施例1-5和对比例1-7中的回收核酸的回收液进行电泳。结果显示在图6中。
在图6的电泳结果中，泳道6代表使用80μL(208μL/cm2)脱氧核糖核酸酶溶液的对比例1-7，其中条带很微弱而且可识别出基因组DNA条带，然而由泳道5所代表的实施例1-5表明，使用仅为10μL(26μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液就使DNA降解了。与对比例1-7比较而言，在使用少量脱氧核糖核酸酶溶液的实施例1-5中，RNA的回收纯度更令人满意。
实施例1-6
(1-12)核酸混合物溶液的制备
将在液氮条件下速冻的小鼠肝脏切成小块，并取5mg温育在1.5ml的试管中。向试管中加入350μL的核酸溶解试剂B-1-1，并通过与专用马达相连的PELLET PESTLES(由Kimble/Kontes公司制造)对上述溶液进行均化。在室温下，将该溶液在8000×g的条件下离心3分钟，并将上清液转移到一个新的1.5ml试管中(尽量不带组织碎片)。向上清液中加入175μL的核酸溶解试剂B-1-2，并使用涡流混合器搅拌15秒钟。此外，将175μL的99.5％或更高纯度的乙醇加入其中，并使用涡流混合器搅拌1分钟。
(1-13)分离和纯化RNA的操作
以与(1-9)相同的操作方式来回收RNA。以相同的方式，将10μL(26μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液(使用由Promega公司生产的RQ1 RNase-Free DNase 500 Kunitz U/mL)施加到所述膜上。
对比例1-8
使用RNeasy Mini Kit(由Qiagen公司生产)试剂盒，按照与该试剂盒所述相同的操作程序，利用与步骤(1-12)相同的小鼠肝脏的均化方式来实施RNA的提取。根据该方案，使用80μL(208μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液。
使用1％琼脂糖电泳，使含有实施例1-6和对比例1-8中的回收核酸的回收液进行电泳。结果显示在图6中。
在图6的电泳结果中，泳道8代表的对比例1-8需要80μL(208μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液，但泳道7所代表的实施例1-6表明，使用仅为10μL(26μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液就使DNA降解了。与对比例1-8比较，实施例1-6得到了纯度与之相同但却没有RNA降解物的高质量RNA。
实施例1-7
(1-14)核酸混合物溶液的制备
将在液氮条件下速冻的小鼠肝脏切成小块，并取10mg在2ml的Safe Lock试管(由Eppendorf公司制造)中进行温育。向试管中加入350μL如表1-3所示的核酸溶解试剂X，此外还加入直径为5mm的二氧化锆小球。使用被设定为20Hz的TissueLyzer匀浆器(由Qiagen公司制造)均化3分钟，共进行两次。然后在室温下，将该溶液在10000×g的条件下离心3分钟。并将上清液转移到一个新的1.5ml试管中(尽量不带组织碎片)。向上清液中加入如表1-3所示的核酸溶解试剂Y，并使用涡流混合器搅拌15秒钟。此外，将具有如表1-3所示浓度的高纯度乙醇加入其中，并使用涡流混合器搅拌1分钟。
表1-3
样品 核酸溶解试剂X(含有1.0体积％的2-巯基乙醇) 核酸溶解试剂Y 高纯度乙醇(体积％：μL)
 A 由Qiagen公司生产的RLT 无 70体积％：350μL
 B 由Qiagen公司生产的RLT 无 70体积％：350μL
 C 由Qiagen公司生产的RLT 无 70体积％：350μL
 D 由Qiagen公司生产的RLT 无 70体积％：350μL
E 由Qiagen公司生产的RLT 核酸溶解试剂B-1-2：175μL 99.5体积％：175μL
F 由Qiagen公司生产的RLT 核酸溶解试剂B-1-2：175μL 99.5体积％：175μL
G 由Qiagen公司生产的RLT 核酸溶解试剂B-1-2：175μL 99.5体积％：175μL
H 由Qiagen公司生产的RLT 核酸溶解试剂B-1-2：175μL 99.5体积％：175μL
 I 核酸溶解试剂B-1-1 无 70体积％：350μL
 J 核酸溶解试剂B-1-1 无 70体积％：350μL
 K 核酸溶解试剂B-1-1 无 70体积％：350μL
 L 核酸溶解试剂B-1-1 无 70体积％：350μL
M 核酸溶解试剂B-1-1 核酸溶解试剂B-1-2：175μL 99.5体积％：175μL
N 核酸溶解试剂B-1-1 核酸溶解试剂B-1-2：175μL 99.5体积％：175μL
O 核酸溶解试剂B-1-1 核酸溶解试剂B-1-2：175μL 99.5体积％：175μL
P 核酸溶解试剂B-1-1 核酸溶解试剂B-1-2：175μL 99.5体积％：175μL
“由Qiagen公司生产的RLT”表示使用由Qiagen公司生产的RNeasy Mini Kit RLT溶液。
(1-15)分离和纯化RNA的操作
