CN101103109B - 用于分离和纯化核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于分离和纯化核酸的方法，包括以下步骤：(1)向生物材料中加入裂解溶液以制备包含核酸的样品溶液，以及，向样品溶液加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液，从而制备包含水溶性有机溶剂的样品溶液；(2)使包含水溶性有机溶剂的样品溶液与固相接触，从而将核酸吸附在固相上；(3)使洗涤液与固相接触，从而在核酸被吸附在固相上的状态下洗涤固相；以及(4)使固相与回收液接触，从而使核酸从固相解吸；其中，在步骤(1)中，水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少分成两次加入。

Description

用于分离和纯化核酸的方法
技术领域
本发明涉及分离和纯化核酸的方法，更具体地涉及从包含核酸的混合物分离和纯化核酸的方法。
背景技术
各种形式的核酸应用于多种领域。例如，在重组核酸技术领域中，需要将核酸以探针、基因组核酸或质粒核酸的形式使用。
此外，在诊断学领域中，核酸以多种形式应用于多种目的。例如，在检测和诊断人类病原体时，常常使用核酸探针。同样，核酸也用于检测遗传性病症，并且还用于检测食品污染物。此外，出于从绘制基因图谱到克隆或重组表达的多种目的，也常常用核酸对所需核酸进行定位、识别和分离。
在许多情况下，只有极微量的核酸可以利用，因此分离和纯化需要复杂且费时的操作。这些复杂且费时的操作有时会导致核酸损失。在从来自于血清、尿或细菌培养物的样品中纯化核酸时，还会碰到污染或假阳性结果的问题。
公知的分离和纯化方法基于下述方式：将核酸吸附到二氧化硅、含硅聚合物(silica polymer)、硅酸镁或类似的固相上，随后通过实施洗涤、解吸附等操作对核酸进行分离和纯化(参见例如专利文献JP-B-7-51065)。这种方法提供令人满意的分离能力，但是在简单性、快速性、和对自动操作的适应性方面不足。此外，用于这种方法的设备和装置不适合自动化和小型化，特别是吸附剂元件涉及这样的缺点，即，在工业上难于以恒定的性能大量生产，处理麻烦和难于以各种形式生产。此外，由于材料本身的脆性，其需要有一定的厚度以得到机械强度，所以在从DNA和RNA的混合样品选择性回收RNA时，需要采用昂贵的试剂，例如脱氧核糖核酸酶。
另外，一种已知的简单有效的核酸分离-纯化通过下述方式进行核酸的分离-纯化：采用用于将核酸吸附在固相上的溶液和用于使核酸从固相解吸的溶液，并且通过将核酸吸附在由表面具有羟基的有机聚合物形成的固相上，并使核酸由此解吸附(JP-A-2003-128691和JP-A-2004-49108)。
用于核酸的分离-纯化的其它已知方法包括离心法、利用磁珠的方法和过滤方法，并且根据这些方法提出了用于核酸的分离-纯化的装置。例如，作为基于过滤方法的核酸-分离装置，提出了以下结构：其中将多个滤管(每个滤管容纳一个过滤器)设置在支架上，然后将包含核酸的样品溶液分别注入其中，然后在气室中用密封剂将支架底部的周边紧密封闭，然后降低气室内部压力，以同时从滤管的出口侧抽吸所有的滤管，使样品溶液通过过滤器并且使核酸吸附在过滤器上，分别注入洗涤液和回收液并且同样在减压下抽吸，以实现核酸的洗涤和解吸(例如参考日本专利2832586)。
在将核酸吸附在由例如在表面上具有羟基的有机聚合物形成的多孔膜上的情况中，通常向包含核酸的溶液加入包含水溶性有机溶剂的溶液。用于这种加入的水溶性有机溶剂通常是乙醇的水溶液。在用于将核酸吸附在固相上的溶液中，在向包含核酸的溶液进行这种加入之后，通常最终的乙醇浓度(最终乙醇浓度)优选为20质量％到60质量％范围内。
发明内容
本发明的目的是，在通过将生物材料中的核酸吸附在固相表面、并在洗涤等之后使核酸解吸的分离和纯化核酸的方法中，提供这样的方法，其能够处理更大量生物材料，而使核酸吸附于固相的溶液的获得时间不会延长。
上述目的可以通过本发明的下述方面实现：
1.一种用于分离和纯化核酸的方法，包括以下步骤：
(1)向生物材料中加入裂解溶液以制备包含核酸的样品溶液，以及，
向样品溶液加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液，从而制备包含水溶性有机溶剂的样品溶液；
(2)使包含水溶性有机溶剂的样品溶液与固相接触，从而将核酸吸附在固相上；
(3)使洗涤液与固相接触，从而在核酸被吸附在固相上的状态下洗涤固相；以及
(4)使固相与回收液接触，从而使核酸从固相解吸，
其中在步骤(1)中，将水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少分成两次加入。
2.如上述项目1所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中步骤(1)包括：
在向样品溶液加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次之后，通过包括摇动、翻转、和旋转移动中至少一种的操作，搅拌样品溶液；以及
在搅拌之后，向溶液中进一步加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次。
3.如上述项目1或2所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中步骤(1)包括：
在向样品溶液加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次之后，通过包括至少抽吸和排出溶液的操作，搅拌样品溶液，以及
在搅拌之后，向溶液中进一步加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次。
4.上述项目1到3中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，在步骤(1)中，包含水溶性有机溶剂的样品溶液中，水溶性有机溶剂的浓度在5质量％到90质量％的范围内。
5.上述项目1到3中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，在步骤(1)中，包含水溶性有机溶剂的样品溶液中，水溶性有机溶剂的浓度在10质量％到60质量％的范围内。
6.上述项目1到3中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，在步骤(1)中，包含水溶性有机溶剂的样品溶液中，水溶性有机溶剂的浓度在20质量％到40质量％的范围内。
7.上述项目1到6中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中固相是包括有机聚合物的多孔膜，所述有机聚合物通过基本没有离子键参与的相互作用吸附核酸。
8.上述项目7所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中有机聚合物具有羟基。
9.上述项目7或8中所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，多孔膜包括由乙酰值不同的醋酸纤维素混合物经皂化得到的有机材料。
10.上述项目7到9中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中多孔膜具有彼此不对称的前表面和后表面。
11.上述项目1到10中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中裂解溶液是核酸-溶解剂。
12.上述项目1到11中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中生物材料是动物组织。
13.上述项目11中所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中核酸-溶解剂包括选自以下试剂的至少一种：离液盐、核酸-稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和消泡剂。
14.上述项目13中所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中离液盐包括选自盐酸胍和硫氰酸胍的至少一种。
15.上述项目1到14中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中水溶性有机溶剂为选自甲醇、乙醇、丙醇或其异构体以及丁醇或其异构体的至少一种。
16.上述项目1到15中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中洗涤液为选自甲醇、乙醇、丙醇或其异构体以及丁醇或其异构体的至少一种，所包含的量为20质量％到50质量％。
17.上述项目1到16中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中洗涤液是包含10mmol/L到1mo l/L的氯化物的溶液。
18.上述项目7到17中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，在步骤(2)、(3)和(4)中，通过下述装置使包含水溶性有机溶剂的样品溶液、洗涤液或回收液通过多孔膜：核酸分离-纯化柱，其在具有至少两个开口的容器内部容纳多孔元件，溶液可以通过该多孔元件；以及压力差产生装置，也就是可拆卸地安装在核酸分离-纯化柱的至少两个开口之一上的泵。
19.一种包括核酸分离-纯化柱和试剂的成套用具，用于实施上述项目1到18中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法。