将由上述(1-14)得到的核酸混合物溶液注入到包括核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱(如上述(1-1)和(1-2)所述)中，然后将压力差产生装置(注射器泵)与该柱的第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(120kPa)，通过使所注入的核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜，从而使注入的核酸混合物溶液与核酸吸附性多孔膜接触，并从另一个开口排出所述溶液。此外，在取下压力差产生装置后，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入750μL如表1-4所示的洗涤液X，然后将压力差产生装置(注射器泵)与该柱的所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(120kPa)，从而使注入的洗涤液X穿过核酸吸附性多孔膜，并从另一个开口排出所述溶液(洗涤步骤1)。在取下压力差产生装置后，将40μL(104μL/cm2)的脱氧核糖核酸酶溶液(使用由Qiagen公司生产的RNase-Free DNase Set 341 Kunitz U/mL)施加到所述多孔膜上。使用洗涤液Y重复进行两次洗涤操作(洗涤步骤2)。此外，在取下压力差产生装置后，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入100μL如表1-4所示的回收液X，并且将压力差产生装置(注射器泵)与核酸分离纯化柱的所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态(120kPa)，从而使注入的回收液X穿过核酸吸附性多孔膜，并从另一个开口排出所述溶液，由此回收洗脱液。
表1-4
  样品 洗涤液X 洗涤液Y 回收液X
A 由Qiagen公司生产的RW1   由Qiagen公司生产的RPE   不含核糖核酸酶的水
B 由Qiagen公司生产的RPE   由Qiagen公司生产的RPE   不含核糖核酸酶的水
C 由Qiagen公司生产的RW1 洗涤液B-1   不含核糖核酸酶的水
D 洗涤液B-1 洗涤液B-1   不含核糖核酸酶的水
E 由Qiagen公司生产的RW1   由Qiagen公司生产的RPE   不含核糖核酸酶的水
F 由Qiagen公司生产的RPE   由Qiagen公司生产的RPE   不含核糖核酸酶的水
G 由Qiagen公司生产的RW1 洗涤液B-1   不含核糖核酸酶的水
H 洗涤液B-1 洗涤液B-1   不含核糖核酸酶的水
I 由Qiagen公司生产的RW1   由Qiagen公司生产的RPE   不含核糖核酸酶的水
J 由Qiagen公司生产的RPE   由Qiagen公司生产的RPE   不含核糖核酸酶的水
K 由Qiagen公司生产的RW1 洗涤液B-1   不含核糖核酸酶的水
L 洗涤液B-1 洗涤液B-1   不含核糖核酸酶的水
M 由Qiagen公司生产的RW1   由Qiagen公司生产的RPE   不含核糖核酸酶的水
N 由Qiagen公司生产的RPE   由Qiagen公司生产的RPE   不含核糖核酸酶的水
O 由Qiagen公司生产的RW1 洗涤液B-1   不含核糖核酸酶的水
P 洗涤液B-1 洗涤液B-1   不含核糖核酸酶的水
“由Qiagen公司生产的RW1”表示使用由Qiagen公司生产的RNeasy Mini Kit RW1溶液。
“由Qiagen公司生产的RPE”表示使用由Qiagen公司生产的RNeasy Mini Kit RPE溶液。
“不含核糖核酸酶的水”表示使用由Qiagen公司生产的RNeasyMini Kit RW1中的RNase-Free水。
实施例1-7中回收的RNA的回收量显示在表1-5中。
表1-5
    样品     RNA的回收量(μg)
    A     12.3
    B     13.0
    C     15.5
    D     17.1
    E     20.2
    F     21.3
    G     20.8
    H     23.5
    I     12.2
    J     11.3
    K     13.6
    L     13.1
    M     22.0
    N     23.3
    O     21.5
    P     24.3
由实施例1-7的结果证明，通过使用40μL(104μL/cm2)脱氧核糖核酸酶溶液，即使在上述核酸溶解试剂、洗涤液和回收液的任意组合的情况下，也可有效地回收全部RNA。
实施例2
(2-1)核酸分离纯化柱的制备
制备核酸分离纯化柱，该柱具有容纳核酸吸附性多孔膜的部分(内径为7mm)。
(2-2)使用经皂化的三醋酸纤维素多孔膜作为核酸吸附性多孔膜，并且将核酸吸附性多孔膜装在如上述(2-1)中制备的核酸分离纯化柱的核酸吸附性多孔膜的容纳部分中。
实施例2-1
(2-3)核酸溶解试剂和洗涤液的制备
根据以下所示的配方，制备核酸溶解试剂和洗涤液。
(核酸溶解试剂A-2)
盐酸胍(由Life Technology公司生产)    382g
Tris(由Life Technology公司生产)      12.1g
Triton X-100(由ICN生物化学公司生产)  10g
蒸馏水                               定容到1000ml
在使用核酸溶解试剂A-2之前，即刻加入1.0体积％的2-巯基乙醇。
(洗涤液A-2)
10mM Tris-HCl                        20％到50％的乙醇
(2-4)纯化核酸的操作
制备人骨髓白血病细胞(HL60)的培养液。将细胞制备成含有1×106个细胞，并用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤。使用水平转子将所制备的300g细胞在4℃下离心5分钟，使飘浮细胞沉淀，除去上清液，通过轻叩而使细胞悬浮。向上清液中加入350μL的核酸溶解试剂，并使用涡流混合器搅拌1分钟。然后，向其中加入350μL的70％的乙醇，并使用涡流混合器搅拌5秒种。搅拌后，将所述溶液注入容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱(由上述(2-1)和(2-2)制各)的第一个开口中，然后将压力差产生装置(注射器泵)与所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，通过使所注入的含有核酸样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜，从而使注入的含有核酸样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触，并由核酸分离纯化柱的另一个开口排出所述溶液。然后，将500μL含有20％到50％乙醇的洗涤液A-2由核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入，随后将压力差产生装置与所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使注入的洗涤液A-2穿过核酸吸附性多孔膜，并由另一个开口排出所述溶液。该操作被重复3次。此外，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注入100μL的回收液A-2，然后将压力差产生装置与该柱的所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使注入的回收液A-2穿过核酸吸附性多孔膜，并由另一个开口排出所述溶液，由此回收洗脱液。
(实施例和对比例)
除了洗涤液中的乙醇浓度如表2-1和2-2所示(Trix-HCl的浓度是固定的)以外，在与上述相同的条件下实施每一步操作。
(2-5)被回收核酸的琼脂糖凝胶电泳
在由上述每一种试剂回收得到的洗涤液和回收液中，由1％琼脂糖凝胶电泳来计算它们的荧光强度，就得到其中的核酸含量，从而形成DNA和RNA的校正曲线(其中浓度是计算得到的)。表2-1示出回收液中包含的DNA和RNA的浓度，表2-2示出洗涤液中包含的DNA和RNA的浓度。
表2-1
洗涤步骤中的乙醇浓度 由回收液回收的DNA的量 由回收液回收的RNA的量(μg)
乙醇20％     0.0     3.2
乙醇30％     0.2     9.1
乙醇40％     1.1     8.4
乙醇50％     2.0     9.2
乙醇70％     5.2     10.5
表2-2
洗涤步骤中的乙醇浓度 由洗涤液回收的DNA的量 由洗涤液回收的RNA的量(μg)
乙醇20％     5.1     9.8
乙醇30％     5.0     0.1
乙醇40％     2.1     0.5
乙醇50％     2.0     0.4
乙醇70％     1.8     0.6
表2-1和2-2的结果清楚地表明，当洗涤步骤中的乙醇浓度为50重量％或更低时，DNA混入量低。由此结果发现，根据本发明的方法，通过减少含有核酸的回收液中的DNA混入量，可选择性地回收RNA。
同时还发现，当洗涤液中的乙醇浓度高于50重量％时，DNA污染增加。
实施例2-2-1
(2-6)核酸溶解试剂溶液和洗涤液的制备
根据以下所示的配方，制备核酸溶解试剂溶液和洗涤液。
(核酸溶解试剂溶液B-2-1)
硫氰酸胍(由和光纯药工业株式会社生产)         3.5M
BisTris(由日本株式会社同仁化学研究所生产)    0.25M
使用盐酸制成pH6.5的溶液
在使用核酸溶解试剂B-2-1之前，即刻加入1.0体积％的2-巯基乙醇。
(核酸溶解样品溶液B-2-2)
土温20(由和光纯药工业株式会社生产)           15％
BisTris(由日本株式会社同仁化学研究所生产)    0.1M
使用盐酸制成pH6.0的溶液
(洗涤液B-2)
Tris-HCl(pH7.5)     10mM
氯化钠              0.5M