20.一种装置，用于自动实施上述项目1到18中任一项所述的用于分离和纯化核酸的方法。
在本发明中，在用于将核酸吸附在固相上的溶液(本发明中的“包含水溶性有机溶剂的样品溶液”)的制备步骤中，水溶性有机溶剂的加入量降低，而最终浓度不变，这样，所采用的浓度比常规情况下的浓度更高。因此，用于将核酸吸附在固相上的溶液的最终用量可以得到降低，从而最初加入到生物材料中的裂解溶液可以增加。在本发明中，水溶性有机溶剂分成多个部分(分成多次)加入，并且辅助进行混合，因而能使用更高浓度的水溶性有机溶剂。从而使得可能处理更大量的生物材料和快速地回收核酸。对于采用的固相没有特别限制，但是优选由多孔膜构成，并且为了实现本发明的效果，优选地，采用容纳这种多孔膜的核酸分离-纯化柱，以及，优选地，采用能够通过没有离子键参与的相互作用而吸附核酸的膜作为这种多孔膜，以及更优选地，采用在具有两个开口的容器中容纳(包含)有机聚合物多孔膜的核酸分离-纯化柱。
本发明的最佳实施方式
本发明用于分离和纯化核酸的方法至少包括：
步骤(1)，向生物材料加入裂解溶液以制备样品溶液，并向样品溶液加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液，从而制备包含水溶性有机溶剂的样品溶液(以下也称为“制备包含水溶性有机溶剂的样品溶液的步骤”)；
步骤(2)，使包含水溶性有机溶剂的样品溶液接触固相，从而将核酸吸附在固相上(以下也称为“吸附步骤”)；
步骤(3)，使固相接触洗涤液，从而在核酸吸附在固相上的状态下洗涤固相(以下也称为“洗涤步骤”)；以及
步骤(4)，使固相接触回收液，从而使核酸从固相解吸附(以下也称为“回收步骤”)。
对于使用的固相没有特别限制，但是优选为通过基本没有离子键参与的相互作用吸附核酸的多孔膜(以下也称为“核酸吸附性多孔膜”)。
在步骤(2)、(3)或(4)中，优选地，通过压力差产生装置，使包含水溶性有机溶剂的样品溶液、洗涤液、或回收液通过核酸吸附性多孔膜，并且，更优选地，步骤(2)、(3)或(4)如下方式进行：通过将包含水溶性有机溶剂的样品溶液、洗涤液、或回收液注入到核酸分离-纯化柱(具有至少两个开口并且在其中容纳核酸吸附性多孔膜)的一个开口中，通过与上述一个开口结合的压力差产生装置，对柱的内部进行加压，从而使注入的液体通过膜从另一个开口排出。通过在加压状态下使包含水溶性有机溶剂的样品溶液、洗涤液或回收液通过多孔膜，装置可以有利地小型化、自动化。用泵产生的加压状态在10kPa到300kPa、更优选40kPa到200kPa的范围内。
更优选地，通过以下步骤使用容纳核酸吸附性多孔膜的核酸分离-纯化柱分离和纯化核酸：
步骤(a)，将包含水溶性有机溶剂的样品溶液注入到核酸分离-纯化柱的一个开口中，该核酸分离-纯化柱具有至少两个开口，并且在其中容纳核酸吸附性多孔膜(溶液可以通过的核酸吸附性多孔膜)；
步骤(b)，通过与上述一个开口结合的压力差产生装置，对核酸分离-纯化柱内部进行加压，从而使注入的包含水溶性有机溶剂的样品溶液通过膜，并且从核酸分离-纯化柱的另一个开口排出，由此将核酸吸附在核酸吸附性多孔膜中；
步骤(c)，将洗涤液注入核酸分离-纯化柱的该一个开口中；
步骤(d)，通过与该一个开口结合的压力差产生装置，对核酸分离-纯化柱内部进行加压，从而使注入的洗涤液通过膜，并且从核酸分离-纯化柱的另一个开口排出，由此洗涤核酸吸附性多孔膜，该膜处于核酸被吸附在其中的状态；
步骤(e)，将回收液注入核酸分离-纯化柱的该一个开口中；以及
步骤(f)，通过与该一个开口结合的压力差产生装置，对核酸分离-纯化柱内部进行加压，从而使注入的回收液通过膜，并且从核酸分离-纯化柱的另一个开口排出，由此使核酸从核酸吸附性多孔膜解吸附，并且将其从核酸分离-纯化柱排出。
用于分离和纯化核酸的这种工艺，从注入包含水溶性有机溶剂的样品溶液的起始步骤到在核酸分离-纯化柱外面得到核酸的步骤，可以在大致30分钟内完成，并且在优选的情况下在2分钟内完成。
另外，分离和纯化核酸的这种工艺允许在DNA的情况中以1.6到2.0的纯度和在RNA的情况中以1.8到2.2的纯度(紫外光-可见光分光光度计的测量值(260nm/280nm))回收核酸，因此稳定地提供具有低杂质污染的高纯度核酸。另外，还可在DNA的情况中以约1.8和在RNA的情况中以约2.0的纯度(紫外光-可见光分光光度计的测量值(260nm/280nm))回收核酸。
此外，在上述工艺中，压力差产生装置可以是注射器、移液管或能够加压的泵例如蠕动泵(perista pump)、或能够减压的装置例如蒸发器。这其中，注射器适合于手动操作，而泵适合于自动操作。此外，移液管具有容易允许单手操作的优点。优选地，压力差产生装置与核酸分离-纯化柱的一个开口可拆卸地结合。
有利地，也可通过与核酸分离-纯化柱的另一个开口结合的压力差产生装置，降低核酸分离-纯化柱内部压力，从而进行上述工艺。有利地，也可以通过对核酸分离-纯化柱施加离心力，进行上述工艺。
对用于本发明的生物材料没有特别限制，只要其包含核酸即可，可包括细胞、组织、血液和细菌。例如在诊断领域中，其可为：作为生物材料得到的体液(例如全血、血浆、血清、尿、粪便、精液或唾液)、植物(或其一部分)、动物(或其一部分)、细菌、病毒、或培养的细胞、或从这种生物材料制备的液体(例如溶液或组织匀浆)。培养的细胞包括漂浮型细胞和粘着型细胞。漂浮型细胞是指这样的细胞：其在培养基中以漂浮状态生长和增殖，而不粘附于培养池(culturecell)壁，代表性的细胞株包括HL60、U937和HeLaS3。粘着型细胞是指在培养基中以粘附于培养池壁的状态生长和增殖的细胞，代表性的细胞株包括NIH3T3、HEK293、HeLa、COS和CHO。用作生物材料的动物(或其一部分)可以是动物组织，以及构成个体动物并且可通过动物的解剖或活组织检查收集的任何组织，例如肝脏、肾脏、脾脏、脑、心脏、肺或胸腺。下文中也可将这种生物材料称为被分析物。
步骤(1)，向生物材料加入裂解溶液以制备样品溶液，并向样品溶液加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液，从而制备包含水溶性有机溶剂的样品溶液(“制备包含水溶性有机溶剂的样品溶液的步骤”)：
首先，将裂解溶液加入到被分析物中，以得到“包含核酸的样品溶液”。裂解溶液优选是这样的水溶液，其包含能够溶解核酸的试剂(核酸-溶解剂)，用于进行溶解细胞膜和核膜的过程。然后，向分散在水溶液中的核酸加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液，从而得到“包含核酸的样品溶液”。
核酸-溶解剂可为包含以下至少一种的溶液：离液盐、核酸-稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和消泡剂。
优选地，核酸-溶解剂中离液盐的浓度为0.5mol/L或更高，更优选0.5mol/L到8mol/L，和进一步优选1mol/L到6mol/L。可以采用任何已知的离液盐而没有特定的限制。离液盐可以是胍盐、异氰酸钠、碘化钠或碘化钾，其中优选胍盐。胍盐可以是盐酸胍、异氰酸胍、或硫氰酸胍，其中优选盐酸胍。这种盐可以单独使用或者以多种组合的形式使用。
核酸-溶解剂中的表面活性剂可为例如非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、或两性表面活性剂。在本发明中，优选使用非离子型表面活性剂。非离子型表面活性剂可为聚氧化乙烯烷基苯基醚类型的表面活性剂、聚氧乙烯烷基醚类型的表面活性剂、或脂肪酸链烷醇酰胺，优选聚氧乙烯烷基醚类型的表面活性剂。更优选地，聚氧乙烯烷基醚类型的表面活性剂选自POE癸基醚、POE月桂基醚、POE十三烷基醚、POE亚烷基癸基醚、POE脱水山梨糖醇单月桂酸酯、POE脱水山梨糖醇单油酸酯、POE脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、四油酸聚氧乙烯山梨糖醇(polyoxyethylene sorbittetraoleate)、POE烷基胺、和POE炔二醇。
此外，可以优选使用阳离子型表面活性剂。更优选地，阳离子型表面活性剂选自溴化十六烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵、和氯化十六烷基吡啶鎓。这种表面活性剂可以单独使用或者以多种组合的形式使用。在核酸-溶解剂的溶液中，优选这种表面活性剂的浓度为0.1质量％到20质量％。(在本说明书中，质量％相当于重量％)
优选地，核酸-溶解剂以与核酸-稳定剂组合形式使用。被分析物可能会包含核酸酶等，其分解核酸并且在将被分析物均化时作用于核酸，从而降低其收率。为了避免这种现象，可以向核酸-溶解溶液中加入能使核酸酶失活的稳定剂。
以这种方式，能提高核酸的回收量和回收率，从而降低被分析物的量并提供更快的处理工艺。
作为用于核酸酶的失活剂，通常有利地采用还原剂。还原剂可为氢化物，例如氢、碘化氢、硫化氢、氢化铝锂、或硼氢化钠、强正电性金属，例如碱金属、镁、钙、铝、锌、或其汞齐，或者有机氧化物例如醛、糖类、甲酸或草酸，但是优选巯基化合物。巯基化合物可为N-乙酰半胱氨酸、巯基乙醇或烷基硫醇，但是没有特别限制。在裂解溶液中，巯基化合物的浓度可以为0.1质量％到20质量％、优选0.5质量％到15质量％。
缓冲剂(缓冲液)可为常规的pH缓冲剂，优选用于生物化学用途的pH缓冲剂。这种缓冲剂包括含柠檬酸盐、磷酸盐、或乙酸盐的缓冲剂、tris-HCl、TE(tris-HCl/EDTA)、TBE(三羟甲基氨基甲烷硼酸盐(tris-Borate/EDTA))、TAE(三羟甲基氨基甲烷乙酸盐(tris-Acetate/EDTA))、或Good′s缓冲剂。Good′s缓冲剂可为例如MES(2-吗啉代乙磺酸)、Bis-Tris(双(2-羟乙基)亚氨基三(羟甲基)甲烷)、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、PIPES(哌嗪基-1，4-双(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、CAPS(N-环己基-3-氨基丙磺酸)、或TES(N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)。