乙醇                5％到12.5％
(回收液B-2)
Tris-HCl(pH 6.5)    1mM
(2-7)动物组织核酸混合物溶液的制备
将在液氮条件下速冻的小鼠肝脏切成小块，并取5mg在1.5ml的试管中温育。向试管中加入350μL的核酸溶解试剂B-2-1，并将试管放入转子-定子匀浆器(商品名为Polytron，由KINEMATICA公司制造)中，直到混合物变均匀。然后在室温下，将溶液在8000×g的条件下离心3分钟。并将上清液转移到一个新的1.5mL试管中(不带入组织碎片)。向上清液中加入175μL的核酸溶解试剂B-2-2，并使用涡流混合器搅拌15秒钟。此外，将175μL的99.5体积％或更高纯度的乙醇加入其中，并使用涡流混合器搅拌1分钟。
(2-8)分离和纯化RNA的操作
将溶液注入到包括核酸吸附性多孔膜(如上述(2-1)和(2-2)制备)的核酸分离纯化柱的第一个开口中，然后将压力差产生装置(注射器泵)与该柱的所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，通过使所注入的含有核酸样品溶液穿过核酸吸附性多孔膜，从而使注入的含有核酸样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触，并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出所述溶液。然后，将750μL含有5％到12.5％乙醇的洗涤液B-2注入核酸分离纯化柱的所述第一个开口中，随后将压力差产生装置与所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使注入的洗涤液B-2穿过核酸吸附性多孔膜，并由另一个开口排出所述溶液。该操作被重复3次。此外，向核酸分离纯化柱的所述第一个开口注2入100μL的回收液B-2，然后将压力差产生装置与该柱的所述第一个开口连接，使核酸分离纯化柱的内部形成加压状态，从而使注入的回收液B-2穿过核酸吸附性多孔膜，并由另一个开口排出所述溶液，由此回收洗脱液。
实施例2-2-2
除了在洗涤液B-2中采用30％、2％和0％的乙醇浓度以外，以与上述(2-8)相同的方式实施每一步操作。
(2-9)回收核酸的琼脂糖凝胶电泳
将经过实施例2-2-1和实施例2-2-2纯化的核酸进行1％琼脂糖凝胶电泳。结果显示在图7中。
(2-10)核酸的回收量
测量由实施例2-2-1和实施例2-2-2回收得到的含有核酸的回收液的浓度。通过使用在260nm波长处的吸收度来进行测量。结果显示在表2-3中。
表2-3
    乙醇浓度     RNA的回收量
    E2-1     30.0％     23.1μg
    E2-2     20.0％     21.7μg
    E1-1     12.5％     23.9μg
    E1-2     10.0％     24.9μg
    E1-3     7.5％     23.2μg
    E1-4     5.0％     20.7μg
    E2-3     0％     19.0μg
如图7所示发现，在实施例2-2-1的洗涤步骤(其中，乙醇浓度为5％到12.5％)中，很难识别出DNA的混入。同时，在实施例2-2-2的洗涤步骤(其中，乙醇浓度为20％到30％)中，可识别出DNA的混入。此外，在实施例2-2-2中的乙醇浓度为0％的情况下，尽管没有识别出DNA的混入，但核酸的排出量降低了。
根据本发明，合理地降低回收液中的DNA混入量，可以选择性地以高收率回收RNA。
工业实用性
通过使用根据本发明的多孔膜，可以从DNA和RNA的混合物样品中，更廉价地以优异的纯度选择性地纯化RNA，所述多孔膜具有优异的分离性能、良好的洗涤效率、简单快速的可使用性和良好的自动化和小型化的适用性，并且可以批量生产出分离性能基本相同的所述多孔膜。
此外，通过使用本发明的分离和纯化核酸的方法(其中，该方法使用上述核酸吸附性多孔膜)，可以更廉价更容易地从DNA和RNA的混合物样品中选择性地回收RNA或DNA。
在本文中所要求的外国优先权中的每个外国专利申请其全部公开内容以引用方式并入本文，如同将其全部列出一样。

Claims (43)

1.一种从含有DNA和RNA的核酸混合物溶液中选择性地分离和纯化RNA的方法，
该方法使用包含具有至少两个开口的容器的核酸分离纯化柱，并且该容器容纳有溶液能穿过的核酸吸附性多孔膜，
其中，所述方法包括以下步骤：
(1-a)将核酸吸附到所述核酸吸附性多孔膜上；
(1-b)在核酸被吸附在所述核酸吸附性多孔膜上的期间，使用洗涤液洗涤该核酸吸附性多孔膜；
(1-c)对所述核酸吸附性多孔膜进行脱氧核糖核酸酶处理；
(1-d)用洗涤液洗涤所述核酸吸附性多孔膜；以及
(1-e)用回收液使RNA从所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，从而将回收液排出该柱，
其中，在步骤(1-c)中，每1cm2的所述核酸吸附性多孔膜使用总量为130μL或更少的脱氧核糖核酸酶溶液。
2.根据权利要求1所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中脱氧核糖核酸酶溶液中的脱氧核糖核酸酶浓度为10KunitzU/mL到10000Kunitz U/mL。
3.根据权利要求1或2所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜包含有机聚合物，核酸通过基本没有离子键参与的微弱的相互作用被吸附到该有机聚合物上。
4.根据权利要求3所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜具有羟基。
5.根据权利要求1到4中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜包含由乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物经皂化而得到的有机材料。
6.根据权利要求1到5中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜具有彼此不对称的正面区域和背面区域。
7.根据权利要求1到6中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸混合物溶液是这样的溶液：该溶液是通过向将核酸溶解试剂加入试验样品中并与该试验样品混合而得到的混合物溶液中，另外再加入水溶性有机溶剂而得到的。
8.根据权利要求7所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述试验样品是培养细胞。
9.根据权利要求8所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述培养细胞是在悬浮液中生长的细胞。
10.根据权利要求8所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述培养细胞是以单层方式生长的细胞。
11.根据权利要求7所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述试验样品是动物组织。
12.根据权利要求7到11中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，其中，在加入所述核酸溶解试剂之前或之后，将所述试验样品均化。
13.根据权利要求7到12中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述核酸溶解试剂包含以下试剂中的至少一种：离液盐、核酸稳定剂、表面活性剂、缓冲液以及消泡剂。
14.根据权利要求13所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述离液盐是盐酸胍和硫氰酸胍中的至少一种。
15.根据权利要求7到14中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述水溶性有机溶剂包含以下试剂中的至少一种：甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体。
16.根据权利要求1到15中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述洗涤液是这样的溶液：其包含选自甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体中的至少一种醇，
其中，所述洗涤液所包含的所述至少一种醇其含量为1重量％到100重量％。
17.根据权利要求1到16中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，所述回收液是浓度为0.5mol/L或更低的盐溶液。
18.根据权利要求1到17中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA的方法，
其中，压力差产生装置是以可拆装的方式与所述核酸分离纯化柱的一个开口连接的泵。
19.一种用于实施根据权利要求1到18中的任意一项所述方法的成套用具，该成套用具由核酸分离纯化柱和试剂构成。
20.一种用于自动实施根据权利要求1到18中的任意一项所述方法的装置。
21.一种用于自动使用根据权利要求19所述的成套用具的装置。
22.一种选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，该方法包括以下步骤：
(2-a)通过使含有RNA和DNA的核酸混合物溶液穿过核酸吸附性多孔膜，从而将核酸吸附到所述核酸吸附性多孔膜上；
(2-b)在核酸被吸附在所述核酸吸附性多孔膜上的期间，使洗涤液穿过所述核酸吸附性多孔膜，从而洗涤该核酸吸附性多孔膜；以及
(2-c)通过使回收液穿过所述核酸吸附性多孔膜，从而使核酸从所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，
其中，所述洗涤液包含浓度为50重量％或更低的水溶性有机溶剂，并且所述洗涤液不含离液盐。