在核酸-溶解剂中，这种缓冲剂的浓度优选为1mmol/L到300mmol/L。
优选地，核酸-溶解剂可包含消泡剂。消泡剂优选为硅类消泡剂(silicone-type)或醇类消泡剂，并且醇类消泡剂优选为炔二醇表面活性剂。
消泡剂的具体实例包括硅类消泡剂(例如硅油、二甲基聚硅氧烷、有机硅乳液、改性聚硅氧烷、或有机硅复合物)、醇类消泡剂(例如炔二醇、庚醇、乙基己醇、高碳醇或聚氧化亚烷基乙二醇)、醚类消泡剂(例如庚基溶纤剂、或壬基溶纤剂-3-庚基山梨糖醇)、油/脂肪类消泡剂(例如动物油或植物油)、脂肪酸类消泡剂(例如硬脂酸、油酸、或棕榈酸)、金属皂类消泡剂(例如棕榈酸铝、或硬脂酸钙)、脂肪酸酯类消泡剂(例如天然蜡、或磷酸三丁酯)、磷酸酯类消泡剂(例如辛醇磷酸酯钠盐(辛基磷酸钠盐))、胺类消泡剂(例如二戊基胺)、酰胺类消泡剂(例如硬脂酸酰胺)、和其它消泡剂(例如硫酸铁或矾土)。特别优选地，可以将硅类消泡剂和醇类消泡剂组合作为消泡剂使用。此外，可优选将炔二醇类表面活性剂用作醇类消泡剂。
此外，核酸-溶解剂的溶液可包含水溶性有机溶剂。这种水溶性有机溶剂用于提高在核酸-溶解剂中的各种试剂的溶解度，并且可为丙酮、氯仿、或二甲基甲酰胺，但是优选为醇。这种醇可为伯醇、仲醇或叔醇。
更优选地，醇可为甲醇、乙醇、丙醇或其异构体、或丁醇或其异构体。这些水溶性有机溶剂可以单独使用或者以多种组合的形式使用。在核酸-溶解剂的溶液中，优选地，水溶性有机溶剂的浓度为1质量％到20质量％。
优选地，核酸-溶解剂的溶液的pH值为3到8、更优选4到7、和进一步优选5到7。
优选地，被分析物经过均化处理，从而改善对自动化工艺的适应性。可以通过下述方式进行均化处理：例如，超声波处理、使用尖锐的突出物进行处理、通过高速搅拌进行处理、通过推压使样品穿过微孔进行处理以及使用珠子(例如，玻璃珠、不锈钢珠或二氧化锆珠子)进行处理。
对用于将匀化的被分析物与核酸-溶解剂核酸混合的方法没有特别限制。优选使用30rpm到3,000rpm的搅拌装置进行混合，进行1秒到3分钟的时间。由此可提高分离和纯化的核酸的收率。还优选通过5到30次的翻转进行混合。还可以通过进行10到50次的移液操作进行混合。在这种情况下，可以通过简单的操作增加分离和纯化的核酸的收率。
向得到的包含核酸的样品溶液中加入水溶性有机溶剂或水溶性有机溶剂的水溶液，从而得到包含水溶性有机溶剂的样品溶液。在本发明中，水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液以至少两个部分的分开方式加入。加入到包含核酸的样品溶液中的水溶性有机溶剂可优选为醇，其可为伯醇、仲醇或叔醇，并且优选为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或其异构体。在包含水溶性有机溶剂的样品溶液中，优选地，水溶性有机溶剂的最终浓度为5质量％到90质量％、更优选10质量％到60质量％、特别优选20质量％到40质量％。加入的水溶性有机溶剂或水溶性有机溶剂的水溶液的浓度为20体积％到100体积％、优选50体积％到100体积％。在本发明中，水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液以至少两个部分的分开方式加入。第一次加入的量优选为总加入量的5体积％到90体积％，更优选为25体积％到70体积％。
进一步优选地，在向样品溶液加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次之后，通过包括摇动、翻转、和旋转移动的至少一种操作进行搅拌，并且在搅拌之后，向溶液中进一步加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次。更优选地，在向样品溶液加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次之后，通过包括至少抽吸和排出溶液的操作进行搅拌，并且在搅拌之后，向溶液中进一步加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次。在既进行包括摇动、翻转和旋转移动的至少一种操作又进行包括至少抽吸和排出溶液的操作的情况中，这些操作可以任意的顺序进行。抽吸和排出溶液可以有利地用例如移液管进行。
此外，这种搅拌可以在第二次加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液之后进行。
优选地，得到的包含水溶性有机溶剂的样品溶液的表面张力为0.05J/cm2或更低，其粘度为1mPa到10,000mPa，以及，其比重为0.8到1.2。这样的物理性能有助于在包含水溶性有机溶剂的样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触之后排出该样品溶液。
步骤(2)，使包含水溶性有机溶剂的样品溶液接触固相，从而将核酸吸附在固相上(“吸附步骤”)；
在下文中，说明用于本发明及其吸附步骤中的固相。
用于本发明的固相优选能够通过基本没有离子键参与的相互作用吸附核酸。这意味着固相在其应用条件下没有“离子化”，并且认为核酸和固相是通过周围极性改变而互相吸引。因此，能以优异的分离能力和令人满意的洗涤效率分离和纯化核酸。优选地，固相具有亲水性基团，由此认为核酸和固相通过周围极性的改变而互相吸引。
亲水性基团表示能够与水相互作用的极性基团(原子团)，并且包括参与核酸吸附的所有基团(原子团)。优选的亲水性基团为中等程度与水相互作用的基团(参见在＂hydrophilic group＂中的＂groupwith a medium hydrophilicity＂，Kagaku Dai-jiten(EncyclopaediaChimica)，由Kyoritsu Shuppan Co.出版)，并且可以是例如羟基、羧基、氰基、或氧化亚乙基，优选为羟基。
在本发明中，具有亲水性基团的固相是指：构成固相的材料本身具有亲水性基团的固相，或者，通过处理或涂覆将亲水性基团引入到构成固相的材料中的固相。构成固相的材料可为有机材料或无机材料。例如，可以采用这样的固相：组成物质为具有亲水性基团的有机材料的固相；通过用具有亲水性基团的材料对不含亲水性基团的有机材料固相进行处理而引入亲水性基团的固相；通过用具有亲水性基团的材料涂覆不含亲水性基团的有机材料固相而引入亲水性基团的固相；组成物质为具有亲水性基团的无机材料的固相；通过用具有亲水性基团的材料对不含亲水性基团的无机材料固相进行处理而引入亲水性基团的固相；通过用具有亲水性基团的材料涂覆不含亲水性基团的无机材料固相而引入亲水性基团的固相。
具有羟基的材料的固相可为由下述材料形成的固相：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氧乙烯、醋酸纤维素或具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物，并且优选具有羟基的有机材料的固相。
具有羟基的有机材料的固相优选为具有多糖结构的材料，更优选由不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物形成的有机聚合物的固相。具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物优选为:三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物、三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物、三醋酸纤维素和二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物、或二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物，特别优选三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合比例优选为99:1到1:99，更优选为90:10到50:50。
更优选地，具有羟基的有机材料为JP-A-2003-128691中所述的醋酸纤维素的皂化物质。通过不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物的皂化作用，得到醋酸纤维素的皂化物质，并且优选是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化物质、三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化物质、三醋酸纤维素和二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化物质、或二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化物质，特别优选三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化物质。三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合比例(质量比)优选为99:1到1:99，更优选为90:10到50:50。在这种情况下，可以通过皂化处理的程度(皂化率)控制固相表面上的羟基的量(密度)。更高的羟基量(密度)对于提高核酸的分离效率是优选的。例如，在醋酸纤维素例如三醋酸纤维素的情况中，优选皂化率(表面皂化率)为约5％或更高，更优选为10％或更高。此外，为了提高具有羟基的有机聚合物的表面面积，优选对醋酸纤维素的固相进行皂化处理。
皂化处理表示使醋酸纤维素接触皂化溶液(例如氢氧化钠水溶液)。因此，在接触皂化溶液的纤维素的酯衍生物中，酯基被水解，羟基被引入到再生纤维素中。如此制备的再生纤维素与原始的纤维素在晶态等方面不同。此外，皂化率可以随皂化工艺的氢氧化钠浓度和处理时间变化。通过NMR、IR、或XPS(例如通过羰基峰的降低)，可以容易地测量皂化率。
为了将亲水性基团引入到不含亲水性基团的有机材料的固相中，可以将在聚合物链或侧链中具有亲水性基团的接枝聚合物链结合于固相。为了将接枝聚合物链结合在有机材料的固相上，可使用两种方法，即，使固相与接枝聚合物链化学键合的方法，以及，从固相开始使具有可聚合双键的化合物聚合从而形成接枝聚合物链的方法。
在固相与接枝聚合物链化学键合的方法中，可以通过利用在聚合物末端或在侧链中具有能够与固相反应的官能团的聚合物，并使该官能团与固相的官能团之间化学反应，进行接枝。对于能够与固相反应的官能团没有特别限制，只要其能够与固相的官能团反应即可，并且可以是例如硅烷偶联基团(例如烷氧基硅烷)、异氰酸酯基、氨基、羟基、羧基、磺酸基、磷酸基、环氧基、烯丙基、甲基丙烯酰基、或丙烯酰基。作为在聚合物的末端或在侧链中具有活性官能团的聚合物，特别有用的是在聚合物的末端具有三烷氧基甲硅烷基的聚合物、在聚合物的末端具有氨基的聚合物、在聚合物的末端具有羧基的聚合物、在聚合物的末端具有环氧基的聚合物、或在聚合物的末端具有异氰酸酯基的聚合物。用于这种情况中的聚合物可为具有参与吸附核酸的亲水性基团的任何聚合物，但是可以是例如：聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸、或其盐；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸或其盐；或聚氧乙烯。
从固相开始使具有可聚合双键的化合物聚合从而形成接枝聚合物链的方法通常称为表面接合聚合。表面接枝聚合是指这样一种方法：通过等离子体辐照、光辐射或加热，为基材的表面提供活性部位，并且通过聚合，使具有可聚合双键并且定位为可与固相接触的化合物与固相结合。可用于结合于基材形成接枝聚合物链的化合物需要满足两个特征：具有可聚合的双键并且具有参与吸附核酸的亲水性基团。这种化合物可为具有亲水性基团的聚合物、低聚物、或单体，只要在分子内有双键。特别有用的化合物是具有亲水性基团的单体。特别有用的具有亲水性基团的单体的具体实例包括具有羟基的以下单体，例如丙烯酸2-羟乙基酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯、和单甲基丙烯酸甘油酯。此外，可以有利地采用包含羧基的单体，例如丙烯酸或甲基丙烯酸、或其碱金属盐或胺盐。
作为用于将亲水性基团引入到不含亲水性基团的有机材料的固相中的另一种方法，可以涂覆具有亲水性基团的材料。对用于涂覆的材料没有特别限制，只要其具有参与吸附核酸的亲水性基团即可，但是考虑到容易操作，优选有机材料的聚合物。这种聚合物可为例如聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸或其盐；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、或其盐；聚氧乙烯、醋酸纤维素或具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物，优选为具有多糖结构的聚合物。
此外，可以在用醋酸纤维素或具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物涂覆不含亲水性基团的有机材料的固相之后，对如此涂覆的醋酸纤维素或具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理。在此情况下，优选地，皂化率为约5％或更高，更优选地，为约10％或更高。
具有羟基的无机材料的固相可为例如由二氧化硅化合物等形成的固相。在以膜形式使用的情况中，其可为玻璃滤膜。其也可为日本专利3058342中所述的二氧化硅多孔性薄膜。这种二氧化硅多孔性薄膜可以以如下方式制备：使能形成双分子膜的阳离子性两性物质的展开液在基板上分散，然后从基板上的液膜除去溶剂，从而制备两性物质的双分子膜的多层薄膜，然后使双分子膜的多层薄膜接触包含二氧化硅化合物的溶液，提取双分子膜的多层薄膜。
为了将亲水性基团引入到不含亲水性基团的无机材料的固相中，可使用两种方法，即：使固相与接枝聚合物链化学键合的方法；以及，从固相开始，使在分子内具有亲水性基团和可聚合双键的单体聚合，从而形成接枝聚合物链的方法。在固相与接枝聚合物链化学键合的情况中，将能够与接枝聚合物链末端的官能团反应的官能团引入到无机材料中，并且将接枝聚合物键合到该官能团上。此外，从固相开始，使在分子内具有亲水性基团和可聚合双键的单体聚合，以形成接枝聚合物链，在这种情况中，将在具有双键的化合物聚合时用作起始点的官能团引入到无机材料中。
优选地，上述具有亲水性基团的接枝聚合物以及在分子内具有亲水性基团和可聚合双键的单体，可以是上文中使不含亲水性基团的有机材料的固相与接枝聚合物链化学键合的方法中所描述的具有亲水性基团的接枝聚合物和在分子内具有亲水性基团和可聚合双键的单体。
作为用于将亲水性基团引入到不含亲水性基团的无机材料的固相中的另一种方法，可以涂覆具有亲水性基团的材料。对用于涂覆的材料没有特别限制，只要其具有参与吸附核酸的亲水性基团即可，但是考虑到容易操作，优选有机材料的聚合物。这种聚合物可为例如聚羟乙基丙烯酸、聚羟乙基甲基丙烯酸或其盐；聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、或其盐；聚氧乙烯、醋酸纤维素或具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物。
此外，可以在用醋酸纤维素或具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物涂覆不含亲水性基团的无机材料的固相之后，对如此涂覆的醋酸纤维素或具有不同乙酰值的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理。在此情况下，优选地，皂化率为约5％或更高，更优选地，为约10％或更高。
不含亲水性基团的无机材料的固相可以由金属(例如铝)、玻璃、水泥、陶瓷(如瓷料)、新型陶瓷、硅或活性碳制备。
有利地，用作本发明的固相的核酸吸附性多孔膜是溶液可以通过的材料。术语“溶液可以通过”是指：在与膜的一个表面接触的空间和与膜的另一个表面接触的另一个空间之间产生压力差，溶液可以从较高压力的空间通过膜的内部到达较低压力的空间中。换句话说，是指：在对膜施加离心力时，溶液可以在离心力的方向通过膜的内部。
优选地，核酸吸附性多孔膜的厚度为10μm到500μm、更优选50μm到250μm。考虑到易于洗涤，优选较薄的厚度。
核酸吸附性多孔膜可相对于其前表面和后表面为对称的，但是可以优选采用相对于前表面和后表面为不对称的多孔膜。
优选地，核酸吸附性多孔膜的最小孔径为0.22μm或更大，更优选为0.5μm或更大。此外，优选地，多孔膜的最大孔径与最小孔径之比为2或更大，从而为吸附核酸提供足够的表面面积并且不容易被堵塞。更优选地，最大孔径与最小孔径之比为5或更大。
优选地，核酸吸附性多孔膜的空隙容积比为50％到95％，更优选为65％到80％，以及，优选地，其起泡点为0.1kgf/cm2到10kgf/cm2，更优选为0.2kgf/cm2到4kgf/cm2。
优选地，核酸吸附性多孔膜的压力损失为0.1kPa到100kPa，从而在过压下提供均匀压力，更优选地，压力损失为0.5kPa到50kPa。压力损失是指使水每通过100μm膜厚所需的最小压力。
当使水在25℃下在1kg/cm2的压力下通过时，优选核酸吸附性多孔膜的水透过量为1mL/min/cm2膜到5000mL/min/cm2膜，更优选地，在相同的条件下为5mL/min/cm2膜到1000mL/min/cm2膜。
优选地，核酸吸附性多孔膜的核酸吸附量为每1mg多孔膜0.1μg或更高，更优选为每1mg多孔膜0.9μg或更高。
优选地，核酸吸附性多孔膜由纤维素衍生物构成，当将边长5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中时，在1小时内不溶解，但是在48小时内溶解。还优选为这样的纤维素衍生物，当将边长5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中时，在1小时内溶解，但是当浸渍在5mL二氯甲烷中时，在24小时内不溶解。这其中，更优选这样的纤维素衍生物，当将边长5mm的正方形多孔膜浸在5mL三氟乙酸中时，在1小时内溶解，但是当浸在5mL二氯甲烷中时，在24小时内不溶解。
当包含水溶性有机溶剂的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜时，优选地，使样品溶液从核酸吸附性多孔膜的一个表面通过到另一个表面，实现溶液与膜的均匀接触。当包含水溶性有机溶剂的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜时，优选地，使样品溶液从核酸吸附性多孔膜中孔径较大的一侧面通过到孔径较小的一侧面，因为这样不容易发生堵塞。
当包含水溶性有机溶剂的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜时，优选地，流速为每1cm2膜2μl/秒到1500μl/秒，以便获得适当的溶液与多孔膜接触时间。溶液与多孔膜接触时间太短不能提供充分的分离和纯化效果，而考虑到操作效率，不希望接触时间太长。更优选地，流速为每1cm2膜5μl/秒到700μl/秒。