23.根据权利要求22所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述洗涤液包含浓度为5重量％到40重量％的水溶性有机溶剂。
24.根据权利要求22或23所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜是包含有机聚合物的多孔膜，核酸通过基本没有离子键参与的微弱的相互作用被吸附到该有机聚合物上。
25.根据权利要求22到24中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜是包含带有羟基的有机聚合物的多孔膜。
26.根据权利要求22到25中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜是这样的多孔膜：其包含由乙酰值互不相同的醋酸纤维素的混合物经皂化而得到的有机材料。
27.根据权利要求22到26中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述核酸吸附性多孔膜具有彼此不对称的正面区域和背面区域。
28.根据权利要求22到27中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述样品溶液是这样的溶液：该溶液是通过向含有细胞或病毒的试验样品经核酸溶解试剂处理而得到的溶液中，加入水溶性有机溶剂而得到的。
29.根据权利要求28所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述试验样品是培养的细胞。
30.根据权利要求28所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述试验样品是动物组织。
31.根据权利要求28到30中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，在加入所述核酸溶解试剂之前或之后，将所述试验样品均化。
32.根据权利要求28所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述核酸溶解试剂包含以下试剂中的至少一种：离液盐、核酸稳定剂、表面活性剂、缓冲液以及消泡剂。
33.根据权利要求32所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述离液盐是盐酸胍和硫氰酸胍中的至少一种。
34.根据权利要求22到33中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述水溶性有机溶剂是选自甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体中的至少一种醇。
35.根据权利要求22到34中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述洗涤液是这样的溶液：其包含选自甲醇、乙醇、丙醇和其异构体、以及丁醇和其异构体中的至少一种醇，并且该醇的含量为5重量％到50重量％。
36.根据权利要求22到35中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述洗涤液包含水溶性盐。
37.根据权利要求36所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述水溶性盐的浓度为10mmol/L或更高。
38.根据权利要求36或37中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述水溶性盐的浓度为10mmol/L到1mol/L。
39.根据权利要求22到38中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述洗涤液是氯化物的含量为10mmol/L到1mol/L的溶液。
40.根据权利要求22到39中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，所述回收液是这样的溶液：该溶液能够使被吸附的RNA从所述核酸吸附性多孔膜上解吸附，并且该溶液的盐浓度为0.5mol/L或更低。
41.根据权利要求22到40中的任意一项所述的选择性地分离和纯化RNA或DNA的方法，
其中，在步骤(2-a)、(2-b)和(2-c)中的每一步中，通过使用以下装置使所述含有核酸的样品溶液、所述洗涤液和所述洗脱液穿过所述核酸吸附性多孔膜，所述装置为：
(i)核酸分离纯化柱，该核酸分离纯化柱包含具有至少两个开口的容器，并且该核酸分离纯化柱在所述容器内容纳有溶液能穿过的核酸吸附性多孔膜；以及(ii)压力差产生装置，
其中，所述压力差产生装置是以可拆装的方式与核酸分离纯化柱的一个开口连接的泵。
42.一种用于实施根据权利要求22到41中的任意一项所述方法的成套用具，该成套用具由核酸分离纯化柱和试剂构成。
43.一种用于自动实施根据权利要求22到41中的任意一项所述方法的装置。
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