所用的核酸吸附性多孔膜(溶液可以通过的核酸吸附性多孔膜)可由单膜形成，但是也可由多个膜形成。多个核酸吸附性多孔膜可彼此相同或不同。
多层核酸吸附性多孔膜可由无机材料的核酸吸附性多孔膜与有机材料的核酸吸附性多孔膜组合形成。例如，可采用玻璃滤膜和再生纤维素多孔膜的组合。此外，多层核酸吸附性多孔膜可由无机材料的核酸吸附性多孔膜和有机材料的核酸非吸附性多孔膜的组合形成。例如，可采用玻璃滤膜和尼龙或聚砜类多孔膜的组合。
有利地，可以采用这样的核酸分离-纯化柱：在具有至少两个开口的容器内，容纳前述核酸吸附性多孔膜(溶液可以通过的核酸吸附性多孔膜)。此外，有利地，可以采用这样的核酸分离-纯化柱：在具有至少两个开口的容器内，容纳多层核酸吸附性多孔膜(溶液可以通过的多层核酸吸附性多孔膜)。在此情况下，容纳在具有至少两个开口的容器内的多层核酸吸附性多孔膜可彼此相同或不同。
优选地，在具有至少两个开口的容器内，核酸分离-纯化柱没有容纳除核酸吸附性多孔膜(溶液可以通过的核酸吸附性多孔膜)以外的任何元件。容器可由塑料材料形成，例如聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚氯乙烯。此外，有利地，可以使用生物可降解的材料。此外，容器可为透明的或有颜色的。
核酸分离-纯化柱可设置有区分各个柱的装置。这种用于区分各个柱的装置可以是例如条形码或磁条。
此外，核酸分离-纯化柱可具有这样的结构：其中可以容易地从具有至少两个开口的容器中取出核酸吸附性多孔膜。
步骤(3)，使固相接触洗涤液，从而在核酸被吸附在固相上的状态下洗涤固相(“洗涤步骤”)；
以下说明洗涤步骤。
用于本发明的洗涤液是包含水溶性有机溶剂的水溶液，优选包含浓度为50质量％或更少、更优选浓度为1质量％到50质量％的水溶性有机溶剂。要求洗涤液具有洗去存在于样品溶液中杂质的功能，该杂质与核酸一起被吸附在核酸吸附性膜上。为此，优选地，洗涤液具有这样的成分：该成分不会使核酸从核酸吸附性膜上解吸附，但是使杂质解吸附。
包含在洗涤液中的水溶性有机溶剂可为醇，例如甲醇、乙醇、异丙醇或其异构体、或丁醇或其异构体。更优选地，以20质量％到50质量％的量，包含选自这些醇的至少一种醇，其中最优选乙醇。
优选地，本发明的洗涤液包含另外的水溶性盐。优选水溶性盐为卤化物盐，最优选为氯化物。此外，优选地，水溶性盐由单价的或二价的阳离子形成，特别优选碱金属盐或碱土金属盐，其中优选钠盐或钾盐，最优选钠盐。
在被包含在洗涤液中的情况下，水溶性盐的浓度优选等于10mmol/L或者更高，并且虽然没有特别地限制，只要不影响杂质的溶解度即可，优选地，水溶性盐浓度的上限为1mol/L或更低，更优选为0.1mol/L或更低。更优选地，水溶性盐是氯化钠，进一步优选为20mmol/L或更高的浓度。
洗涤液另外的特征在于不含离液物质。由此能降低在洗涤步骤之后的回收步骤中被离液物质所污染的可能性。由于在回收步骤中被离液物质所污染，经常抑制酶反应例如PCR反应，考虑到随后的酶反应，理想地，使洗涤液不含离液物质。此外，由于离液物质具有腐蚀性和毒性，对于实验操作中操作者的安全来说，能够不使用离液物质的方法是非常有利的。
如上所述，离液物质是指脲、异硫氰酸胍、硫氰酸胍、异氰酸钠、碘化钠或碘化钾。
在用于分离和纯化核酸的现有技术方法中的洗涤步骤中，洗涤液对容器(例如柱)具有高的润湿性，并且常会留在容器中，从而洗涤液在洗涤步骤之后的回收步骤中引起污染，从而导致核酸的纯度降低或在随后的步骤中的反应性降低。因此，在容器例如柱中进行核酸的吸附和解吸的情况下，重要的是，用于吸附和洗涤的液体(特别是洗涤液)在洗涤之后不留在柱中，以便不影响随后的步骤。
因此，为了使在洗涤步骤中留在柱中的洗涤液减到最少，并为了防止洗涤液在下一个步骤中污染回收液，优选地，洗涤液的表面张力小于0.035J/m2。较低的表面张力改善洗涤液对柱的润湿性能，从而减少残留的液体量。
可通过提高水的比例来提高洗涤效率，但是，洗涤液的表面张力被提高，从而增加残留的溶液量。在洗涤液的表面张力为0.035J/m2或更高的情况下，可以通过提高柱的斥水性来减少残留的液体量。随着柱的斥水性增强，溶液形成液滴并且流下，从而减少残留的液体量。可以通过下述方式增强斥水性：用斥水性材料例如硅氧烷涂覆柱表面，或者在柱成型时混入斥水性材料例如硅氧烷，但是这种方法不是限制性的。
此外，洗涤和回收操作可自动化，以便以简单和快速的方式进行操作。对于快速工艺可只进行一次洗涤步骤，但是在纯度更重要的情况中，优选重复洗涤数次。
在洗涤步骤中，通过管、移液管、自动注入装置或具有等价功能的供料装置，将洗涤液提供给容纳有核酸吸附性多孔膜的核酸分离-纯化柱。将供入的洗涤液由核酸分离-纯化柱的开口之一(用于注入样品溶液的开口)供入，并且通过结合于上述一个开口的压力差产生装置(例如滴液管、注射器、泵或电动移液管)，为核酸分离-纯化柱的内部加压，使洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，从而从不同于原开口(第一个开口)的另一开口排出。还可从一个开口供入洗涤液并且将其从同一开口排出。此外，供入和排出洗涤液的开口可不同于核酸分离-纯化柱中供入样品溶液的开口。然而，由于优异的洗涤效率，优选从核酸分离-纯化柱的一个开口供入洗涤液、使其通过核酸吸附性多孔膜并且从不同于原开口的另一个开口排出的方法。在洗涤步骤中的洗涤液的量优选为2μl/cm2或更高。虽然大量的溶液可以改善洗涤效果，但是优选200μl/cm2或更少的量，以便保持工作效率并减小样品损失。
在洗涤步骤中，洗涤液通过核酸吸附性多孔膜的流速优选为每单位膜面积(1cm2)2μl/秒到1500μl/秒，更优选为5μl/秒到700μl/秒。可以在较低流速下以较长的时间更充分地进行洗涤操作，但是选择上述范围是因为，在核酸的分离-纯化中，快速的操作是同样重要的。
在洗涤步骤中，优选地，洗涤液的溶液温度为4到70℃，更优选为室温。在洗涤步骤中，洗涤操作可在搅拌(通过施加于核酸分离-纯化柱的机械振动或超声振动)下或在施加的离心力的条件下进行。
在本发明中，可以通过利用核酸吸附性多孔膜简化洗涤步骤，更具体地，(1)通过使洗涤液单次通过核酸吸附性多孔膜进行该步骤，(2)该步骤可在室温下执行，(3)可以在洗涤之后立即将回收液注入柱中，以及，(4)该处理可使用特征(1)、(2)和(3)的任何一个或两个或多个实现。这是因为本发明的薄的核酸吸附性多孔膜允许省略干燥步骤，而在现有技术方法中经常需要所述干燥步骤，用于快速除去包含在洗涤液中的有机溶剂。
在现有的核酸分离-提纯方法中，洗涤步骤中的洗涤液经常是溅散并且在别处沉淀，从而引起样品污染。可以通过适当地设计在具有两个开口的容器中容纳核酸吸附性多孔膜的核酸分离-纯化柱的形状和废液容器的形状，抑制这种污染。
步骤(4)，使回收液接触固相从而从固相解吸核酸(“回收步骤”)：
在下文中说明从固相解吸和回收核酸的步骤。
在回收步骤中，通过管、移液管、自动注入装置或具有等价功能的供料装置，将回收液提供给容纳核酸吸附性多孔膜的核酸分离-纯化柱。将回收液由核酸分离-纯化柱的开口之一(用于注入样品溶液的开口)供入，并且通过结合于上述一个开口的压力差产生装置(例如滴液管、注射器、泵或电动移液管)，为核酸分离-纯化柱的内部加压，使回收液通过核酸吸附性多孔膜，从而从不同于原开口的另一开口排出。还可从一个开口供入回收液并且将其从同一开口排出。此外，供入和排出回收液的开口可不同于核酸分离-纯化柱中供入样品溶液的开口。然而，由于优异的回收效率，优选这种方法：从核酸分离-纯化柱的一个开口供入回收液，使回收液通过核酸吸附性多孔膜并且从不同于原开口的另一个开口排出。
可通过相对于包含水溶性有机溶剂的样品溶液的体积调节回收液的体积，使核酸解吸。包含回收核酸的回收液的量取决于所包含的被分析物的量。回收液通常的量为约几十到几百微升，但是在处理极少量的被分析物或分离-纯化大量核酸的情况中，其也可以在1μl到几十毫升的范围内变化。
优选地，回收液为经纯化的蒸馏水或Tris/EDTA缓冲液。此外，在将回收的核酸用于PCR(聚合酶链式反应)时，可采用用于PCR反应的缓冲液(例如：KCl最终浓度为50mmol/L、Tris-HCl最终浓度为10mmol/L以及MgCl2最终浓度为1.5mmol/L的水溶液)。
优选地，回收液的pH值为2到11，更优选为5到9。离子强度和盐浓度对溶解所吸附的核酸有特定的影响。优选地，回收液的离子强度为290mmol/L或更低，盐浓度为90mmol/L或更低。这些范围提高核酸的回收率，从而允许回收更大量的核酸。
可通过与包含水溶性有机溶剂的样品溶液的体积相比减小回收液的体积，得到包含浓缩核酸的回收液。可优选地，(回收液的体积)：(包含水溶性有机溶剂的样品溶液的体积)的比例为1:100到99:100，更优选为1:10到9:10。用这样的方式，可以将核酸浓缩而不需要在核酸的分离-纯化之后的后续步骤中进行浓缩操作，并且可提供使得到核酸比原始被分析物中更浓缩的核酸溶液的方法。
作为另一种方法，还可通过利用体积大于样品溶液(包含水溶性有机溶剂)体积的回收液来使核酸解吸，以得到包含所需浓度核酸的回收液，例如回收液包含浓度适用于后续步骤(例如PCR)的核酸。可优选地，(回收液的体积):(包含水溶性有机溶剂的样品溶液的体积)的比例为1:1到50:1，更优选为1:1到5:1。用这样的方式，省去了在核酸的分离-纯化之后进行繁琐的浓度调节。还可通过采用足量的回收液，提高从多孔膜回收核酸的回收率。
此外，可以通过根据目的改变回收液的温度，进行简单的核酸回收。例如，采用温度为0℃到10℃的回收液从多孔膜解吸核酸，允许抑制核酸酶的功能，从而防止核酸分解，而不使用任何用于避免酶促分解的特定试剂或操作，由此以简单和有效的方式得到核酸溶液。
此外，温度为10℃到35℃的回收液允许在室温进行核酸的回收并解吸和纯化核酸，而无需复杂的步骤。
此外，作为另一种方法，较高温度(例如35到70℃)的回收液允许通过不含复杂操作的简单方法以高的回收率从多孔膜解吸核酸。
回收液在注入次数上没有具体限制，可一次或多次注入。通常以单次回收操作进行核酸的简单和快速分离-纯化，但是在例如回收大量核酸的情况下，可以多次注入回收液。
在回收步骤中，用于核酸的回收液可具有能用于后续步骤的组成。经分离和纯化的核酸经常通过PCR(聚合酶链式反应)方法进行扩增。在此情况下，必须用适用于PCR方法的缓冲溶液，将经分离和纯化的核酸溶液稀释。适合于PCR方法的缓冲液可用作本发明回收步骤中的回收液，从而能够简单和快速地转到随后的PCR步骤。
此外，在回收步骤中，用于核酸的回收液可进一步包含稳定剂，用于防止核酸分解。这种稳定剂可为抗菌剂、防霉剂或核酸酶抑制剂。核酸酶抑制剂可为例如EDTA。在另一个实施方案中，可以预先向回收容器中加入稳定剂。
对用于回收步骤的回收容器没有特别限制，可以用在260nm波长处没有吸收的材料制备。在此情况下，可以直接测量回收的核酸溶液的浓度，而无需转移到另一个容器中。在260nm处没有吸收的材料可为例如石英玻璃，但是这种实例不是限制性的。
此外，用于上述分离和纯化核酸的方法中的核酸分离-纯化柱、和用于步骤(1)到(4)的试剂可以作为成套用具(试剂盒)提供。
优选地，通过能够自动进行各个步骤的自动装置进行上述步骤，即，利用在容器(具有至少两个开口)中容纳核酸吸附性多孔膜的核酸分离-纯化柱和压力差产生装置、从包含水溶性有机溶剂的样品溶液分离和纯化核酸。这种方法不仅允许以更简单和更快的方式进行各个操作，而且允许不依靠操作者的技能得到预定水平的核酸。
在下文中说明自动装置的实例，该自动装置用于自动进行下述的步骤，即，利用在容器(具有至少两个开口)中容纳核酸吸附性多孔膜的核酸分离-纯化柱和压力差产生装置、从包含水溶性有机溶剂的样品溶液分离和纯化核酸。但是自动装置不限于这种实例。
该自动装置是自动进行分离纯化操作的核酸分离-纯化装置，该操作包括：采用容纳核酸吸附性多孔膜(溶液可以通过的核酸吸附性多孔膜)的核酸分离-纯化柱；将包含水溶性有机溶剂的样品溶液注入到核酸分离-纯化柱中并且加压，从而将样品溶液中的核酸吸附在核酸吸附性多孔膜中；单独将洗涤液注入核酸分离-纯化柱中，并进行加压，从而除去杂质；以及，单独将回收液注入核酸分离-纯化柱中，从而使吸附在核酸吸附性多孔膜上的核酸解吸，并且将核酸与回收液一起回收，该装置的特征在于包括：核酸分离-纯化柱；安装机构，用于支撑废液容器和回收容器，该废液容器用于容纳包含水溶性有机溶剂的样品溶液残余物和排出的洗涤液，该回收容器用于容纳包含核酸的回收液；压缩空气供给机构，用于将压缩空气引入到核酸分离-纯化柱中；以及注入机构，用于分别将洗涤液和回收液注入到核酸分离-纯化柱中。
实施例
(1)核酸分离-纯化柱的制备
制备核酸分离-纯化柱，该柱的内径为7mm，并具有用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分。
(2)将通过三醋酸纤维素多孔膜的皂化方法制备的多孔膜用作核酸吸附性多孔膜，并且将其容纳在(1)中制备的核酸分离-纯化柱的容纳部分中。
(3)制备核酸溶解试剂的储备液、洗涤液、回收液和脱氧核糖核酸酶溶液
制备具有以下配方的核酸溶解试剂、洗涤液、回收液和脱氧核糖核酸酶溶液：
(核酸溶解试剂的储备液)
盐酸胍                                     528.4g
(由Wako Pure Chemical Ind.Ltd.生产)
Olfin AK-02                                5.59g
(由Nisshin Chemical Co.生产)
Leodol TWS-120V                            32.95g
(由Kao Corp生产)
乙醇                                       64.8g
(由Wako Pure Chemical Ind.Ltd.生产)
溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)                 22.3g
(由Wako Pure Chemical Ind.Ltd.生产)
蒸馏水                                     575.3g
(洗涤液)
蒸馏水                                     466.8g
1mol/L的tris-盐酸(pH:7.5)                        7.04g
(由Wako Pure Chemical Ind.Ltd.生产)
氯化钠                                           3.95g
(由Wako Pure Chemical Ind.Ltd.生产)
(回收液)
Tris-HCl(pH:6.5)               1mmol/L
(脱氧核糖核酸酶溶液1)
脱氧核糖核酸酶(由Promega Inc.生产)               360μl
脱氧核糖核酸酶缓冲液                             72μl
(由Promega Inc.生产，与脱氧核糖核酸酶一起包装)
蒸馏水                                           288μl
(脱氧核糖核酸酶溶液2)
脱氧核糖核酸酶                                   11.25μl
(由Qiagen Inc.生产)
脱氧核糖核酸酶缓冲液                             315μl
(由Qiagen Inc.生产，与DNase一起包装)
蒸馏水                                           33.75μl
(4)核酸分离纯化操作
[实施例1]
通过以下方式，用在盘溶解法(on-dish)，将海拉细胞株(Helacells)培养为粘着型细胞，得到实施例1的包含水溶性有机溶剂的样品溶液。
在6-孔细胞培养皿上，在37℃下在5％CO2的存在下，在培养液(MEM-10％胎牛血清)中培养海拉细胞株。同时培养的细胞的数量测量为每孔3.12x106个。从细胞培养皿的孔除去培养液并且加入核酸溶解试剂的储备液，以得到细胞溶液。用移液管搅拌细胞溶液并将其回收在另一个容器中。
将516μl的核酸溶解试剂储备液与4μl的2-巯基乙醇一起加入，以得到裂解溶液，将裂解溶液完全加入到包含细胞的容器中并且通过涡流混合器搅拌1分钟。然后加入100μl的99.5体积％乙醇，并用涡流混合器搅拌5秒。然后加入180μl的99.5体积％乙醇以得到最终为35质量％的乙醇浓度，并且用涡流混合器搅拌混合物5秒。
将由此得到的实施例1的样品溶液(包含水溶性有机溶剂)注入到如(1)和(2)中制备核酸分离-纯化柱(容纳有核酸吸附性多孔膜)的开口之一中，然后将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱的内部加压，从而使注入的包含水溶性有机溶剂的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜，并且由此使其接触核酸，以及，从核酸分离-纯化柱的另一个开口排出样品溶液。随后，取下压力差产生装置，然后将500μl的包含浓度为30体积％的乙醇的洗涤液注入到核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱的内部加压，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜并且从另一个开口排出洗涤液。以类似的方式重复这些操作三次。随后，取下压力差产生装置，将100μl的回收液注入到核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于其上述一个开口，用于为其内部加压，由此使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜并且从另一个开口排出回收液，以及，将该溶液回收。
[比较例1]
通过以下方式，用在盘溶解法，将海拉细胞株培养为粘着型细胞，得到比较例1的包含水溶性有机溶剂的样品溶液。
在6-孔细胞培养皿上，在37℃下在5％CO2的存在下，将海拉细胞株在培养液(MEM-10％胎牛血清)中培养。同时培养的细胞的数量测量为每孔3.12x106个。从细胞培养皿的孔除去培养液并且加入核酸溶解试剂的储备液，以得到细胞溶液。用移液管搅拌细胞溶液，并将其回收在另一个容器中。
将350μl的核酸溶解试剂储备液与3.5μl的2-巯基乙醇一起加入，以得到裂解溶液，将裂解溶液完全加入到包含细胞的容器中，并用涡流混合器搅拌1分钟。然后加入350μl的70体积％乙醇并且用涡流混合器搅拌5秒。
在搅拌之后，将得到的溶液注入到如(1)和(2)中制备的核酸分离-纯化柱(容纳有核酸吸附性多孔膜)的开口之一中，然后将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱的内部加压，从而使注入的核酸混合物溶液通过核酸吸附性多孔膜，并且由此使混合物溶液接触膜，以及，从核酸分离-纯化柱的另一个开口排出溶液。随后，取下压力差产生装置，然后将500μl的包含浓度为30体积％的乙醇的洗涤液注入到核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为其内部加压，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出洗涤液。以类似的方式重复这些操作三次。随后，取下压力差产生装置，将100μl的回收液注入到核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于其上述一个开口，用于为其内部加压，由此使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出回收液，以及，将该溶液回收。
[实施例2]
制备人急性早幼粒细胞性白血病细胞(HL60)的培养液。对其进行调节，以得到3x106的细胞计数，并将细胞用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤。在4℃、300G的条件下，使用水平转子离心5分钟，使飘浮细胞沉淀，然后除去上清液，并且通过轻叩将细胞再悬浮。将516μl的核酸溶解试剂储备液与4μl的2-巯基乙醇一起加入，以得到裂解溶液，将裂解溶液完全加入到包含细胞的容器中，并用涡流混合器搅拌1分钟。然后加入100μl的99.5体积％乙醇并且用涡流混合器搅拌5秒。然后加入180μl的99.5体积％乙醇，以得到最终为35质量％的乙醇浓度，并用涡流混合器搅拌混合物5秒。从开始用PBS洗涤细胞到搅拌结束的时间为10分钟。
将由此得到的实施例2的样品溶液(包含水溶性有机溶剂)注入到如(1)和(2)中制备的核酸分离-纯化柱(容纳有核酸吸附性多孔膜)的开口之一中，然后将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱的内部加压，从而使注入的包含水溶性有机溶剂的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜，并且由此使其接触样品溶液，以及，从核酸分离-纯化柱的另一个开口排出样品溶液。随后，取下压力差产生装置，然后将500μl的包含浓度为30体积％的乙醇的洗涤液注入到核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱的内部加压，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出洗涤液。随后，取下压力差产生装置，随后通过核酸分离-纯化柱的该一个开口，将40μl的脱氧核糖核酸酶溶液置于其中的膜上，然后，在5分钟静置之后，将包含浓度为30体积％的乙醇的500μl洗涤液注入核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱内部加压，由此使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出洗涤液。以类似方式再一次重复这些操作。随后，取下压力差产生装置，然后将100μl的回收液注入核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于其上述一个开口，用于为其内部加压，由此使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出回收液，以及，将该溶液回收。实施例2使用脱氧核糖核酸酶溶液1作为脱氧核糖核酸酶溶液操作四次，使用脱氧核糖核酸酶溶液2作为脱氧核糖核酸酶溶液操作四次。
[比较例2]
制备人急性早幼粒细胞性白血病细胞(HL60)的培养液。对其进行调节，以得到3x106的细胞计数，并将细胞用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤。在4℃、300G的条件下，使用水平转子离心5分钟，使飘浮细胞沉淀，然后除去上清液，并且通过轻叩将细胞再悬浮。将350μl的核酸溶解试剂储备液与3.5μl的2-巯基乙醇一起加入，以得到裂解溶液，将裂解溶液完全加入到包含细胞的容器中，并用涡流混合器搅拌1分钟。然后加入350μl的70体积％乙醇并且用涡流混合器搅拌5秒。从开始用PBS洗涤细胞到搅拌结束的时间为10分钟。
在搅拌之后，将得到的溶液注入到如(1)和(2)中制备的核酸分离-纯化柱(容纳有核酸吸附性多孔膜)的开口之一中，然后将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱的内部加压，从而使注入的核酸混合物溶液通过核酸吸附性多孔膜，并且由此使溶液接触膜，以及，从核酸分离-纯化柱的另一个开口排出溶液。随后，取下压力差产生装置，然后将500μl的包含浓度为30体积％的乙醇的洗涤液注入核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱的内部加压，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出洗涤液。随后，取下压力差产生装置，随后，通过核酸分离-纯化柱的该一个开口，将40μl的脱氧核糖核酸酶溶液置于其中的膜上，然后，在5分钟静置之后，将包含浓度为30体积％的乙醇的500μl洗涤液注入到核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱内部加压，由此使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出洗涤液。以类似方式再一次重复这些操作。随后，取下压力差产生装置，然后将100μl的回收液注入到核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于核酸分离-纯化柱的该一个开口，用于为其内部加压，由此使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出回收液，以及，将该溶液回收。比较例2使用脱氧核糖核酸酶溶液1作为脱氧核糖核酸酶溶液操作四次，使用脱氧核糖核酸酶溶液2作为脱氧核糖核酸酶溶液操作四次。
[实施例3]
制备人急性早幼粒细胞性白血病细胞(HL60)的培养液。对其进行调节，以得到5x106的细胞计数，并将细胞用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤。在4℃、300G的条件下，使用水平转子离心5分钟，使飘浮细胞沉淀，然后除去上清液，并且通过轻叩将细胞再悬浮。将516μl的核酸溶解试剂储备液与4μl的2-巯基乙醇一起加入，以得到裂解溶液，将该裂解溶液完全加入到包含细胞的容器中，并用涡流混合器搅拌1分钟。然后加入100μl的99.5体积％乙醇并且用涡流混合器搅拌5秒。然后加入180μl的99.5体积％乙醇，以得到最终为35质量％的乙醇浓度，并用涡流混合器搅拌混合物5秒。
将由此得到的实施例3的样品溶液(包含水溶性有机溶剂)注入到如(1)和(2)中制备的核酸分离-纯化柱(容纳有核酸吸附性多孔膜)的开口之一中，然后将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱的内部加压，从而使注入的包含水溶性有机溶剂的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜，并且由此使其接触样品溶液，以及，从核酸分离-纯化柱的另一个开口排出样品溶液。随后，取下压力差产生装置，然后将500μl的包含浓度为30体积％的乙醇的洗涤液注入到核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱的内部加压，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出洗涤液。以类似的方式重复这些操作三次。随后，取下压力差产生装置，然后将100μl的回收液注入到核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于其上述一个开口，用于为其内部加压，由此使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出回收液，以及，将该溶液回收。
[比较例3]
制备人急性早幼粒细胞性白血病细胞(HL60)的培养液。对其进行调节，以得到5x106的细胞计数，并将细胞用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗涤。在4℃、300G的条件下，使用水平转子离心5分钟，使飘浮细胞沉淀，然后除去上清液，并且通过轻叩将细胞再悬浮。将516μl的核酸溶解试剂储备液与4μl的2-巯基乙醇一起加入，以得到裂解溶液，将裂解溶液完全加入到包含细胞的容器中，并用涡流混合器搅拌1分钟。然后加入280μl的99.5体积％乙醇并且用涡流混合器搅拌5秒。然后用涡流混合器搅拌5秒。
在搅拌之后，将得到的溶液注入到如(1)和(2)中制备的核酸分离-纯化柱(容纳有核酸吸附性多孔膜)的开口之一中，然后将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱的内部加压，从而使注入的包含水溶性有机溶剂的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜，并且由此使该膜接触溶液，以及，从核酸分离-纯化柱的另一个开口排出样品溶液。随后，取下压力差产生装置，然后将500μl的包含浓度为30体积％的乙醇的洗涤液注入到核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于该一个开口，用于为核酸分离-纯化柱的内部加压，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出洗涤液。以类似的方式重复这些操作三次。随后，取下压力差产生装置，然后将100μl的回收液注入核酸分离-纯化柱的该一个开口中，并将压力差产生装置结合于其上述一个开口，用于为其内部加压，由此使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜，并且从另一个开口排出回收液，以及，将该溶液回收。
表1总结了用于每个实施例中的裂解溶液、溶解储备液(核酸溶解试剂的储备液)和包含水溶性有机溶剂的溶液的量。
表1.
Figure S06802305X20070717D000321
(5)裂解溶液的膜-通过时间和回收的核酸量
在每个实施例中，通过在230nm处的吸光度测定在包含所得核酸的回收液中的核酸量。表2总结了所得回收液中的核酸浓度、以及测出的对于裂解溶液所需的膜-通过时间。
表2.
回收的核酸 裂解溶液通过/不通过膜(平均通过时间)
比较例1 在2次试验中没有通过
实施例1 53.5μg 在2次试验中2次通过(48.0秒)
比较例2 28.1μg 在8次试验中8次通过(61.5秒)
实施例2 34.9μg 在2次试验中2次通过(58.9秒)
比较例3 在2次试验中没有通过
实施例3 492.0μg 在2次试验中2次通过(61.0秒)
表1和表2中对实施例1与比较例1的比较以及实施例2与比较例2的比较表明，在采用520μl裂解溶液、另外还加入浓度为99.5体积％的280μl乙醇、并将其作为两个部分加入的情况中，裂解溶液的膜-通过时间变得更短。这些结果表明，本发明的方法允许处理更大量的细胞。换句话说，通过采用更高浓度的乙醇、增加裂解溶液的量和将乙醇分为两部分加入，可以提高可处理的生物材料的上限。此外，实施例3和比较例3的比较表明，与一次加入相比，将99.5体积％的乙醇分为两部分加入可增加可处理的细胞数。
工业实用性
在通过将生物材料中的核酸吸附在固相的表面上、并在洗涤等之后使核酸解吸的分离和纯化核酸方法中，本发明提供这样一种方法，其能够处理更大量生物材料，而不会使得到用于将核酸吸附在固相上的溶液所需的时间延长。
本发明还允许以更低的成本和更容易的方式有选择地从生物材料回收核酸，其利用的多孔膜表现出优异分离效率和令人满意的洗涤效率，能够简单和快速地应用，适合于自动化和小型化，并可以以基本上相同的分离性能大量生产。
在本文中所要求的外国优先权中的每个外国专利申请其全部公开内容以引用方式并入本文，如同将其全部列出一样。

Claims (17)

1.一种用于分离和纯化核酸的方法，包括以下步骤：
(1)向生物材料中加入裂解溶液，以制备包含核酸的样品溶液，以及
向所述样品溶液加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液，从而制备包含水溶性有机溶剂的样品溶液；
(2)使所述包含水溶性有机溶剂的样品溶液与固相接触，从而将核酸吸附在所述固相上；
(3)使洗涤液与所述固相接触，从而在核酸被吸附在所述固相上的状态下，洗涤所述固相；以及
(4)使所述固相与回收液接触，从而使核酸从所述固相解吸，
其中在步骤(1)中，水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少分为两次加入，其特征在于：
在向所述样品溶液加入所述水溶性有机溶剂或所述包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次之后，通过包括摇动、翻转、和旋转移动中至少一种的操作，搅拌所述样品溶液；以及
在搅拌之后，向溶液中进一步加入所述水溶性有机溶剂或所述包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次。
2.一种用于分离和纯化核酸的方法，包括以下步骤：
(1)向生物材料中加入裂解溶液，以制备包含核酸的样品溶液，以及
向所述样品溶液加入水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液，从而制备包含水溶性有机溶剂的样品溶液；
(2)使所述包含水溶性有机溶剂的样品溶液与固相接触，从而将核酸吸附在所述固相上；
(3)使洗涤液与所述固相接触，从而在核酸被吸附在所述固相上的状态下，洗涤所述固相；以及
(4)使所述固相与回收液接触，从而使核酸从所述固相解吸，
其中在步骤(1)中，水溶性有机溶剂或包含水溶性有机溶剂的溶液至少分为两次加入，其特征在于：
在向所述样品溶液加入所述水溶性有机溶剂或所述包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次之后，通过至少包括抽吸和排出溶液的操作，搅拌所述样品溶液，以及
在搅拌之后，向溶液中进一步加入所述水溶性有机溶剂或所述包含水溶性有机溶剂的溶液至少一次。
3.根据权利要求1或2所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，在所述步骤(1)中，所述包含水溶性有机溶剂的样品溶液中，水溶性有机溶剂的浓度在5质量％到90质量％的范围内。
4.根据权利要求1或2所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，在所述步骤(1)中，所述包含水溶性有机溶剂的样品溶液中，水溶性有机溶剂的浓度在10质量％到60质量％的范围内。
5.根据权利要求1或2所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，在所述步骤(1)中，包含水溶性有机溶剂的样品溶液中，水溶性有机溶剂的浓度在20质量％到40质量％的范围内。
6.根据权利要求1或2所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，所述固相是包含有机聚合物的多孔膜，所述有机聚合物通过没有离子键参与的相互作用吸附核酸。
7.根据权利要求6所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中所述有机聚合物具有羟基。
8.根据权利要求6所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，所述多孔膜包括由乙酰值不同的醋酸纤维素混合物经皂化得到的有机材料。
9.根据权利要求6所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，所述多孔膜具有彼此不对称的正面和背面。
10.根据权利要求1或2所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中所述裂解溶液是核酸-溶解剂。
11.根据权利要求1或2所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中所述生物材料是动物组织。
12.根据权利要求10中所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中所述核酸-溶解剂包含离液盐以及选自以下试剂的至少一种：核酸-稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和消泡剂。
13.根据权利要求12中所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中所述离液盐包括选自盐酸胍和硫氰酸胍的至少一种。
14.根据权利要求1或2所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中所述水溶性有机溶剂为选自甲醇、乙醇、丙醇或其异构体以及丁醇或其异构体的至少一种。
15.根据权利要求1或2所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中所述洗涤液为选自甲醇、乙醇、丙醇或其异构体以及丁醇或其异构体的至少一种，所包含的量为20质量％到50质量％。
16.根据权利要求1或2所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中所述洗涤液是包括10mmol/L到1mol/L氯化物的溶液。
17.根据权利要求6所述的用于分离和纯化核酸的方法，
其中，在所述步骤(2)、(3)和(4)中，通过下述装置使所述包含水溶性有机溶剂的样品溶液、所述洗涤液或所述回收液通过所述多孔膜：核酸分离-纯化柱，其在具有至少两个开口的容器内部容纳有多孔元件，溶液可以通过所述多孔元件；以及压力差产生装置，也就是可拆卸地安装在所述核酸分离-纯化柱的所述至少两个开口之一上的泵。
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